牛奶β-乳球蛋白茶多酚復合物

1、牛奶-乳球蛋白茶多酚復合物關鍵字牛奶， 茶， 多酚 ，-乳球蛋白，次級結構，紅外光譜，CD光盤，熒光光譜，建模思想摘要牛奶中茶多酚的抗氧化能力的影響尚未完全認識。茶多酚和牛奶蛋白的混合物可以改變茶化合物的抗氧化能力和蛋白質的次級結構。本次研究是為了在分子水平上，采用紅外光譜，CD和熒光光譜法以及分子建模測試含有茶多酚的-乳球蛋白，C，EC,ECG,EGCG的互相作用。多酚結合模式，結合常數和多酚絡合物在-LG穩(wěn)定性的影響和次級結構由此決定。結構分析表明，多酚結合-LG通過親水性和疏水性作用與全部的結合常數 KC-LG = 2.2 (±0.8) _ 103 M_1, KEC-LG =

2、3.2 (±1) _ 103 M_1, KECG-LG = 1.1(±0.6) _ 104 M_1 nd KEGCG-LG = 1.3 (±0.8) _ 104 M_1.每個蛋白分子結合的多酚數是1.1 (C), 0.9 (EC), 0.9 (ECG) nd 1.3 (EGCG).分子模擬展示的是幾個氨基酸殘基在附有擴展的氫鍵網絡結構的多酚-蛋白質絡合物的參與。多酚類物質的存在和-螺旋指導蛋白質結構的穩(wěn)定性改變-LG構象。這些數據可以被用來解釋茶化合物的抗氧化活性是被牛奶的添加量所影響的機制。1簡介 -乳球蛋白（ - LG ） （計劃1） ，是最豐富的蛋白質乳清（

3、1克/升）和食品工業(yè)上的主要利潤，這是由于它的營養(yǎng)和功能上的價值。這種蛋白質的結構是眾所周知的。在中性pH條件下，-LG是以單體和二聚體的混合物形式存在的，其中平衡比率取決于二聚體常量和蛋白質濃度的結合度。每個單體由162個氨基酸殘基組成，分子量為18kD。-LG是一個由八個反平行的-stnds和一個位于-rrel表面外部的-螺旋組成的折疊成花萼狀的小型球狀蛋白。-LG對于親水性和疏水性化合物展示出很強的親和力，包括脂肪酸，磷脂和芳香族化合物。茶是世界上最流行的飲料之一。近年來，已經有很多關于加牛奶到茶中是否有益健康的說法。牛奶中茶多酚的抗氧化能力作用一直是爭論的話題，牛奶中關于不同茶多酚的抗

4、氧化活性的雙重影響最近被報道。然而，被牛奶影響的茶化合物的抗氧化活性的機理仍然未知。在最近的報道中，帶有-,-酪蛋白的茶多酚的混合物被研究，這種蛋白質二級結構的相互作用的影響和茶多酚的抗氧化能力被確定。植物多酚類化合物與球狀蛋白顯示了強烈的相互作用，可以導致蛋白質展開。在解決方案中，如兒茶素中的茶多酚可以與牛奶形成不溶性復合物。多酚與蛋白質的親和力程度是與其大小有關的，隨著分子的型號而增加。較大的多酚類似在紅茶中的那些很有可能與牛奶蛋白形成配合物。這種結合通過減少可利用羥基的數目可以影響兒茶素的電子給與能力。以往的研究表明了牛奶蛋白關于茶多酚抗氧化的影響，而并未解決多酚混合物中牛奶蛋白的穩(wěn)定性

5、和構象的影響。因此，牛奶蛋白和多酚之間的相互作用的結構特征是在闡明多酚關于牛奶蛋白結構和茶化合物抗氧化活性的誘導影響的重大階段。熒光猝滅被視為一種測量親和力的技術。熒光猝滅是通過各種分子與猝滅分子的相互作用從熒光誘導作用的熒光量子產率的降低。因此，可以用色氨酸-61和色氨酸19在-LG上的內在色氨酸熒光技術猝火，作為一種研究多酚和-LG為了表征兒茶素-蛋白絡合物的特性的相互作用的工具。我們現(xiàn)在列舉出光譜分析和帶有茶多酚兒茶素，兒茶素，表兒茶素沒食子酸在水溶液的生理條件下使用蛋白濃度常數和各種多酚含量的-LG的相互作用的對接研究。結構分析有關兒茶素結合模式和兒茶素-蛋白絡合物在-LG穩(wěn)定性和次級

