酶工程_07-非水相酶催化反應(yīng)-2012

1、T人類認(rèn)識的進(jìn)步T長期以來，人們認(rèn)為酶只能在水相中進(jìn)行催化，而有關(guān)長期以來，人們認(rèn)為酶只能在水相中進(jìn)行催化，而有關(guān)酶的催化理論是基于酶在水溶液中催化反應(yīng)建立起來的酶的催化理論是基于酶在水溶液中催化反應(yīng)建立起來的T傳統(tǒng)的酶學(xué)理論認(rèn)為，有機(jī)溶劑是酶的變性劑、失活劑，傳統(tǒng)的酶學(xué)理論認(rèn)為，有機(jī)溶劑是酶的變性劑、失活劑，酶在非水相中不具有催化能力酶在非水相中不具有催化能力T20 世紀(jì)初，世紀(jì)初，Bourquelot 等人將乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑加等人將乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑加入到酶的水溶液中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)含水量很高時，酶仍具有一入到酶的水溶液中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)含水量很高時，酶仍具有一定催化活力，但比水相中低很多定催化活力

2、，但比水相中低很多T1936 年，波蘭的年，波蘭的 Sym 報道了酯酶在有機(jī)溶劑中的催化報道了酯酶在有機(jī)溶劑中的催化作用，但一直存在爭議，未能引起科學(xué)界的重視作用，但一直存在爭議，未能引起科學(xué)界的重視T人類認(rèn)識的進(jìn)步TSym E. A., Biochemical Journal, 1936, 30: 609-617T人類認(rèn)識的進(jìn)步T1966 年，年，Dostoli 和和 Siegel 分別報道胰凝乳蛋白酶和辣根過氧化物分別報道胰凝乳蛋白酶和辣根過氧化物酶在幾種非極性有機(jī)溶劑中具有催化活力酶在幾種非極性有機(jī)溶劑中具有催化活力T19751983 年間，年間，Buckland 和和 Martinek

3、 等對游離酶和固定化酶在等對游離酶和固定化酶在有機(jī)溶劑中合成類固醇及甾醇轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用進(jìn)行了大量的探索有機(jī)溶劑中合成類固醇及甾醇轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用進(jìn)行了大量的探索T1977 年，年，Klibanov 等人報道了在水等人報道了在水/氯仿兩相體系中脂肪酶催化氯仿兩相體系中脂肪酶催化 N-乙酰乙酰-L-色氨酸與乙醇的酯化反應(yīng)，在水中收率極低，而在兩相體系色氨酸與乙醇的酯化反應(yīng)，在水中收率極低，而在兩相體系中竟達(dá)到中竟達(dá)到 100%TKlibanov A. M., et al., Biotechnol. Bioeng., 1977, 19(9): 1351-1361T1984 年，年，Zaks 和和 Klib

4、anov 在在 Science 雜志上發(fā)表了一篇關(guān)于酶在雜志上發(fā)表了一篇關(guān)于酶在有機(jī)介質(zhì)中催化條件和特點的文章，他們指出，只要條件適合，酶有機(jī)介質(zhì)中催化條件和特點的文章，他們指出，只要條件適合，酶可以在非水體系中表現(xiàn)出活性，并催化天然或非天然的底物發(fā)生轉(zhuǎn)可以在非水體系中表現(xiàn)出活性，并催化天然或非天然的底物發(fā)生轉(zhuǎn)化，這一報道引起了全球科學(xué)界的關(guān)注化，這一報道引起了全球科學(xué)界的關(guān)注T引起全球關(guān)注的“非水相酶催化”的報道TPorcine pancreatic lipase catalyzes the trans-esterification reaction between tributyrin a

5、nd various primary and secondary alcohols in a 99 percent organic medium. Upon further dehydration, the enzyme becomes extremely thermo-stable. Not only can the dry lipase withstand heating at 100 degrees C for many hours, but it exhibits a high catalytic activity at that temperature. Reduction in w

6、ater content also alters the substrate specificity of the lipase: in contrast to its wet counterpart, the dryenzyme does not react with bulky tertiary alcohols.TZaks A., and Klibanov A. M., Enzymatic catalysis in organic media at 100 degrees C, Science, 1984, 224: 1249-1251 (DOI: 10.1126/science.672

7、9453)T人類認(rèn)識的進(jìn)步T1984 年之后，非水相中的酶催化研究開始活躍起來年之后，非水相中的酶催化研究開始活躍起來T近年來，人們對非水介質(zhì)中的酶結(jié)構(gòu)與功能、酶作用機(jī)近年來，人們對非水介質(zhì)中的酶結(jié)構(gòu)與功能、酶作用機(jī)制、酶作用動力學(xué)等進(jìn)行了大量研究，建立起非水酶學(xué)制、酶作用動力學(xué)等進(jìn)行了大量研究，建立起非水酶學(xué)（non-aqueous enzymology）T同時人們還對酶催化的介質(zhì)進(jìn)行了大量研究，開發(fā)出各同時人們還對酶催化的介質(zhì)進(jìn)行了大量研究，開發(fā)出各種非水介質(zhì)和新的酶促反應(yīng)體系，發(fā)展出了介質(zhì)工程種非水介質(zhì)和新的酶促反應(yīng)體系，發(fā)展出了介質(zhì)工程（medium engineering），拓寬了酶

8、催化反應(yīng)的應(yīng)用范），拓寬了酶催化反應(yīng)的應(yīng)用范圍，使酶法合成逐步發(fā)展成為與化學(xué)法合成相互補(bǔ)充的圍，使酶法合成逐步發(fā)展成為與化學(xué)法合成相互補(bǔ)充的合成方法合成方法T非水相酶催化概論T非水相酶催化的優(yōu)勢非水相酶催化的優(yōu)勢T增加某些底物的增加某些底物的溶解度溶解度T采用有機(jī)相，可以增大某些有機(jī)底物的溶解度，從而加速反應(yīng)采用有機(jī)相，可以增大某些有機(jī)底物的溶解度，從而加速反應(yīng)T改變反應(yīng)改變反應(yīng)平衡平衡T在有機(jī)介質(zhì)中，由于水的含量極微，導(dǎo)致酶促水解反應(yīng)逆向進(jìn)行在有機(jī)介質(zhì)中，由于水的含量極微，導(dǎo)致酶促水解反應(yīng)逆向進(jìn)行T例：蛋白酶在水相中催化肽鏈水解，在有機(jī)相中催化肽鏈合成例：蛋白酶在水相中催化肽鏈水解，在有機(jī)相

9、中催化肽鏈合成T改變或提高酶的改變或提高酶的選擇性選擇性T例如，無水吡啶中枯草桿菌蛋白酶選擇性?；?，無水吡啶中枯草桿菌蛋白酶選擇性?；?castanospermineT非水相酶催化概論T生物催化的介質(zhì)系統(tǒng)生物催化的介質(zhì)系統(tǒng)T均相體系均相體系T單一的水相或水緩沖液單一的水相或水緩沖液T互溶的水互溶的水/有機(jī)溶劑系統(tǒng)有機(jī)溶劑系統(tǒng)T微水有機(jī)溶劑微水有機(jī)溶劑T超臨界流體介質(zhì)超臨界流體介質(zhì)T離子液體介質(zhì)離子液體介質(zhì)T非均相體系：兩相或多相非均相體系：兩相或多相T水水/有機(jī)溶劑（非互溶）兩相系統(tǒng)有機(jī)溶劑（非互溶）兩相系統(tǒng)T乳狀液或微乳液系統(tǒng)乳狀液或微乳液系統(tǒng)T無溶劑或寡溶劑系統(tǒng)無溶劑或寡溶劑系統(tǒng)T氣相

