RNA干擾抗乙肝病毒

1、摘要 1.RNA感染嚴重影響公眾健康。 2.通過RNA干擾活化劑可使核酸安全持續(xù)地沉默，從而治療慢性HBV感染 3.合成的短鏈干擾RNAs可以通過非病毒載體在胞質(zhì)中傳遞到合適的位點，從而實現(xiàn)基因沉默。 4.雖然這種技術(shù)已取得令人矚目的成就，但實現(xiàn)其臨床應(yīng)用還面臨挑戰(zhàn)。引言 世界衛(wèi)生組織估計世界已經(jīng)有20億人感染了乙肝病毒，其中3億5000萬人已經(jīng)發(fā)展為慢性，持續(xù)的感染增加了肝細胞癌和肝硬化的風險。肝細胞癌在世界上最常見癌癥中排行第六，并且在導(dǎo)致死亡的癌癥中排行第四。 乙肝疫苗對于慢性攜帶者在預(yù)防感染和肝細胞癌方面卻幾乎沒有任何治療效果。 可行的HBV治療方案包括核苷類似物和免疫調(diào)節(jié)劑，但是也僅

2、有有限的功效，并且代價很高，包括相關(guān)的副作用和耐藥性發(fā)生。 通過RNA干擾的途徑來抑制感染的方法依然占據(jù)主導(dǎo)地位乙肝病毒基因結(jié)構(gòu) 乙肝病毒的基因組包含部分開環(huán)的雙鏈DNA(rcDNA),該核酸被衣殼包裹，同時被具有傳染性的乙肝病毒顆粒所包裹。 負鏈DNA大約有3.2KB長，該鏈包含了整個HBV的基因組。 正短鏈DNA更短并且在長度上更具有可變性。正鏈位于5和3負鏈的末端以維持rcDNA的圓形結(jié)構(gòu)。 肝細胞感染后rcDNA被釋放，同時在胞核被修復(fù)以形成共價閉合環(huán)狀DNA，它也作為模板轉(zhuǎn)錄乙型肝炎病毒的RNA。 共價閉合環(huán)狀DNA的四重疊ORFs能編碼產(chǎn)生七種病毒蛋白。其中包括表面蛋白、酶、核心和

3、e抗原。四種病毒激活子和兩個增強調(diào)控序列，大于3.5Kb基因組長度的前基因組RNA以及2.4kb、2.1kb和0.9kb亞基因組mRNA的生成。 前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致乙型肝炎病毒的基因組rcRNA形成。RNAi機制 RNAi的機制是高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，它被雙鏈RNA觸發(fā)，由22個核苷酸序列構(gòu)成的小分子核苷酸。 RNA聚合酶II促進因子初始小分子RNA前體小分子RNA加帽RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物在5端熱力學穩(wěn)定性很差，故被選擇為成熟miRNA的向?qū)А?miRNA向?qū)cmRNA3端未翻譯區(qū)域結(jié)合實現(xiàn)基因沉默。即與同源靶向mRNA之間完整互補，從而使mRNA降解。外源

4、性RNA干擾活化劑 合成的小片段RNA是由21-25核苷酸長并帶有特征性的2個核苷酸3末端的雙鏈組成。 這些合成的siRNA有效的表達抗病毒序列使乙肝病毒在體內(nèi)外的復(fù)制沉默，從而達到治療慢性乙肝病毒感染的目的。 為了能有效的在肝細胞內(nèi)表達，表達基因盒通常合并為重組病毒載體，而siRNA通常使用合成物或非病毒載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)?？挂腋尾《綬NA干擾藥物的開發(fā)階段 首先要解決RNAi能否有效的釋放到已經(jīng)被乙肝病毒感染的肝細胞內(nèi)，其次是實現(xiàn)持續(xù)的病毒復(fù)制沉默。 分析評估療效通常使用分步法，包括有效的選擇抗HBV活化劑，融合于一個合適的載體里，同時測量抗病毒活性以及描述非目標效應(yīng)。RNA干擾活化劑的優(yōu)化 首先

5、需要考慮的是有效性和安全性 避免錯誤的細胞內(nèi)mRNA的沉默 確定有效沉默所需要的最低濃度 防止病毒逃逸藥物 同時減少源于先天免疫應(yīng)答誘導(dǎo)以及細胞內(nèi)mRNA錯誤沉默所造成的毒性。人工合成RNAi活化劑 首選方法是使用位于子區(qū)域的核苷酸的化學修飾 引導(dǎo)化學合成的小干擾RNA進入細胞內(nèi)涵體，這些siRNA常被視為異己，從而導(dǎo)致先天免疫應(yīng)答的激活。表達RNAi活化劑 理想情況下，表達的活化劑應(yīng)該是專門針對乙肝病毒的，因此應(yīng)該有一個偏移以利于誘導(dǎo)引導(dǎo)鏈 抗乙肝shRNA盒的另一種途徑涉及到前體miRNA往返序列的利用。由于它經(jīng)常出現(xiàn)多順反子，使往返序列多聚化，因此可以同步沉默多個目標HBV。病毒復(fù)制模型