6、結構的影響在此有報道。2材料和方法2.1 材料-乳球白素（一個變體，純度>90%）和茶兒茶素從西格瑪-阿爾德里奇公司購買然后用于提供原料。其他化學試劑均為試劑級并且使用時無需進一步凈化2.2母液的制備 -乳球蛋白溶解在水溶液中（ 9毫克/毫升獲得0.5毫米的蛋白質含量） ，含10毫米TRIS “ HCl緩沖（ pH值7.4 ） 。準備在TRIS “鹽酸多酚2毫米，并稀釋至TRIS “鹽酸不同濃度（ 1，0.5和0.25毫米） 。這種蛋白質分光光度計使用濃度的測定17,600 M 1厘米1 （ MW = 18 KD）的消光系數280 nm處。2.3紅外光譜測定紅外光譜記錄在紅外光譜儀（尼可

7、萊6700），配備硫酸鹽探測器設備（DTGS）和使用硒化鋅窗口的溴化氫分束器。多酚溶液加入到帶有持續(xù)攪拌保證形成均勻溶液并且達到多酚溶液濃度，0.125,0.25和0.5毫米并且附有最終蛋白濃度0.25毫米的蛋白質溶液。光譜室在-乳球蛋白在多酚溶液室溫下孵化兩小時后收集的，利用水和電影干涉積累了光譜范圍4000 “600 cm - 1處與一個2厘米的1和100次的標稱分辨率。 “差光譜 （蛋白質溶液+多酚的解決方案） （蛋白質溶液） ，使用水的組合模式產生約2300 cm - 1處，作為標準（ Dousseu ， Therrien ， Pezolet1989年）。生產差光譜時，這個頻段調整基線

8、水平，以正?；罟庾V。2.4蛋白質構成分析 關于 -乳球蛋白的二級結構和它的多酚復合物的分析是在已經報道過的程序(yler & Susi, 1986)的基礎上提出的。蛋白質的二級結構是由I帶酰胺的形狀確定的，位于16601650 cm¹。紅外光譜是平滑的，并且他們的基準是使用內置的分光光度計(OMNIC ver. 7.3)軟件自動矯正的，因此每頻譜噪聲的均方根是用在光譜區(qū)域17201575 cm¹的二階導數這種方式計算的。 -乳球蛋白和復合物的五個主要峰解決了。以上光譜區(qū)是用曲線擬合方法，采用Levenerg- Mrqudt算法卷積的，并且，對應-螺旋峰(16571

9、651 cm¹)， -表(16341608 cm¹),轉(16701667 cm¹)和 -反平行(16911686 cm¹)的峰也被調整了，同時面積是用高斯函數測量的。分配到給定構像的所有的組件帶面積隨后被概括并被總面積除。曲線擬合分析是使用銀河工業(yè)公司的克/ I版7.01 軟件進行的。2.5圓二色譜 -乳球蛋白和多酚復合物的CD光譜是由Jsco J-720 spectropolrimeter記錄的，對于在遠紫外區(qū)（178-260納米）的測量，各路徑長度為0.01厘米的石英細胞在氮氣中被使用。對于每個不同多酚濃度（0.125，0.25和0.5毫米），蛋白

10、質濃度保持恒定（12.5 LM）。以掃描速度為每分鐘50納米的五次掃描的累加起到了作用并且從260至180納米的每個納米的數據都被收集起來。使用連接到水套的石英比色皿的NESL RTE- 111循環(huán)水浴，能夠使樣品溫度保持在25 ° C。光譜用緩沖信號矯正并且分子CD（德）轉換用JSCO標準分析軟件操作。蛋白質二級結構的計算使用CDSSTR，它是通過同CD光譜比較來計算二級結構的不同分配的，它的測量是使用提供高品質的X -射線衍射數據的不同的蛋白質(Johnson, 1999; Sreerm & Woddy, 2000)。CDSSTR程序可由網站http:/lmr.colos