10、合成氣相合成T固相合成固相合成T本章主要內(nèi)容T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化有機(jī)介質(zhì)中的酶催化 T水對酶催化反應(yīng)的影響水對酶催化反應(yīng)的影響T有機(jī)溶劑對酶催化反應(yīng)的影響有機(jī)溶劑對酶催化反應(yīng)的影響T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制T其他介質(zhì)中的酶催化簡介（簡單了解）其他介質(zhì)中的酶催化簡介（簡單了解）T氣相介質(zhì)中的酶催化氣相介質(zhì)中的酶催化T超臨界流體介質(zhì)中的酶催化超臨界流體介質(zhì)中的酶催化T離子液體介質(zhì)中的酶催化離子液體介質(zhì)中的酶催化T酶非水相催化的應(yīng)用酶非水相催化的應(yīng)用T有

11、機(jī)介質(zhì)中的酶催化T定義：酶在含有定義：酶在含有的有機(jī)溶劑中進(jìn)行的催化反應(yīng)的有機(jī)溶劑中進(jìn)行的催化反應(yīng)T適用范圍適用范圍T底物、產(chǎn)物或其一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用底物、產(chǎn)物或其一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用T特性特性T酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性、熱穩(wěn)定酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性、熱穩(wěn)定性等有所改變性等有所改變T應(yīng)用應(yīng)用T多肽、酯類、甾體轉(zhuǎn)化、功能高分子合成、手性藥物拆分的研究多肽、酯類、甾體轉(zhuǎn)化、功能高分子合成、手性藥物拆分的研究T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)溶劑中酶分子存在形式有機(jī)溶劑中酶分子存在形式T固態(tài)酶：以固體形式存在于有機(jī)相中固態(tài)酶：以固體形式存在于有

12、機(jī)相中T冷凍干燥的酶粉冷凍干燥的酶粉T固定化酶固定化酶T結(jié)晶酶結(jié)晶酶 今后的熱點今后的熱點T可溶解酶可溶解酶T水溶性大分子共價修飾酶水溶性大分子共價修飾酶T非共價修飾的高分子非共價修飾的高分子/酶復(fù)合物酶復(fù)合物T表面活性劑表面活性劑/酶復(fù)合物酶復(fù)合物T微乳液中的酶微乳液中的酶T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶分散在有機(jī)溶劑中的形態(tài)酶分散在有機(jī)溶劑中的形態(tài)T酶在有機(jī)溶劑中以懸浮狀態(tài)起催化作用酶在有機(jī)溶劑中以懸浮狀態(tài)起催化作用T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T影響酶三維構(gòu)象和活力的因素影響酶三維構(gòu)象和活力的因素：(1) 酶分子結(jié)構(gòu)變化酶分子結(jié)構(gòu)變化T導(dǎo)致酶活力變化的主要原因不是酶分子活性中心的改變，而是酶導(dǎo)致酶活力變化

13、的主要原因不是酶分子活性中心的改變，而是酶分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)的T酶分子在水溶液中以其緊密的空間結(jié)構(gòu)和一定的柔性發(fā)揮催化功能酶分子在水溶液中以其緊密的空間結(jié)構(gòu)和一定的柔性發(fā)揮催化功能T有機(jī)溶劑中酶分子構(gòu)象部分破壞的原因與溶劑的電性能有關(guān)有機(jī)溶劑中酶分子構(gòu)象部分破壞的原因與溶劑的電性能有關(guān)T水化程度的提高和溶劑介電常數(shù)的增大，都能增加酶分子的柔性水化程度的提高和溶劑介電常數(shù)的增大，都能增加酶分子的柔性T固態(tài)固態(tài) NMR 實驗證實，實驗證實，在在冷凍干燥過程中，冷凍干燥過程中， -胰凝乳蛋白酶的胰凝乳蛋白酶的酶活酶活性中心會被破壞；而由性中心會被破壞；而由 FTIR 的實驗結(jié)果得知，冷凍干燥會誘導(dǎo)蛋

14、的實驗結(jié)果得知，冷凍干燥會誘導(dǎo)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生可逆改變，增加白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生可逆改變，增加 -折疊結(jié)構(gòu)的含量，而降低折疊結(jié)構(gòu)的含量，而降低 -螺旋結(jié)構(gòu)的含量螺旋結(jié)構(gòu)的含量T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T影響酶三維構(gòu)象和活力的因素影響酶三維構(gòu)象和活力的因素：(2) 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑T不同有機(jī)溶劑使酶發(fā)生不同有機(jī)溶劑使酶發(fā)生的程度不同的程度不同T堿性磷酸酯酶在親水有機(jī)溶劑中的不可逆失活作用堿性磷酸酯酶在親水有機(jī)溶劑中的不可逆失活作用 所選的四種有所選的四種有機(jī)溶劑均能與水混機(jī)溶劑均能與水混溶。經(jīng)過較長時間溶。經(jīng)過較長時間（36 h）的處理，）的處理，四種有機(jī)溶劑都使四種有機(jī)溶劑都使堿性磷酸酯酶發(fā)生堿性磷酸

15、酯酶發(fā)生不可逆失活，而在不可逆失活，而在丙酮和乙腈中，酶丙酮和乙腈中，酶活力損失得最多?；盍p失得最多。T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T為什么酶在有機(jī)介質(zhì)中具有催化活力為什么酶在有機(jī)介質(zhì)中具有催化活力T結(jié)構(gòu)因素結(jié)構(gòu)因素T通過酶在水相和有機(jī)相中的結(jié)構(gòu)比較，證實了有機(jī)相中酶能夠保持通過酶在水相和有機(jī)相中的結(jié)構(gòu)比較，證實了有機(jī)相中酶能夠保持其整體結(jié)構(gòu)的其整體結(jié)構(gòu)的 ，至少酶活性部位與水溶液中的結(jié)構(gòu)是相同，至少酶活性部位與水溶液中的結(jié)構(gòu)是相同的的T不同介質(zhì)中酶活性中心的完整性相差不大，但酶活力卻相差不同介質(zhì)中酶活性中心的完整性相差不大，但酶活力卻相差4個數(shù)個數(shù)量級，因此認(rèn)為酶分子結(jié)構(gòu)的量級，因此認(rèn)為酶分子結(jié)構(gòu)的

