BIOSEP12蛋白質(zhì)沉淀法

1、1 概述 定義常用加入試劑的方法，改變?nèi)軇┖腿苜|(zhì)的能量平衡來降低其溶解度，使產(chǎn)物離開溶液生成不溶性顆粒，沉降析出。沉淀具有濃縮與分離的雙重作用。與結(jié)晶聯(lián)系 在本質(zhì)上都是新相析出的過程，主要是物理變化，當(dāng)然也存在化學(xué)反應(yīng)的沉淀或結(jié)晶。區(qū)別結(jié)晶為同類分子或離子以有規(guī)則排列形式析出，沉淀為同類分子或離子以無規(guī)排列形式析出。1 概述 優(yōu)點(diǎn)A、設(shè)備簡單、成本低、放大容易，產(chǎn)物濃度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液體積很快地減小1050倍，從而簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費(fèi)用；C、使中間產(chǎn)物保持在一個中性溫和的環(huán)境；D、及早地將目標(biāo)pro.從其pro.水解酶分離出來，避免pro降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；E、用沉

2、淀法作為pro色譜分離前處理，可使使用色譜分離的限制因素降低到最少。缺點(diǎn)：A、沉淀物可聚集有多種物質(zhì)，如大量鹽類和溶劑，所以沉淀法所產(chǎn)品純度通常都比結(jié)晶法低；B、過濾較困難2 蛋白質(zhì)溶解蛋白質(zhì)溶解：相似者相溶aa的親水性和疏水性：有利因素：親水性，包括氫鍵、極性基團(tuán)、離子化側(cè)鏈、親水a(chǎn)a所占的%等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基團(tuán)、疏水a(chǎn)a所占的%等。如纖維蛋白原。3 蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定因素1)、水化層(hydration shell)tight hydration shell(0.35g water/1g pro)loose hydration shell(2g water /1g

3、 pro)2)、靜電排斥 zeta電勢Nernst Potential膠核表面電位(不可測)Stern Potential(不可測) P o t e n t i a l 滑 面 電 位 ( 可測,mobility) 電位 N e r n s t 電 位 ionic strength3)、|pH水 pI| Value |pH水 pI| Value zeta電勢 水化層 靜電排斥 Tight hydration shellProtein coreLoose hydration shell4 4 蛋白質(zhì)沉淀方法分類1）、鹽析法2）、有機(jī)溶劑沉淀法3）、 |pH水 pI| Value調(diào)節(jié)法4）、親水聚

4、合物沉淀法5）、聚電解質(zhì)絮凝法6）、高價金屬離子沉淀法7）、親和沉淀法5 5 鹽析法機(jī)理：A、zeta potential；B、hydration shell5 5 鹽析法計算: Cohnx經(jīng)驗(yàn)公式式中, S為蛋白質(zhì)的溶解度(g/L)；I為離子強(qiáng)度；m為鹽的摩爾濃度；值為蛋白質(zhì)在純水中(I=0時)的假想溶解度對數(shù)值，是pH值和溫度的函數(shù)，在蛋白質(zhì)pI時最小；Ks為鹽析常數(shù)，與溫度和pH值無關(guān)。5 5 鹽析法方法: A、 “Ks”分級鹽析法：在一定pH值及溫度下，改變鹽濃度（即I）達(dá)到沉淀的目的。B、“”分級鹽析法：在一定I下，改變?nèi)芤旱膒H值及溫度達(dá)到沉淀的目的。C、應(yīng)用：一般的初步分離用第一

5、種方法，進(jìn)一步純化時用第二種方法。5 5 鹽析法影響因素A、無機(jī)鹽種類感膠離子序(Hofmeister序列): In 1888，Hofmeister對一系列鹽沉淀蛋白質(zhì)的能力進(jìn)行了測定研究。陰離子排序?yàn)椋簷幟仕岣?- 酒石酸根3- F- IO-3 H2P O-4 S O-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- CNS-; 對陽離子排序?yàn)椋?Th4+ Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+5 鹽析法結(jié)論：a 不同種類的鹽主要影響Ks；b 離子半徑小，帶電多，電荷密度高，鹽析效果好。無機(jī)鹽的挑選原則： a 較

6、高的鹽析效能；b 高溶解度，能配置高離子強(qiáng)度的鹽溶液；c溶解度受溫度的影響??；d 鹽溶液的密度不高，便于蛋白質(zhì)沉淀和離心分離；e 不易引起蛋白質(zhì)的變性；f價格低廉；最常用(NH4)2SO4。優(yōu)點(diǎn)：符合上述要求；缺點(diǎn)：水解后溶液pH降低，在高 pH下產(chǎn)氨，腐蝕性強(qiáng)，有異味，有毒，終產(chǎn)物必須除盡。次常用Na2SO4。缺點(diǎn)：在400C以下溶解度較低，主要用于熱穩(wěn)定蛋白。5 5 鹽析法B、無機(jī)鹽添加方式5 5 鹽析法C、溫度T主要考慮不能影響主要產(chǎn)物的活力,即在其穩(wěn)定的溫度下鹽析,可通過實(shí)驗(yàn)決定,一般來說,溫度越低,形成沉淀越不易,但也有相反的情況.實(shí)際上,鹽析的溫度范圍較大,所有一般都在常溫下鹽析.