11、/sreerm/CDPro上的軟件包提供。2.6熒光光譜 熒光實驗是在Perkin - Elmer S55光譜儀上展開的。多酚1毫米的儲存溶液需要在室溫(24 ± 1 _C)的條件下進行準備，多酚（20鈥LM）的各種溶液要用以上的同樣是在室溫下連續(xù)稀釋的儲存溶液來準備。在10毫米的Tris - HCl（pH值7.4）下的 -乳球蛋白（200 LV）的溶液也要在室溫（24 ± 1 _C）下進行準備。以上的溶液先保留到以后使用。包含0.4毫升上面的蛋白質溶液的樣本和各種多酚溶液混合以得到最終多酚濃度為10-200 LV的常數 - LG含量為100 LV的溶液。熒光

12、光譜是在kexc=280 nm和凱米從290到500 nm下被記錄的。根據以往的文獻報道，要在340 nm（色氨酸）的強度來計算的結合常數（K）。(i et l., 2004; Dufour & Dngles, 2005; Heet l., 2005; Tng, Qi, & Chen, 2005).2.7對接研究 對接研究是用rgusL4.0.1軟件進行操作的(Mrk . Thompson, Plnri Softwre LLC, Settle, W,). - LG結構是從文獻(Qin et l., 1998)中獲得的并且多酚的三維結構產生于

13、使用Chem3D超6.0的PM3半經驗計算。整個蛋白質被選中作為一個潛在的結合位點，這是因為沒有事先了解的此類位點可以利用。對接運行是在使用定期精度最高的1000候選人構成的阿古斯塢對接發(fā)動機上運行的。構象使用華擎打分函數進行了排名，它估計了自由結合能量。在潛在結合位點的位置上，使用一個陡峭的體面對?？康膹碗s構型進行優(yōu)化，直到收斂算法，最多20次迭代為止。氨基酸殘基在相對多酚3.5的距離內參與絡合3.結果和討論3.1多酚-LG絡合物的紅外光譜多酚- -乳球蛋白絡合以紅外光譜和它的衍生方法為特征。由于沒有主要光譜在多酚的相互作用后在1660 cm ¹(minly CO stretch)

14、的蛋白質酰胺I帶的和在1530 cm¹(CN stretching coupled with NH ending modes)(euchemin et l., 2007; Krimm & ndekr, 1986)的酰胺II帶轉移，得到差光譜（蛋白質溶液+多酚的溶液）_（蛋白質溶液），以監(jiān)測這些振動強度的變化，結果如圖Fig. 1。同樣地，由二階導數的分辨率增強和曲線擬合程序(yler & Susi, 1986)而來的紅外自去卷積，用于確定蛋白質二級結構中存在的茶多酚(Fig. 2 nd Tle 1)。 在低濃度茶多酚(0.125 mM),強度的增加被用于觀察在1660

15、cm ¹處的蛋白質酰胺I和1530 cm ¹處的酰胺II，即多酚鈥揵 - LG復合物的差光譜(Fig. 1, diffs., 0.125 mM)。積極的特點是位于在多酚- - LG電子復合物在1661,1516 (C-LG), 1650, 1514 (EC-LG), 1631, 1536 (ECG-LG)和在1630, 1538 cm¹ (EGCG-LG)時的酰胺I和II頻段的差異譜。同樣，在多酚 - 蛋白質復合物的差異譜中在16281608 cm¹時的積極的廣泛的功能，來自于在1628 cm¹時與蛋白表組件(Fig. 1, diff., 0.