16、 很可能是主要因素很可能是主要因素?T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T為什么酶在有機(jī)介質(zhì)中具有催化活力為什么酶在有機(jī)介質(zhì)中具有催化活力T作用力因素作用力因素 氫鍵效應(yīng)氫鍵效應(yīng)T酶分子的酶分子的“緊密緊密”狀態(tài)主要取決于蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵，而溶液中狀態(tài)主要取決于蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵，而溶液中水分子與蛋白質(zhì)分子之間形成的氫鍵使蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵發(fā)生一定水分子與蛋白質(zhì)分子之間形成的氫鍵使蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵發(fā)生一定程度的破壞，蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，呈一種程度的破壞，蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，呈一種“開啟開啟”狀態(tài)狀態(tài)T酶分子的酶分子的“”和和“”兩種狀態(tài)處于一種可交換的平衡，兩種狀態(tài)處于一種可交換的平衡，表現(xiàn)出一定的柔性表現(xiàn)出一定

17、的柔性?T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T為什么酶在有機(jī)介質(zhì)中具有催化活力為什么酶在有機(jī)介質(zhì)中具有催化活力T酶分子的酶分子的“緊密（緊密（compact）”和和“開啟（開啟（unlocking）”兩種兩種狀態(tài)處于一種可交換的平衡，表現(xiàn)出一定的柔性（狀態(tài)處于一種可交換的平衡，表現(xiàn)出一定的柔性（flexibility）?T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T常見的有機(jī)介質(zhì)體系常見的有機(jī)介質(zhì)體系T(a) 微水介質(zhì)體系（微水介質(zhì)體系（micro-aqueous media system）T由有機(jī)溶劑和由有機(jī)溶劑和組成的反應(yīng)體系，即通常所說的有機(jī)介質(zhì)體組成的反應(yīng)體系，即通常所說的有機(jī)介質(zhì)體系系T大部分的微量水以酶分子的大部分的微量

18、水以酶分子的形式存在，對維持酶分子的空形式存在，對維持酶分子的空間構(gòu)象和催化活性至關(guān)重要；另一部分水分配在有機(jī)溶劑中間構(gòu)象和催化活性至關(guān)重要；另一部分水分配在有機(jī)溶劑中T酶以固態(tài)的形式酶以固態(tài)的形式于有機(jī)介質(zhì)中于有機(jī)介質(zhì)中T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T常見的有機(jī)介質(zhì)體系常見的有機(jī)介質(zhì)體系T(b) 與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體系與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體系T水水 / 極性有機(jī)溶劑混溶體系，水和有機(jī)相的比例都很大，酶和底物極性有機(jī)溶劑混溶體系，水和有機(jī)相的比例都很大，酶和底物以溶解的狀態(tài)存在于此體系中以溶解的狀態(tài)存在于此體系中T強(qiáng)極性有機(jī)溶劑對酶的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)極性有機(jī)溶劑對酶的結(jié)構(gòu)和 ，適用的酶較少，適用的

19、酶較少T例：辣根過氧化物酶（例：辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）在此）在此類介質(zhì)中能催化酚類或芳香胺的聚合類介質(zhì)中能催化酚類或芳香胺的聚合T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T常見的有機(jī)介質(zhì)體系常見的有機(jī)介質(zhì)體系T(c) 與水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相或多相體系與水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相或多相體系T由水和疏水有機(jī)溶劑組成兩相或多相體系由水和疏水有機(jī)溶劑組成兩相或多相體系T游離酶、親水性底物溶于水相，疏水性底物或產(chǎn)物溶于有機(jī)相，固游離酶、親水性底物溶于水相，疏水性底物或產(chǎn)物溶于有機(jī)相，固定化酶則懸浮于兩相的界面；催化反應(yīng)在定化酶則懸浮于兩相的界面；催化反應(yīng)在 進(jìn)行進(jìn)行T有機(jī)

20、介質(zhì)中的酶催化T常見的有機(jī)介質(zhì)體系常見的有機(jī)介質(zhì)體系T(d) 膠束體系膠束體系T正膠束體系（正膠束體系（normal micelles system）T水為主體，表面活性劑的極性端朝外，非極性端朝內(nèi)，酶在液水為主體，表面活性劑的極性端朝外，非極性端朝內(nèi)，酶在液相主體中，反應(yīng)在膠束兩相界面進(jìn)行相主體中，反應(yīng)在膠束兩相界面進(jìn)行T反膠束體系（反膠束體系（reverse micelles system）T有機(jī)溶劑為主體，表面活性劑的極性端朝內(nèi)，非極性端朝外，有機(jī)溶劑為主體，表面活性劑的極性端朝內(nèi)，非極性端朝外，酶在反膠束內(nèi)部的水相中，反應(yīng)在膠束兩相界面進(jìn)行酶在反膠束內(nèi)部的水相中，反應(yīng)在膠束兩相界面進(jìn)行

21、T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T常見的有機(jī)介質(zhì)體系常見的有機(jī)介質(zhì)體系 膠束體系示意圖膠束體系示意圖T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T常見的有機(jī)介質(zhì)體系常見的有機(jī)介質(zhì)體系T酶包埋在反膠束中，可以在模擬體內(nèi)環(huán)境的情況下，研究酶的結(jié)酶包埋在反膠束中，可以在模擬體內(nèi)環(huán)境的情況下，研究酶的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)性質(zhì)構(gòu)和動力學(xué)性質(zhì)T不同類型的酶在反膠束中的排布模型不同類型的酶在反膠束中的排布模型T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中水對酶催化反應(yīng)的影響有機(jī)介質(zhì)中水對酶催化反應(yīng)的影響T與酶粉水合的結(jié)合水、固定載體和其他雜質(zhì)的結(jié)合水與酶粉水合的結(jié)合水、固定載體和其他雜質(zhì)的結(jié)合水T溶于有機(jī)溶劑中溶于有機(jī)溶劑中T與酶結(jié)合的與酶結(jié)合的 ，以及水在酶分子

22、中的，以及水在酶分子中的 是影響酶的活力、是影響酶的活力、穩(wěn)定性以及專一性的決定因素穩(wěn)定性以及專一性的決定因素T水對于酶催化活性構(gòu)象的獲得與保持是必須的，但水也與許多酶水對于酶催化活性構(gòu)象的獲得與保持是必須的，但水也與許多酶的失活過程有關(guān)，即水對酶催化反應(yīng)具有的失活過程有關(guān)，即水對酶催化反應(yīng)具有 T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水在酶催化反應(yīng)中的雙重作用水在酶催化反應(yīng)中的雙重作用T一方面，水分子直接或間接地通過氫鍵、疏水鍵、范德華力等非一方面，水分子直接或間接地通過氫鍵、疏水鍵、范德華力等非共價相互作用來維持酶的催化活性所必需的構(gòu)象共價相互作用來維持酶的催化活性所必需的構(gòu)象T水分子與部分氨基酸殘基之間形

23、成氫鍵，對穩(wěn)定酶分子的構(gòu)象起重水分子與部分氨基酸殘基之間形成氫鍵，對穩(wěn)定酶分子的構(gòu)象起重要作用要作用T酶分子周圍水的存在（水化層），能降低酶分子中極性氨基酸殘基酶分子周圍水的存在（水化層），能降低酶分子中極性氨基酸殘基之間的相互作用，防止產(chǎn)生不正確的構(gòu)象之間的相互作用，防止產(chǎn)生不正確的構(gòu)象T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水在酶催化反應(yīng)中的雙重作用水在酶催化反應(yīng)中的雙重作用T另一方面，水是導(dǎo)致酶的熱失活的重要因素，有水存在時隨著溫另一方面，水是導(dǎo)致酶的熱失活的重要因素，有水存在時隨著溫度的升高酶分子會發(fā)生變化而失活度的升高酶分子會發(fā)生變化而失活T含水量過高，則酶分子柔性過大，酶的構(gòu)象將向疏水環(huán)境下熱力學(xué)含