7、5 5 鹽析法D、溶液pHpH影響Cohnx方程中的值。見圖圖有何用？6 等電點(diǎn)沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法中的pH值作用于值而隱含在Cohnx公式中，pI值通常在pH46范圍內(nèi)變化，一般用無機(jī)酸（如鹽酸、磷酸和硫酸）作沉淀劑。在蛋白質(zhì)疏水性比較大和結(jié)合水比較小時這種類型的沉淀更有效。為了提高等電點(diǎn)法的沉淀能力，常將其與鹽析法、有機(jī)溶劑法或其他沉淀法一起使用。最大缺點(diǎn)：無機(jī)酸會引起較大的蛋白質(zhì)不可逆變性的危險。7 有機(jī)溶劑沉淀法 同鹽析一樣，隨著沉淀劑有機(jī)溶機(jī)濃度的上升，蛋白質(zhì)溶解度也呈指數(shù)規(guī)律下降。 式中, So為當(dāng)（K/e2） 0時S的外推值；e為水-有機(jī)溶劑混合物的介電常數(shù)；K為常數(shù)(水的介電常

8、數(shù)的吸收系數(shù))。7 有機(jī)溶劑沉淀法 有機(jī)溶劑的種類：丙酮(首選)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀pro。機(jī)理：A、有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理是加入溶劑后，會使水溶液的介電常數(shù)降低，而使pro分子間的靜電引力（庫侖力）增大，導(dǎo)致凝集和沉淀。B、有機(jī)溶劑使pro溶劑化，使原來與pro結(jié)合的水被溶劑所取代，從而降低了pro溶解度。這種理論不能說明為什么乙醇比丙酮的親水性強(qiáng)，丙酮卻比乙醇沉淀pro的能力強(qiáng)，也解釋不了丙酮、乙醇之類溶劑在所謂脫去pro水膜的過程中容易造成pro變性，而鹽析脫水時不造成pro變性。C、丙酮、乙醇等不僅是pro的沉淀淀劑，而且還是一種變性劑，可見作用有機(jī)溶劑使pro在沉淀

9、和變性之間既有區(qū)別又相關(guān)聯(lián)。7 有機(jī)溶劑沉淀法 影響因素及控制A、T：當(dāng)乙醇與水混合時，會放出大量的稀釋熱，使溶液T顯著升高，對不耐熱的pro影響較大。解決辦法：攪拌、少量多次加入，以避免溫度驟然升高損失pro活力。另一方面溫度還會影響有機(jī)溶劑對pro的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血漿蛋白時，溫度控制在-10C下進(jìn)行。B、乙醇：通常隨乙醇上升，pro溶解度下降。如血纖維蛋白原的最大溶解度在乙醇濃度為8%時達(dá)到最大，而當(dāng)乙醇濃度為40%時達(dá)到最小。C、pH值：在確定了乙醇以后，pro最低溶解度出現(xiàn)在蛋白.的pI處，因此可以通過調(diào)節(jié)pH值來選擇性分離蛋白質(zhì)。D、pro：避免

10、使用很稀的濃度，因pro在高濃度下才較穩(wěn)定。7 有機(jī)溶劑沉淀法優(yōu)點(diǎn)：A、某些蛋白質(zhì)沉淀的濃度范圍相當(dāng)寬，所得產(chǎn)品的純度較高，B、從沉淀的蛋白質(zhì)中除去有機(jī)溶劑很方便，而且有機(jī)溶劑本身可部分地作為蛋白質(zhì)的殺菌劑；缺點(diǎn)：A、耗用大量溶劑，而溶劑來源、貯存都比較困難麻煩；B、且沉淀操作需在低溫下進(jìn)行，使用上有一定的局限性；C、收率也比鹽析法低；D、試劑易燃，有毒。8 非離子型聚合物沉淀法 某些聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，具有沉淀蛋白質(zhì)的作用。其中最常用的是PEG，相對分子質(zhì)量從200D到20KD的不同聚合程度的產(chǎn)品都是有效的，通常在蛋白質(zhì)沉淀中使用PEG-6000

11、或PEG-4000。計算公式：式中，S-溶解度；c-PEG濃度；-常數(shù)，受溶液條件的影響(如pH值和離子強(qiáng)度)；K-常數(shù)，由pro大小和PEG的類型決定。 適應(yīng)條件：上式適用性廣，但在低濃度蛋白質(zhì)，如1.5g/L和高濃度蛋白質(zhì)，如75g/L和150g/L時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會偏離線性。這時方程需校正8. 8. 非離子型聚合物沉淀法 8. 8. 非離子型聚合物沉淀法優(yōu)點(diǎn)：A、體系的溫度只需控制在室溫條件下；B、沉淀的顆粒往往比較大，產(chǎn)物比較容易收集；C、PEG非但不會使pro變性,而且可以提高它的穩(wěn)定性；D、PEG無毒，優(yōu)先使用在臨床產(chǎn)品的加工過程中被。缺點(diǎn)：A、PEG比其他沉淀劑更難從蛋白質(zhì)溶液中除去