16、125 mM)有關帶的強度的大幅增加。這些積極的功能與經多酚 - 蛋白質絡合酰胺I帶和酰胺II帶強度的增加有關。酰胺I帶和酰胺II帶強度的增加是由于由于多酚結合蛋白質C O，C- N和N - H組(hydrophilic interction)。除此之外的證據來支持C-N,N-H組多酚相互作用來自于蛋白質酰胺帶在3300厘米分之一的轉換。在-LG 3290-3280厘米分之一自由基下，在多酚相互作用下。由于多酚濃度增加至0.5mm，增加蛋白質酰胺的強度，我觀察酰胺II帶在差光譜中的積極功能酰胺I和II頻段在1665，1513（C - - LG），1654，1515（EC- 1 - LG），16

17、30，1540（心電圖， - LG），并在16301532厘米（EGCG - LG）后多酚絡合“（圖1，差異，0.5MM）。 “在光譜的酰胺I帶的強度進一步增加建議多酚- - LG電子的復合物增加親蛋白 -螺旋和 -板結構，濃度高的多酚trtions。類似的紅外光譜變化對蛋白質的觀察在幾個配體 - 蛋白質復合物，其中主要的酰胺I帶蛋白質構象發(fā)生變化（艾哈邁德Oumeur等，2006）。一個蛋白質二級結構的定量分析 自由的 - LG和多酚加合物水合 進行，結果如圖。 2和表1。 - LG具有重大的 -片狀含量51（1633，1618）， - helix11 12（1653厘米），關閉19（166

18、8厘米）和 -反平行的231 （1687厘米）（圖2和表1）。這些數據是一致的 以前 - LG光譜研究報告（QL等。 1997年）。多酚的互動，大幅增加的 -表后 觀察和輕微增加了一個螺旋，后多酚 - LG絡合（見表1）。構象變化O - 服務是ECG和EGCG明顯比C和EC 復合物（Thisisindictiveoflrgerpertur Fig.2ndTle1）。 蛋白質二級結構的tions lrgernd力量polyphe nols。這也是一致的，額外的穩(wěn)定性后， - LG 多酚的相互作用 3.2。 CD光譜 CD光譜也可用于分析蛋白質的構象 mtion的多酚- - LG電子的復合物和結果

19、 表2所示。裁談會的結果表現(xiàn)出顯著的相似之處 這些紅外線數據（見表2）。蛋白質構象 基于光盤的數據分析表明，自由的 - LG有一個螺旋 12，表 - 50，關閉12和26（見表2），consis無規(guī)卷曲 帳篷與文獻的報告（梁，Tjmir Rihi，Suirde， 2008; QL等，1997）。多酚的互動，增加后 從50（游離蛋白）54-57的 -表和一個螺旋，從 12（游離蛋白）13-14，在多酚 - LG復合 （見表2）。增加的 -螺旋和 -表結構 伴隨著從26減少到19無規(guī)卷曲 - 14后，多酚絡合（見表2）。在增加的 - 表內容和螺旋和無規(guī)卷曲減少印度 在茶葉存在的蛋白質結構穩(wěn)定tiv

20、e聚 酚類，這是符合我們的紅外分析（表1 和2）。窗體頂端3.3。疏水相互作用蛋白質CH2的反對稱和光譜的變化在3000-1地區(qū)的對稱伸縮振動2800厘米監(jiān)測，以便找到存在hydrophoiccontctinthepolyphenol- - lctogloulincomplexes。免費的 -乳球蛋白的CH2樂隊在2945，2917，2895 nd112833厘米shiftedto2946，2912nd2897cm（C - - LG），to2943，12915，2893和2835厘米（EC- - LG），2946，2919，2897 nd112835厘米（心電圖， - LG），2947，291

21、9，2897和2835厘米圖5。情節(jié)的日志功能多酚計算的日志（F0F）/ F（EGCG- - LG），后多酚絡合（圖3）。具有約束力的轉移數（n）在多酚- - LG復合物。蛋白質反對稱和對稱收縮振動中CH2的轉移，表明疏水相互作用通過聚苯酚環(huán)和疏水包在-LG電子上存在的，這與接下來討論的熒光光譜結果是一致的。3.4熒光光譜和多酚-酪蛋白的穩(wěn)定性 -乳球蛋白有兩個TRP - 19和色氨酸，色氨酸殘基61。 TRP - 19是在非極性的環(huán)境，并有助于80總熒光，而TRP - 61是部分暴露在水溶劑色氨酸熒光（梁等有輕微的貢獻。2008年）。當其他分子的相互作用與 - LG ，色氨酸熒光可能會改變取