24、水量過高，則酶分子柔性過大，酶的構(gòu)象將向疏水環(huán)境下熱力學(xué)穩(wěn)定的狀態(tài)變化，引起酶結(jié)構(gòu)的改變和失活穩(wěn)定的狀態(tài)變化，引起酶結(jié)構(gòu)的改變和失活T二硫鍵受到破壞，酶分子容易形成不規(guī)則結(jié)構(gòu)二硫鍵受到破壞，酶分子容易形成不規(guī)則結(jié)構(gòu)T部分殘基（如部分殘基（如Asn 和和 Gln）水解，甚至部分肽鍵也能發(fā)生水解）水解，甚至部分肽鍵也能發(fā)生水解T因此，酶蛋白結(jié)構(gòu)的動力學(xué)剛性（因此，酶蛋白結(jié)構(gòu)的動力學(xué)剛性（kinetic rigidity）和熱力學(xué)穩(wěn)定）和熱力學(xué)穩(wěn)定性（性（thermodynamic stability）之間存在平衡點，使酶分子的活性）之間存在平衡點，使酶分子的活性最大最大T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T通常是

25、與酶分子通常是與酶分子 的一層左右的水分子，即的一層左右的水分子，即 T不同酶與必需水結(jié)合的緊密程度，以及所結(jié)合的必需水?dāng)?shù)量是不不同酶與必需水結(jié)合的緊密程度，以及所結(jié)合的必需水?dāng)?shù)量是不同的同的T必需水是維持酶分子間次級鍵所必需的，是維持酶構(gòu)象的必需水是維持酶分子間次級鍵所必需的，是維持酶構(gòu)象的“潤滑潤滑劑劑”T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水對蛋白質(zhì)流動性（水對蛋白質(zhì)流動性（protein mobility）及酶活力的影響）及酶活力的影響T有機(jī)溶劑中活性位點的流動性隨水的加入有顯著的增加，最可信有機(jī)溶劑中活性位點的流動性隨水的加入有顯著的增加，最可信的解釋是水作為增塑劑，增加蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的的解釋是水作為增

26、塑劑，增加蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的，也增加了酶的，也增加了酶的T乙醇脫氫酶和枯草桿菌蛋白酶活性位點自旋標(biāo)記乙醇脫氫酶和枯草桿菌蛋白酶活性位點自旋標(biāo)記 EPR 光譜實驗光譜實驗T利用利用 NH 互換互換 NMR 光譜研究光譜研究 THF 中中 Cyt C 的結(jié)構(gòu)動力學(xué)的結(jié)構(gòu)動力學(xué)T在有機(jī)溶劑中加到固態(tài)酶制劑上的水會通過增加酶活性位點的極在有機(jī)溶劑中加到固態(tài)酶制劑上的水會通過增加酶活性位點的極性和柔性而提高其活力性和柔性而提高其活力T干態(tài)下，酶分子帶電基團(tuán)和極性基團(tuán)相互作用產(chǎn)生一個失活的鎖住干態(tài)下，酶分子帶電基團(tuán)和極性基團(tuán)相互作用產(chǎn)生一個失活的鎖住的構(gòu)象的構(gòu)象T水的作用是與這些功能基團(tuán)形成氫鍵，屏蔽離子化基團(tuán)

27、之間的靜電水的作用是與這些功能基團(tuán)形成氫鍵，屏蔽離子化基團(tuán)之間的靜電作用，并中和肽鏈中肽單元和極性側(cè)鏈基團(tuán)之間的偶極相互作用作用，并中和肽鏈中肽單元和極性側(cè)鏈基團(tuán)之間的偶極相互作用T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水對蛋白質(zhì)流動性（水對蛋白質(zhì)流動性（protein mobility）及酶活力的影響）及酶活力的影響T次級鍵在控制有機(jī)相中酶的催化行為方面可能起主要作用次級鍵在控制有機(jī)相中酶的催化行為方面可能起主要作用T通過向溶劑中加入通過向溶劑中加入“氫鍵形成物氫鍵形成物”可以得到驗證，例如，加入可以得到驗證，例如，加入 3% 甲酰胺使辛醇（含水甲酰胺使辛醇（含水 1%）中的多酚氧化酶的活力提高）中的多酚氧化

28、酶的活力提高 35 倍倍T在有機(jī)介質(zhì)中酶所表現(xiàn)的一些新性質(zhì)可能與酶在非水環(huán)境中所具在有機(jī)介質(zhì)中酶所表現(xiàn)的一些新性質(zhì)可能與酶在非水環(huán)境中所具有的剛性構(gòu)象有關(guān)，而這些性質(zhì)將會因水增加了柔性而改變有的剛性構(gòu)象有關(guān)，而這些性質(zhì)將會因水增加了柔性而改變T例例1：有機(jī)介質(zhì)中枯草桿菌蛋白酶的表觀：有機(jī)介質(zhì)中枯草桿菌蛋白酶的表觀 pKa 值取決于所用的溶劑值取決于所用的溶劑及溶劑中的水含量，酶的水合可使表觀及溶劑中的水含量，酶的水合可使表觀 pKa 值降低值降低 1T例例2：枯草桿菌蛋白酶的干酶在庚醇：枯草桿菌蛋白酶的干酶在庚醇 / 三丁酸甘油酯中的熱穩(wěn)定性三丁酸甘油酯中的熱穩(wěn)定性很好（很好（100 oC 時

29、半衰期時半衰期 12 h），但僅加入），但僅加入 0.8% 的水時，其活力基的水時，其活力基本消失本消失T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水對酶催化反應(yīng)速率的影響水對酶催化反應(yīng)速率的影響（難點）（難點）T典型的非水酶體系中水含量通常只占典型的非水酶體系中水含量通常只占 0.01%，但其微小差距會導(dǎo)，但其微小差距會導(dǎo)致酶催化活力的較大改變致酶催化活力的較大改變T在最適含水量時，酶蛋白結(jié)構(gòu)的動力學(xué)剛性（在最適含水量時，酶蛋白結(jié)構(gòu)的動力學(xué)剛性（kinetic rigidity）和熱）和熱力學(xué)穩(wěn)定性（力學(xué)穩(wěn)定性（thermodynamic stability）之間達(dá)平衡點，酶活性最大）之間達(dá)平衡點，酶活性最大T酶