6、中RNAi激活劑的功效和毒性測試 乙肝病毒復(fù)制模型的一個重要缺點是它們不模擬乙肝病毒生命周期自然初始感染步驟。 模型中的復(fù)制只是暫時的，并且這個過程本身就有肝毒性。 液體注射和轉(zhuǎn)基因小鼠模型的一個重要限制是CCCDNA不在這些動物肝細胞中形成。 鴨乙肝病毒和土撥鼠肝炎病毒與HBV高度相似，故也已被用來模擬人類乙肝病毒感染。 黑猩猩可能適合RNAi激活劑藥物的療效評估，但也有很大局限性提供乙肝病毒載體的RNA干擾活化劑 載體能夠高效安全的轉(zhuǎn)導(dǎo)抗病毒藥物，并且適合大規(guī)模制備，并且可以實現(xiàn)重復(fù)給藥。 包括病毒載體和非病毒載體病毒載體 重組腺病毒：具有天然的肝臟親和性，能夠?qū)崿F(xiàn)外源性基因在體內(nèi)持久的表

7、達。 聚乙二醇化的重組腺病毒載體中的聚乙二醇由于減弱了免疫刺激和肝毒性，同時改進了重復(fù)給藥后的沉默，故以成為主流基因治療載體。 重組慢病毒載體也可用于RNAi抗乙肝病毒治療，優(yōu)點： 在細胞周期G1階段感染增強 前病毒DNA穩(wěn)定整合使RNAi表達延長 慢病毒載體能夠?qū)崿F(xiàn)體外肝細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，優(yōu)勢： 選擇性肝細胞修飾 消除免疫刺激導(dǎo)致的抗原呈遞細胞載體轉(zhuǎn)導(dǎo) 減弱有系統(tǒng)的全身給藥所帶來的全身毒性或炎癥反應(yīng)。 面臨的問題： 如何獲得足夠的移植細胞以供轉(zhuǎn)導(dǎo) 乙肝病毒耐藥肝細胞的選擇優(yōu)勢 實現(xiàn)長期轉(zhuǎn)基因治療的表達 避免插入突變 避免植入轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細胞具有的潛在致癌性非病毒載體 包括陽離子脂質(zhì)核酸復(fù)合物，脂質(zhì)，核酸

8、聚合物以及修飾的脂質(zhì)復(fù)合物 NVVs能被濃縮以及中和核酸的負電荷以形成統(tǒng)一的直徑小于100納米的小顆粒，從而有利于與有窗孔的肝毛細管交聯(lián)。 siRNA有效負載的保護和避免與宿主蛋白的相互作用是其優(yōu)點。 優(yōu)勢： 能夠被化學修飾 可以實現(xiàn)大規(guī)模的合成 與siRNA能夠良好的兼容 免疫原性可以隨著配方的不同而變化結(jié)論 以RNAi為基礎(chǔ)的抗HBV藥物尚未達到臨床測試的階段。 RNAi有效和特異性HBV復(fù)制比例通常大于90%，對于治療以足夠，但由合成間接siRNA RNAi激活劑造成短暫的失效需要重復(fù)給藥。 抗病毒沉默的脫靶效應(yīng)引起潛在的副作用 免疫刺激作用和錯誤的細胞信使RNA沉默也是急需解決的問題

9、合成和表達的RNAi活化劑的劑量調(diào)節(jié)仍然是個難題。 帶有固有缺陷的替代模型的使用不能完全模擬HBV感染的人體乙肝病毒基因結(jié)構(gòu) 乙肝病毒的基因組包含部分開環(huán)的雙鏈DNA(rcDNA),該核酸被衣殼包裹，同時被具有傳染性的乙肝病毒顆粒所包裹。 負鏈DNA大約有3.2KB長，該鏈包含了整個HBV的基因組。 正短鏈DNA更短并且在長度上更具有可變性。正鏈位于5和3負鏈的末端以維持rcDNA的圓形結(jié)構(gòu)。表達RNAi活化劑 理想情況下，表達的活化劑應(yīng)該是專門針對乙肝病毒的，因此應(yīng)該有一個偏移以利于誘導(dǎo)引導(dǎo)鏈 抗乙肝shRNA盒的另一種途徑涉及到前體miRNA往返序列的利用。由于它經(jīng)常出現(xiàn)多順反子，使往返序列多聚化，因此可以同步沉默多個目標HBV。提供乙肝病毒載體的RNA干擾活化劑 載體能夠高效安全的轉(zhuǎn)導(dǎo)抗病毒藥物，并且適合大規(guī)模制備，并且可以實現(xiàn)重復(fù)給藥。 包括病毒載體和非病毒載體 優(yōu)勢：