22、決于這種互動的影響蛋白質的構象（ Lkowicz ，1999;等。 Tyeh 2009年） 。在假設有實質性的結合位點（N）（二），蛋白（ Q）的淬淬火反應可如下：nQ t () Qn結合常數K，可以計算為：這里，Q和分別是粗滅劑和蛋白濃度，Qn是非熒光熒光猝火復合物的濃度并且給予了全部的蛋白濃度：熒光濃度和蛋白濃度成正比的，描述為：原因是熒光測量可以被用來估計多酚蛋白復合物的結合常數合適的熒光分數可以通過修改STEM-VOLMER方程計算在這里，F(xiàn)0是最初的熒光強度，F(xiàn)是猝火劑中的熒光強度。鉀是方程的猝滅常數，Q是猝火劑的摩爾濃度，f是可用熒光到極猝火劑的分數，表明了總排放量對于使用疏水劑的

23、相互作用的熒光貢獻分數。F0/ （F0- F)與1的結果是產量為1的攔截軸和（fk）1斜坡的比。因此，協(xié)調的比例和邊坡給出了K。減少了熒光強度的-lg是監(jiān)測在340納米的多酚-lg系統(tǒng)（圖4D代表結果為每個系統(tǒng)）。F0/ （F0- F)與1的結果多酚（ 圖40是顯示代表地塊）如圖4所示。假設從多酚類物質和蛋白質之間的相互作用來觀察熒光的變化，淬火可常被作為結合常數的復雜形式。在多酚-lg系統(tǒng)中，給出K值平均為three-replicte，每個運行涉及幾個不同濃度的多酚。KC-LG = 2.2(±0.8) 103 M1, KEC-LG = 3.2 (±1) 103 M1, K

24、ECG-LG = 1.1(±0.6) 104 M1 nd KEGCG-LG = 1.3 (±0.8) 104 M(圖 40D0表 3). 結合常數計算的多酚-lg表明低親和力多酚與-lg互動，比對其他強大的配體蛋白復雜。(Krgh-Hnsen,1990; Krtochwil, Huer, Muller, Knsy, & Gerer, 2002; Nsoukpoé-Kossi et l., 2007)。然而，類似的結合常數（103104 M-1）也報告了幾個配體蛋白質復合物用熒光光譜的方法(i et l., 2004; Ling et l., 2008; S

25、ulkowsk, 2002)。結合常數較大的多酚-lg復合體比那些較小的多酚-lg復合體大，這可能是由于存在更多的OH集團和大分子的多酚。 多酚約束每個蛋白質的量的計算是從表(F0 F)/F = logKS + n log【多酚】的靜態(tài)淬火中得出的。(Chronneu & Tjmir-Rihi, 2010; Froehlich,Jennings, Sedght-Herti, & Tjmir-Rihi, 2009; Jing, Go, & He,2002; Jing et l., 2004; Ling et l., 2008; Mndeville &Tjmir-R

26、ihi, 2010)。從圖五的直線斜率的得出的值是-lg多酚復合物1.1 1.1 (C), 0.9 (EC),0.90 (ECG), 1.3 (EGCG)（圖5，表3）。包含多酚-lg復合物的F值顯示茶多酚與熒光可通過疏水性和親水性相互作用。因此，我們預測，多酚結合的熒光主要位于內-lg。這爭論是基于事實的trp-214排放系數（白蛋白）和trp-212（牛血清白蛋白）是340納米，這是發(fā)射區(qū)隱色氨酸分子，而由于溶劑弛豫熒光發(fā)射暴露色氨酸分子是在更高的波長（350nm）(ourss, Knkis, Trntilis,Polissiou, & Tjmir-Rihi, 2010; Ling et l., 2008; Sulkowsk,2002; Tyeh et l., 2009)。緊縮的蛋白質結構通過分子的相互作用，如氫鍵在更疏水環(huán)境中可隱藏色氨酸。色氨酸的熒光強度的變化在-lg在中存在的多酚表現(xiàn)出不同模式。在茶多酚里，兒茶素、表兒茶素沒食子酸配合發(fā)射帶的自由蛋白質在340納米（-lg）轉為較低的波長為335納米