30、含水量酶含水量 最適含水量，酶構(gòu)象過于最適含水量，酶構(gòu)象過于“柔性柔性”，因變構(gòu)而失活，因變構(gòu)而失活T同一種酶，反應(yīng)系統(tǒng)的最適含水量與有機(jī)溶劑的種類、酶的純度、同一種酶，反應(yīng)系統(tǒng)的最適含水量與有機(jī)溶劑的種類、酶的純度、固定化酶的載體性質(zhì)和修飾性質(zhì)等因素有關(guān)固定化酶的載體性質(zhì)和修飾性質(zhì)等因素有關(guān)T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水對酶催化反應(yīng)速率的影響水對酶催化反應(yīng)速率的影響T溶菌酶酶粉在水合過程中酶活力與酶含水量之間的關(guān)系溶菌酶酶粉在水合過程中酶活力與酶含水量之間的關(guān)系結(jié)合水含量結(jié)合水含量(%)酶周圍水分子個數(shù)酶周圍水分子個數(shù)作用作用0 70 60有助于蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基的離子化有助于蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基的離子化7

31、 2560 2207% 水分子在其他極性部位形成簇，水分子在其他極性部位形成簇，25% 肽鍵的氨基被水合，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基本不變，肽鍵的氨基被水合，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基本不變，酶活不變酶活不變25 38220 300肽鍵羧基為主的極性部位完全水合，酶活肽鍵羧基為主的極性部位完全水合，酶活力隨含水量增加而增加力隨含水量增加而增加 38 300整個酶分子被水層包圍，水分子在活性位整個酶分子被水層包圍，水分子在活性位點之間形成水束，掩蓋活性位點的極性，點之間形成水束，掩蓋活性位點的極性，酶活力只有水溶液中的酶活力只有水溶液中的 1/10T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水對酶催化反應(yīng)速率的影響水對酶催化反應(yīng)速率的影響T三種

32、酶在不同溶劑中水含量對酶活的影響三種酶在不同溶劑中水含量對酶活的影響T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水活度（水活度（water activity）T為了排除溶劑對最適含水量的影響，為了排除溶劑對最適含水量的影響，Halling 建議用建議用“水活度水活度”描述有機(jī)介質(zhì)中酶催化活力與水的關(guān)系描述有機(jī)介質(zhì)中酶催化活力與水的關(guān)系T體系中水的逸度（體系中水的逸度（fugacity）與純水逸度之比，）與純水逸度之比，Tf 一定條件下體系中水的逸度一定條件下體系中水的逸度Tf0 相同條件下純水的逸度相同條件下純水的逸度Tp 一定條件下體系中水的蒸氣壓一定條件下體系中水的蒸氣壓Tp0 相同條件下純水的蒸氣壓相同條件下

33、純水的蒸氣壓(7-1)w00fpAfpT有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水活度（水活度（water activity）T不同類型介質(zhì)的水活度不同類型介質(zhì)的水活度T對于非極性或弱極性溶劑：對于非極性或弱極性溶劑：T w 水的活度系數(shù)水的活度系數(shù)Txw 水的摩爾比水的摩爾比T對于極性大的溶劑：對于極性大的溶劑：TYw 氣相中水的摩爾比例氣相中水的摩爾比例TpT 氣相總壓力氣相總壓力Tp0 相同條件下水的飽和蒸氣壓（純水蒸氣壓）相同條件下水的飽和蒸氣壓（純水蒸氣壓）wwwAx (7-2)Tww0pAYp(7-3)T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水活度（水活度（water activity）T最適含水量與溶劑極性成正比，而

34、最適含水量與溶劑極性成正比，而，故采用水活度作參數(shù)更確切，故采用水活度作參數(shù)更確切T各種酶因結(jié)構(gòu)不同，維持酶活性構(gòu)象的必需水也不同，大部分酶各種酶因結(jié)構(gòu)不同，維持酶活性構(gòu)象的必需水也不同，大部分酶需較高的水活度才表現(xiàn)較好的活力需較高的水活度才表現(xiàn)較好的活力T非水介質(zhì)中酶要表現(xiàn)出最大活力，不僅需要有適當(dāng)?shù)乃疃?，而非水介質(zhì)中酶要表現(xiàn)出最大活力，不僅需要有適當(dāng)?shù)乃疃?，而且水的位置也要正確且水的位置也要正確T對枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行超聲波處理，可使酶活顯著提高，這可能是對枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行超聲波處理，可使酶活顯著提高，這可能是結(jié)合在酶蛋白中的水分子在超聲場中重新排布造成的結(jié)合在酶蛋白中的水分子在超聲場

35、中重新排布造成的T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T水活度（水活度（water activity）T在不同溶劑中研究酶動力學(xué)時為了避免水的影響，最好保持恒定在不同溶劑中研究酶動力學(xué)時為了避免水的影響，最好保持恒定的水活度的水活度T獲取恒定水活度的方式獲取恒定水活度的方式T用一飽和鹽水溶液分別預(yù)平衡底物溶液和酶制劑用一飽和鹽水溶液分別預(yù)平衡底物溶液和酶制劑T向反應(yīng)體系中直接加入一種水合鹽向反應(yīng)體系中直接加入一種水合鹽T向每一溶劑中加入不同量的水向每一溶劑中加入不同量的水T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)溶劑對酶催化反應(yīng)的影響有機(jī)溶劑對酶催化反應(yīng)的影響T有機(jī)溶劑通過與水、酶、底物和產(chǎn)物的相互作用，直接或間接影有機(jī)溶劑通

36、過與水、酶、底物和產(chǎn)物的相互作用，直接或間接影響酶的活性和穩(wěn)定性響酶的活性和穩(wěn)定性T有機(jī)溶劑主要通過以下有機(jī)溶劑主要通過以下發(fā)生作用發(fā)生作用T(1) 有機(jī)溶劑與有機(jī)溶劑與直接發(fā)生作用，通過干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶直接發(fā)生作用，通過干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶的構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶的活性被抑制或酶的失活的構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶的活性被抑制或酶的失活T(2) 有機(jī)溶劑和能擴(kuò)散的有機(jī)溶劑和能擴(kuò)散的相互作用，影響正常反應(yīng)相互作用，影響正常反應(yīng)的進(jìn)行的進(jìn)行T(3) 有機(jī)溶劑直接和酶分子周圍的有機(jī)溶劑直接和酶分子周圍的相互作用相互作用T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)溶劑對酶活性的影響有機(jī)溶劑對酶活性的影響（難點）（難點）T對

37、酶分子對酶分子的影響的影響T酶分子與溶劑的直接接觸，其表面結(jié)構(gòu)發(fā)生不可忽視的變化酶分子與溶劑的直接接觸，其表面結(jié)構(gòu)發(fā)生不可忽視的變化T例：枯草桿菌蛋白酶在乙腈中，有例：枯草桿菌蛋白酶在乙腈中，有 12 個乙腈分子結(jié)合到酶分子中，個乙腈分子結(jié)合到酶分子中，其中有其中有 4 個是原來水分子結(jié)合的位點個是原來水分子結(jié)合的位點T對酶活性中心對酶活性中心的影響的影響T有機(jī)溶劑可減少整個活性中心的數(shù)量；活性中心數(shù)目喪失的多少取有機(jī)溶劑可減少整個活性中心的數(shù)量；活性中心數(shù)目喪失的多少取決于溶劑的疏水性強(qiáng)弱決于溶劑的疏水性強(qiáng)弱T溶劑分子能滲透入酶的活性中心，與底物競爭酶活性中心的結(jié)合位溶劑分子能滲透入酶的活性