12、為此需用超濾和液-液萃取來解決；B、價格較昂貴。 9. 沉淀動力學(xué) 溶解度是一個平衡特性，但是溶解度值的降低是一個動力學(xué)過程。當(dāng)體系變得不穩(wěn)定以后，分子互相碰撞并產(chǎn)生聚集作用。通常認(rèn)為相互碰撞由下面幾種運(yùn)動引起：A、熱運(yùn)動（Brownian運(yùn)動）；B、對流運(yùn)動，由機(jī)械攪拌產(chǎn)生；C、差示沉降，由顆粒自由沉降速度不同造成的。第A、B兩種機(jī)理在蛋白質(zhì)沉淀中起主導(dǎo)作用，第種機(jī)理在沉降過程中起主導(dǎo)作用(如在廢水處理中)。異向聚集：由Brownian運(yùn)動所造成的碰撞導(dǎo)致。同向聚集：而由對流運(yùn)動所造成的碰撞導(dǎo)致。9. 沉淀動力學(xué) 沉淀過程步驟：A、初始混合，蛋白質(zhì)溶液與沉淀劑在強(qiáng)烈攪拌下混合；B、晶核生成，

13、新相形成，產(chǎn)生極小的初始固體微粒；C、擴(kuò)散限制生長，晶核在Brownian擴(kuò)散作用下生長，生成亞微米大小的核，這一步速度很快；D、流動引起的生長，這些核通過對流傳遞（攪拌）引起的碰撞進(jìn)一步生長，產(chǎn)生絮體或較大的聚集體，這一步是在較低的速度下進(jìn)行的。E、絮體的破碎，破碎取決于它們的大小、密度和機(jī)械阻力。F、聚集體的陳化，在陳化過程中，絮體聚得大小和阻力平衡。 10 Applications早在50年前，Edwin Cohnx及其合作者就是用乙醇來完成蛋白質(zhì)沉淀經(jīng)典實(shí)驗(yàn)的。他們應(yīng)用低溫乙醇分級沉淀人血漿的辦法制備了白蛋白溶液，并通過冷凍干燥將乙醇從成品中去除，所得產(chǎn)品成功地救治了1941年珍珠港空

14、襲后的幸存者。除此以外，免疫球蛋白、血纖維蛋白原等其他許多蛋白質(zhì)都是利用上述方法進(jìn)行沉淀的。1 概述 優(yōu)點(diǎn)A、設(shè)備簡單、成本低、放大容易，產(chǎn)物濃度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液體積很快地減小1050倍，從而簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費(fèi)用；C、使中間產(chǎn)物保持在一個中性溫和的環(huán)境；D、及早地將目標(biāo)pro.從其pro.水解酶分離出來，避免pro降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；E、用沉淀法作為pro色譜分離前處理，可使使用色譜分離的限制因素降低到最少。缺點(diǎn)：A、沉淀物可聚集有多種物質(zhì)，如大量鹽類和溶劑，所以沉淀法所產(chǎn)品純度通常都比結(jié)晶法低；B、過濾較困難5 鹽析法結(jié)論：a 不同種類的鹽主要影響Ks；b 離子

15、半徑小，帶電多，電荷密度高，鹽析效果好。無機(jī)鹽的挑選原則： a 較高的鹽析效能；b 高溶解度，能配置高離子強(qiáng)度的鹽溶液；c溶解度受溫度的影響??；d 鹽溶液的密度不高，便于蛋白質(zhì)沉淀和離心分離；e 不易引起蛋白質(zhì)的變性；f價格低廉；最常用(NH4)2SO4。優(yōu)點(diǎn)：符合上述要求；缺點(diǎn)：水解后溶液pH降低，在高 pH下產(chǎn)氨，腐蝕性強(qiáng)，有異味，有毒，終產(chǎn)物必須除盡。次常用Na2SO4。缺點(diǎn)：在400C以下溶解度較低，主要用于熱穩(wěn)定蛋白。7 有機(jī)溶劑沉淀法 有機(jī)溶劑的種類：丙酮(首選)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀pro。機(jī)理：A、有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理是加入溶劑后，會使水溶液的介電常數(shù)降低，而使pro分子間的靜電引力（庫侖力）增大，導(dǎo)致凝集和沉淀。B、有機(jī)溶劑使pro溶劑化，使原來與pro結(jié)合的水被溶劑所取代，從而降低了pro溶解度。這種理論不能說明為什么乙醇比丙酮的親水性強(qiáng)，丙酮卻比乙醇沉淀pro的能力強(qiáng)，也解釋不了丙酮、乙醇之類溶劑在所謂脫去pro水膜的過程中容易造成pro變性，而鹽析脫水時不造成pro