組蛋白乙?；瘜λダ洗剖笈咛グl(fā)育影響的研究

1、組蛋白乙?；瘜λダ洗剖笈咛グl(fā)育影響的研究1前言隨著晚婚晚育政策的推行以及“二胎政策”的放開，生殖健康越來越成為人們關(guān)注的焦 點。衰老的卵子會帶來包括流產(chǎn)在內(nèi)的一系列問題，通過對衰老卵子影響因素的研究，我們 可以更好地對卵子質(zhì)量進行調(diào)控，提高生殖健康能力。為進一步探索與卵母細胞質(zhì)量相關(guān)的年齡的相關(guān)因素，我們在實驗室比較了年輕 C57BL/6雌鼠（5周）與45周雌鼠的MII卵母細胞的mRNA的各個基因表達量。通過轉(zhuǎn)錄組測 序發(fā)現(xiàn)，接近5$的母源物質(zhì)受到了年齡增長的影響。有趣的是，有很多與表觀修飾相關(guān)的轉(zhuǎn) 錄本受到了年齡增長的嚴重影響，例如DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙酷化酶等。我們的研究是通過比較不

2、同年齡雌鼠的受精胚胎的發(fā)育能力發(fā)現(xiàn)哀老雌鼠的生殖能力出 現(xiàn)明顯下降，并出現(xiàn)流產(chǎn)、妊娠率低等現(xiàn)象。該研究通過在體內(nèi)和體外模擬方式明確了乙酰 化升高是卵母細胞衰老造成動物流產(chǎn)、妊娠率低的一個重要原因，并且乙?；纳吒淖兞?眾多基因的表達，從而為人們提高對卵母細胞衰老認識、進行胚胎質(zhì)量控制提供重要的證據(jù)。2方法1.1 CD-1雌鼠受精卵的獲取我們選取了 810周齡的CD-1雌鼠獲取受精卵和實驗用卵母細胞。1.2 2w外TSA處理通過對實驗受體分別做添加去乙?；敢种苿㏕SA,和不加TSR處理，放入胚胎培養(yǎng)箱 觀察發(fā)育。囊胚后移植至假孕體內(nèi)觀察體內(nèi)發(fā)育。1.3 假孕雌鼠的制備挑選健康8周齡左右性成熟

3、雌性CD-1品系雌鼠，與同品系輸精管結(jié)扎公鼠合籠交配。 之后通過檢栓，挑選出假孕雌鼠。1.4 雌鼠胚胎移植對雌鼠進行全身麻醉后，將要移植的囊胚注入假孕鼠輸卵管膨大部中。1.5 免疫熒光染色將要染色的胚胎.按流程進行清洗、染色。2. 2. 6 PCR 檢測按配方進行PCR鑒定。3數(shù)據(jù)分析3.1衰老雌鼠生殖能力下降3. 1.1衰老雌鼠受精卵質(zhì)量差我們選取6周和14個月大的CD-1雌鼠作為研究對象。通過超數(shù)排卵的手段對兩種雌性 雌鼠進行激素調(diào)節(jié)，隨后在注射完HCG后，將超數(shù)排卵的雌鼠與雄鼠進行合籠，利用輸卵管 沖洗的辦法取出受精卵。通過在高倍光鏡下檢測，我們發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的受精卵胞質(zhì)發(fā)黑，并 呈顆?；?/p>

4、。該結(jié)果說明受精卵的質(zhì)量隨著雌鼠年齡的增長而變差。3.1. 2衰老雌鼠早期胚胎發(fā)育效率低下我們分別取年輕雌鼠（8周）和衰老雌鼠（14月）的受精卵進行體外培養(yǎng)觀察。我們發(fā) 現(xiàn)衰老雌鼠的胚胎發(fā)育率隨著細胞分裂次數(shù)的增多，逐漸下降（佟|3-1）。囊胚率約為年輕雌 鼠的一半。該結(jié)果表明隨著雌鼠年齡的增長，雌鼠早期胚胎發(fā)育能力下降。3 . 1. 3衰老雌鼠胚胎具有妊娠率低并出現(xiàn)胎兒流產(chǎn)畸形的特點為了更好地排除衰老個體對胚胎發(fā)育的影響，我們所選取的假孕均為同一周齡，即均為 8周雌鼠。我們分別向假孕雌鼠體內(nèi)移植衰老雌鼠胚胎51枚，年輕雌鼠胚胎16枚c在雌鼠 孕期19. 5dpc的時候，檢測胎兒出生。我們發(fā)現(xiàn)