38、中心，與底物競爭酶活性中心的結(jié)合位點，降低活性中心的極性，增加酶與底物的靜電斥力點，降低活性中心的極性，增加酶與底物的靜電斥力T例：甲醇可進(jìn)入辣根過氧化物酶的活性中心，與鐵卟啉配位結(jié)合例：甲醇可進(jìn)入辣根過氧化物酶的活性中心，與鐵卟啉配位結(jié)合T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)溶劑對酶活性的影響有機(jī)溶劑對酶活性的影響（難點）（難點）T對對的影響的影響T親水有機(jī)溶劑能奪取酶分子表面的必需水而使酶失水親水有機(jī)溶劑能奪取酶分子表面的必需水而使酶失水T由于酶與溶劑競爭水分子，體系的最適含水量與酶的用量及由于酶與溶劑競爭水分子，體系的最適含水量與酶的用量及底物濃度有關(guān)底物濃度有關(guān)T增加酶表面的親水性可以限制酶在有機(jī)

39、溶劑中的脫水作用增加酶表面的親水性可以限制酶在有機(jī)溶劑中的脫水作用T例如：例如： -胰凝乳蛋白酶用胰凝乳蛋白酶用 1,2,4,5-苯均四甲酸二酐共價修飾后，苯均四甲酸二酐共價修飾后，酶分子表面親水性提高，在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性提高酶分子表面親水性提高，在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性提高T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化（重點）（重點）TP 表示溶劑在表示溶劑在 兩相體系中分配系數(shù)，通常用其對數(shù)形式兩相體系中分配系數(shù)，通常用其對數(shù)形式表示，即表示，即 lgPT酶活力與酶活力與 lgP 值之間的定量關(guān)系值之間的定量關(guān)系 Laane 實驗實驗TlgP 4，酶具有較高活力，此類溶劑較理想，酶具有較高活力，此類溶劑較理想T2 l

40、gP 4，酶活力中等，酶活力中等T結(jié)論：如何選擇合適的反應(yīng)溶劑結(jié)論：如何選擇合適的反應(yīng)溶劑 ？T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化TlgP 值與結(jié)合水奪取能力的分析值與結(jié)合水奪取能力的分析（重點）（重點）T現(xiàn)象現(xiàn)象 1：很多酶在甲醇中的活力很低：很多酶在甲醇中的活力很低T現(xiàn)象現(xiàn)象 2：正己烷經(jīng)常被用于酶的有機(jī)相催化反應(yīng)介質(zhì)：正己烷經(jīng)常被用于酶的有機(jī)相催化反應(yīng)介質(zhì)T從從 和和 lgP 值分析原因值分析原因T甲醇的極性很強(qiáng)，親水性亦很強(qiáng)，實驗表明甲醇能奪取酶分子中甲醇的極性很強(qiáng)，親水性亦很強(qiáng)，實驗表明甲醇能奪取酶分子中 60% 的結(jié)合水的結(jié)合水T正己烷的極性很弱，親水性也很弱，實驗表明正己烷只能奪取酶分正己烷的極

41、性很弱，親水性也很弱，實驗表明正己烷只能奪取酶分子中子中 0.5% 的結(jié)合水的結(jié)合水溶劑溶劑介電常數(shù)介電常數(shù) 溶劑極性參數(shù)溶劑極性參數(shù) lgP甲醇（甲醇（methanol）32.35 0.76正己烷（正己烷（n-hexane）1.893.5T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)溶劑對酶活性的影響有機(jī)溶劑對酶活性的影響 溶劑極性與酶活力的關(guān)系溶劑極性與酶活力的關(guān)系T某些酶不完全符合某些酶不完全符合 Laane 提出的酶活力與提出的酶活力與 lgP 的關(guān)系，說明酶的關(guān)系，說明酶活力也與溶劑的其它性質(zhì)有關(guān)活力也與溶劑的其它性質(zhì)有關(guān)TlgSw/o (Sw/o：水在此溶劑中的溶解度：水在此溶劑中的溶解度)：醇脫氫酶

42、的酶活力與：醇脫氫酶的酶活力與 lgSw/o存在線性關(guān)系存在線性關(guān)系T溶劑的幾何形狀（手性）：部分酶在溶劑的幾何形狀（手性）：部分酶在 S-、R-構(gòu)型溶劑中活力不同，構(gòu)型溶劑中活力不同，例如多酚氧化酶在例如多酚氧化酶在 S-構(gòu)型溶劑中的活力高于在構(gòu)型溶劑中的活力高于在 R-構(gòu)型溶劑中活力構(gòu)型溶劑中活力T相毒性：獨立存在的有機(jī)相是使酶失活的重要因素相毒性：獨立存在的有機(jī)相是使酶失活的重要因素 水相水相 / 有有機(jī)相的界面效應(yīng)，與接觸面積有關(guān)機(jī)相的界面效應(yīng)，與接觸面積有關(guān)T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T溶劑對底物和產(chǎn)物分配的影響溶劑對底物和產(chǎn)物分配的影響T酶的酶的“必需水必需水”層是底物、產(chǎn)物分布的中介層是

43、底物、產(chǎn)物分布的中介T有機(jī)溶劑能改變酶分子有機(jī)溶劑能改變酶分子“必需水必需水”層中底物或產(chǎn)物的濃度層中底物或產(chǎn)物的濃度T有機(jī)溶劑極性小，疏水性強(qiáng)，疏水性底物難于進(jìn)入有機(jī)溶劑極性小，疏水性強(qiáng)，疏水性底物難于進(jìn)入“必需水必需水”層層T有機(jī)溶劑極性強(qiáng)，親水性強(qiáng)，疏水性底物在有機(jī)溶劑中溶解度太低有機(jī)溶劑極性強(qiáng)，親水性強(qiáng)，疏水性底物在有機(jī)溶劑中溶解度太低T如何選擇如何選擇 ？T選擇選擇 2 lgP 5 的有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)最適宜的有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)最適宜T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T小結(jié)小結(jié)T水的影響水的影響T“必需水必需水”T最適含水量最適含水量T水活度水活度T有機(jī)溶劑的影響有機(jī)溶劑的影響T溶劑的介電常數(shù)

44、溶劑的介電常數(shù) 和極性參數(shù)和極性參數(shù) lgPT溶劑對結(jié)合水、底物、產(chǎn)物的影響：結(jié)合溶劑對結(jié)合水、底物、產(chǎn)物的影響：結(jié)合 和和 lgP 值討論值討論T溶劑的選擇：溶劑的選擇： 、lgP 值、其他因素值、其他因素T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型T合成反應(yīng)合成反應(yīng)T轉(zhuǎn)移反應(yīng)轉(zhuǎn)移反應(yīng)T醇解反應(yīng)醇解反應(yīng)T氨解反應(yīng)氨解反應(yīng)T異構(gòu)化反應(yīng)異構(gòu)化反應(yīng)T氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)T裂合反應(yīng)裂合反應(yīng) / 加成反應(yīng)加成反應(yīng)T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型 合成反應(yīng)合成反應(yīng)T水解酶在有機(jī)介質(zhì)中能催化水解的逆反應(yīng)，即合成反應(yīng)水解酶在有機(jī)介質(zhì)

45、中能催化水解的逆反應(yīng)，即合成反應(yīng) (Why ?)T酯的合成：脂肪酶酯的合成：脂肪酶/酯酶的有機(jī)相催化酯酶的有機(jī)相催化T例如，假單孢菌脂肪酶催化的反應(yīng)：例如，假單孢菌脂肪酶催化的反應(yīng)：T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型 合成反應(yīng)合成反應(yīng)T蛋白酶在有機(jī)相中催化多肽合成蛋白酶在有機(jī)相中催化多肽合成T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型 轉(zhuǎn)移反應(yīng)轉(zhuǎn)移反應(yīng)T酯交換反應(yīng)（轉(zhuǎn)酯反應(yīng)）酯交換反應(yīng)（轉(zhuǎn)酯反應(yīng)）T例如，豬胰脂肪酶對外消旋體的拆分：例如，豬胰脂肪酶對外消旋體的拆分：T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶

46、催化反應(yīng)的類型 醇解反應(yīng)醇解反應(yīng)T假單胞脂肪酶催化酸酐醇解生成二酸單酯化合物假單胞脂肪酶催化酸酐醇解生成二酸單酯化合物T思考：醇解反應(yīng)能在水相中進(jìn)行嗎？思考：醇解反應(yīng)能在水相中進(jìn)行嗎？T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型 氨解反應(yīng)氨解反應(yīng)T脂肪酶催化酯類進(jìn)行不對稱氨解反應(yīng)脂肪酶催化酯類進(jìn)行不對稱氨解反應(yīng)T環(huán)氧化合物的氨解環(huán)氧化合物的氨解T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型 異構(gòu)化反應(yīng)異構(gòu)化反應(yīng)TD-ACL（D-3-amino-2- -caprolactam）的異構(gòu)化）的異構(gòu)化T木糖異構(gòu)酶催化的異構(gòu)化反應(yīng)木糖異構(gòu)酶催化的

47、異構(gòu)化反應(yīng)T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型 氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)T單加氧反應(yīng)單加氧反應(yīng)T雙加氧反應(yīng)雙加氧反應(yīng)T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型 氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)T脫氫酶催化的還原反應(yīng)：羰基的還原脫氫酶催化的還原反應(yīng)：羰基的還原T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型 氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)T脂肪烴脂肪烴 CH 鍵、鍵、C = C 鍵氧化鍵氧化T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型 裂合反應(yīng)裂合反應(yīng) / 加成反應(yīng)加成反應(yīng)T羰基的加成

48、與縮合反應(yīng)羰基的加成與縮合反應(yīng)T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性（重點、難點）（重點、難點）T有機(jī)相中酶催化特性改變（什么原因？）有機(jī)相中酶催化特性改變（什么原因？）T有機(jī)溶劑的存在，改變了疏水相互作用的精細(xì)平衡，從而影響到酶有機(jī)溶劑的存在，改變了疏水相互作用的精細(xì)平衡，從而影響到酶的結(jié)合部位的結(jié)合部位T有機(jī)溶劑改變了底物的存在狀態(tài)（親水有機(jī)溶劑改變了底物的存在狀態(tài)（親水 / 疏水）疏水）T影響影響T底物特異性底物特異性T立體選擇性立體選擇性T區(qū)域選擇性區(qū)域選擇性T化學(xué)鍵選擇性化學(xué)鍵選擇性T其他其他 熱穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、pH 特性特性有機(jī)相中酶能夠催化新的反

49、應(yīng)，生成新產(chǎn)物有機(jī)相中酶能夠催化新的反應(yīng)，生成新產(chǎn)物T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 底物專一性底物專一性T有機(jī)介質(zhì)中酶活性中心結(jié)合部位與底物的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變，致有機(jī)介質(zhì)中酶活性中心結(jié)合部位與底物的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變，致使酶的底物特異性發(fā)生改變使酶的底物特異性發(fā)生改變T解釋：疏水性的相對強(qiáng)弱；底物在酶表面和溶劑中的分配變化解釋：疏水性的相對強(qiáng)弱；底物在酶表面和溶劑中的分配變化T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 底物專一性底物專一性T不同的有機(jī)介質(zhì)，酶的底物專一性也不一樣不同的有機(jī)介質(zhì)，酶的底物專一性也不一樣T極性較強(qiáng)的有

50、機(jī)溶劑中，疏水性較強(qiáng)的底物易反應(yīng)極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑中，疏水性較強(qiáng)的底物易反應(yīng)T極性較弱的有機(jī)溶劑中，疏水性較弱的底物易反應(yīng)極性較弱的有機(jī)溶劑中，疏水性較弱的底物易反應(yīng)T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 對映體選擇性對映體選擇性T對映體選擇性（對映體選擇性（enantioselectivity）是酶在對稱的外消旋化合物）是酶在對稱的外消旋化合物中識別一種異構(gòu)體的能力大小的指標(biāo)中識別一種異構(gòu)體的能力大小的指標(biāo)T立體選擇系數(shù)（立體選擇系數(shù)（KLD）TKm 米氏常數(shù)米氏常數(shù)TKcat 酶的轉(zhuǎn)換數(shù)酶的轉(zhuǎn)換數(shù)/catmLLDcatmDKKKKK(7-4)T有機(jī)介質(zhì)中的酶

51、催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 對映體選擇性對映體選擇性T酶在水溶液中催化的對映體選擇性較強(qiáng)，而在疏水性強(qiáng)的有機(jī)介酶在水溶液中催化的對映體選擇性較強(qiáng)，而在疏水性強(qiáng)的有機(jī)介質(zhì)中對映體選擇性較差（為什么？）質(zhì)中對映體選擇性較差（為什么？）T可能的原因：底物的兩種對映體與酶分子的結(jié)合方式不同，因此把可能的原因：底物的兩種對映體與酶分子的結(jié)合方式不同，因此把水分子從酶分子疏水結(jié)合位點置換出來的能力不同水分子從酶分子疏水結(jié)合位點置換出來的能力不同T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 對映體選擇性對映體選擇性T溶劑幾何形狀的影響溶劑幾何形狀的影響T

52、Ottolina 報道一些脂肪酶、蛋白酶在報道一些脂肪酶、蛋白酶在 (R)-香芹酮及香芹酮及 (S)-香芹酮中對香芹酮中對底物的立體選擇性不同底物的立體選擇性不同T對映體選擇性意義對映體選擇性意義T某些酶在水相和有機(jī)相中的對映體選擇性有明顯的不同，例如，某某些酶在水相和有機(jī)相中的對映體選擇性有明顯的不同，例如，某些蛋白酶在水溶液中對些蛋白酶在水溶液中對 L-氨基酸起作用，而在有機(jī)介質(zhì)中可用氨基酸起作用，而在有機(jī)介質(zhì)中可用 D-氨基酸為底物合成手性藥物，這在醫(yī)藥行業(yè)中有重要應(yīng)用氨基酸為底物合成手性藥物，這在醫(yī)藥行業(yè)中有重要應(yīng)用T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性