5、移植了衰老雌鼠胚胎的假孕雌鼠有兩個胎兒 出生，而移植了年輕雌鼠胚胎的假孕有10只胎兒出生，衰老雌鼠胚胎嚴重降低了胎兒的出生 率及妊娠率。4 .2高組蛋白乙酰化水平是衰老雌鼠胚胎生殖異常的一個主要原因3. 2.1衰老雌鼠胚胎的乙?；缴哂绊懰ダ洗剖笈咛グl(fā)育能力低下的因素有很多。我們將研究的重點關(guān)注在基因組的表觀 修飾上來。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化和組蛋白乙?；?。通過賴氨酸乙酰化的免疫熒光 染色，我們發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的乙?；旧臒晒鈴姸葮O高（圖3-2）。初步證明了衰老雌鼠的乙 酰化程度增高。3. 2. 2增加年輕雌鼠乙?；潭全@得與衰老雌鼠一樣生理表型我們嘗試在體外培養(yǎng)環(huán)境下，增加年輕雌鼠

6、胚胎的乙?；潭冗M行體外模擬實驗。TSA是 一種去乙?；敢种苿?，通過向胚胎培養(yǎng)液中添加該試劑，可以顯著提升胚胎的乙?；潭?。 隨后，我們通過向同為8周雌鼠的胚胎培養(yǎng)液中添加TSA來增加年輕雌鼠胚胎的乙酰化程度。通過對到期雌鼠出生個數(shù)的比較，我們發(fā)現(xiàn)TSA處理后的年輕胚胎的雌鼠到期效率和年 老雌鼠一致（圖3-3）。實驗結(jié)果說明，乙酰化程度升高后年輕雌鼠胚胎獲得了和年老雌鼠胚胎一致的生理表型。3. 2. 3 TSA處理的年輕雌鼠胚胎具有和年老雌鼠類似的乙?；潭葹榱舜_定是否TSA處理后年輕雌鼠胚胎的乙酰化程度和年老雌鼠類似，我們通過免疫熒 光的手段對胚胎進行染色。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過TSA處理后的雌鼠胚胎，

7、具有了和年老雌鼠相類似的乙 ?；潭?。結(jié)果說明，乙?；潭雀淖兪撬ダ洗剖笈咛ベ|(zhì)量變差的一個重要原因。4. 3乙酰化程度改變導(dǎo)致了一些關(guān)鍵性基因表達量改變?yōu)榱颂骄恳阴；潭雀淖優(yōu)槭裁磿斐蓜游锪鳟a(chǎn)等現(xiàn)象，我們利用qpcr技術(shù)對年輕、年 老、TSA處理的胚胎受精卵進行了基因表達量的鑒定，通過鑒定，我們發(fā)現(xiàn)包括PeglO在內(nèi) 的多個對胚胎發(fā)育到期的重要基因的表達量相對于野生型較高，并存在顯著差異（圖3-4）o 因此，乙?；潭雀淖兒苡锌赡苁窃鰪娏硕鄠€關(guān)鍵性基因的表達，從而導(dǎo)致基因表達紊亂， 造成了胎兒發(fā)育雌鼠問題與障礙。4結(jié)論1 .衰老雌鼠胚胎的乙?；皆龈?；2 .通過體外模擬發(fā)現(xiàn)乙酰化水平升高是造成衰老雌鼠胚胎發(fā)育能力下降的一個主要原因:3 .乙?；潭?/p>