53、 區(qū)域選擇性區(qū)域選擇性T區(qū)域選擇性（區(qū)域選擇性（regioselectivity） ，即酶能夠選擇性地催化底物，即酶能夠選擇性地催化底物分子中某個區(qū)域的基團(tuán)優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)分子中某個區(qū)域的基團(tuán)優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)T區(qū)域選擇系數(shù)（區(qū)域選擇系數(shù)（K1,2）/catm11,2catm2KKKKK(7-5)T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 化學(xué)鍵選擇性化學(xué)鍵選擇性T鍵選擇性（鍵選擇性（chemoselectivity），即同一個底物分子中有兩種以），即同一個底物分子中有兩種以上化學(xué)鍵可與酶反應(yīng)，酶對其中一種優(yōu)先反應(yīng)上化學(xué)鍵可與酶反應(yīng)，酶對其中一種優(yōu)先反應(yīng)T例如：例如：6-氨基

54、氨基-1-己醇的選擇性酰化己醇的選擇性?；疶鍵選擇性的意義：可在不需要基團(tuán)保護(hù)的情況下對特定部位的基鍵選擇性的意義：可在不需要基團(tuán)保護(hù)的情況下對特定部位的基團(tuán)進(jìn)行衍生化團(tuán)進(jìn)行衍生化T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性T表：部分酶在有機(jī)介質(zhì)與水溶液中半衰期比較表：部分酶在有機(jī)介質(zhì)與水溶液中半衰期比較酶酶介質(zhì)介質(zhì)熱穩(wěn)定性（半衰期）熱穩(wěn)定性（半衰期）脂蛋白脂肪酶脂蛋白脂肪酶甲苯，甲苯，90 oC，400 h活力剩余活力剩余 40%限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 Hind III正庚烷，正庚烷，55 oC，30 d活力不變活力不變 -葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶異

55、丙醇，異丙醇，50 oC，30 h活力剩余活力剩余80%核糖核酸酶核糖核酸酶壬烷，壬烷，110 oC，6 h活力剩余活力剩余95%水，水，pH 8.0，90 oCt1/2 50 d胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶正辛烷，正辛烷，100 oCt1/2 = 80 min水，水，pH 8.0，55 oCt1/2 = 15 minT有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性T表：部分酶在有機(jī)介質(zhì)與水溶液中半衰期比較表：部分酶在有機(jī)介質(zhì)與水溶液中半衰期比較酶酶介質(zhì)介質(zhì)熱穩(wěn)定性（半衰期）熱穩(wěn)定性（半衰期）豬胰脂肪酶豬胰脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯t1/2 26 h水，

56、水，pH 7.0t1/2 24 h水，水，60 oCt1/2 10 min酪氨酸酶酪氨酸酶氯仿，氯仿，50 oCt1/2 = 90 min水，水，50 oCt1/2 = 10 min細(xì)胞色素氧化酶細(xì)胞色素氧化酶甲苯，甲苯，0.3%水水t1/2 = 4.0 h甲苯，甲苯，1.3%水水t1/2 = 1.7 minT有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性T許多酶在有機(jī)介質(zhì)中的熱穩(wěn)定性比在水溶液中的好許多酶在有機(jī)介質(zhì)中的熱穩(wěn)定性比在水溶液中的好T部分酶在有機(jī)介質(zhì)中能耐受高熱部分酶在有機(jī)介質(zhì)中能耐受高熱T有機(jī)溶劑中酶的熱穩(wěn)定性還有機(jī)溶劑中酶的熱穩(wěn)定性還T解

57、釋解釋 Klibanov 和和 Volkin 認(rèn)為，由于有機(jī)溶劑中缺少使酶認(rèn)為，由于有機(jī)溶劑中缺少使酶熱失活的水分子（或含量極低），由水引起的蛋白質(zhì)熱失活的全熱失活的水分子（或含量極低），由水引起的蛋白質(zhì)熱失活的全過程難以進(jìn)行過程難以進(jìn)行T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 pH 特性特性T在有機(jī)介質(zhì)中，酶所處的在有機(jī)介質(zhì)中，酶所處的 pH 環(huán)境與酶在凍干、溶劑沉淀或吸附到環(huán)境與酶在凍干、溶劑沉淀或吸附到載體上之前所使用的載體上之前所使用的 相同，也稱相同，也稱“pH 印跡印跡”T現(xiàn)象：現(xiàn)象：Zaks 等人研究脂肪酶催化三丁酸甘油酯與正庚醇的轉(zhuǎn)酯反等人研究脂肪

58、酶催化三丁酸甘油酯與正庚醇的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，酶的反應(yīng)速度與其冷凍干燥前水溶液的應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，酶的反應(yīng)速度與其冷凍干燥前水溶液的 pH 值密切相關(guān)，值密切相關(guān)，反應(yīng)的最適反應(yīng)的最適 pH 值接近于水溶液中的最適值接近于水溶液中的最適 pH 值值T原因原因 “必需水必需水”T在有機(jī)溶劑中酶分子表面的在有機(jī)溶劑中酶分子表面的“必需水必需水”只有在特定的只有在特定的 pH 和離子強(qiáng)和離子強(qiáng)度下，酶分子活性中心周圍的基團(tuán)才能處于最佳的離子化狀態(tài)度下，酶分子活性中心周圍的基團(tuán)才能處于最佳的離子化狀態(tài)T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性 pH 特性特性T用用控制酶的解離狀態(tài)，消

59、除酶控制酶的解離狀態(tài)，消除酶 pH 印記特性的影響，印記特性的影響，稱為稱為“pH 遺忘遺忘”T有機(jī)相緩沖液（有機(jī)相緩沖液（organic phase buffer）T疏水性酸疏水性酸 + 鹽鹽 緩沖對緩沖對T疏水性堿疏水性堿 + 鹽鹽 緩沖對緩沖對T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制T(1) 酶的選擇依據(jù)酶的選擇依據(jù)T酶活力高低酶活力高低 反應(yīng)速率和反應(yīng)時間反應(yīng)速率和反應(yīng)時間T酶的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性 可重復(fù)使用的次數(shù)可重復(fù)使用的次數(shù)T酶催化的選擇性酶催化的選擇性 產(chǎn)物中某種異構(gòu)體的產(chǎn)率和純度產(chǎn)物中某種異構(gòu)體的產(chǎn)率和純度T(2) 底物的選擇和

60、濃度控制底物的選擇和濃度控制T底物的極性與溶解度底物的極性與溶解度T底物專一性的變化底物專一性的變化T底物的可接近程度底物的可接近程度 底物在溶劑與底物在溶劑與“必需水必需水”中的分配情況中的分配情況T底物的抑制情況底物的抑制情況T有機(jī)介質(zhì)中的酶催化T有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制T(3) 有機(jī)溶劑的選擇有機(jī)溶劑的選擇T溶劑極性判據(jù)溶劑極性判據(jù) 介電常數(shù)（介電常數(shù)（ ）疏水性參數(shù)（疏水性參數(shù)（lgP）T溶劑極性應(yīng)適中溶劑極性應(yīng)適中 2 lgP 5T與水混溶的有機(jī)介質(zhì)含量與水混溶的有機(jī)介質(zhì)含量 例：在二氧六環(huán)例：在二氧六環(huán) / 水體系中，辣水體系中，辣根過氧