產(chǎn)品信息和操作指南((1)

1、.產(chǎn)品信息和操作指南mouse IFN-g預包被 ELISA kitCat# : DKW12-2000-048 / DKW12-2000-096本試劑盒專用于科研，而非用于診斷mouse IFN-gDKW12-2000:目 錄產(chǎn)品簡介 1知識背景 1試劑盒提供的試劑 2需要實驗者自行準備的試劑與儀器 2注意事項 3試劑的配制 5操作過程 7結(jié)果分析 9試劑盒的保存 9操作步驟一覽表 10參考文獻 11ELISA測定中可能會出現(xiàn)的問題及解決方法12預包被ELISA 試劑盒系列產(chǎn)品 151、 產(chǎn)品簡介：Quick EIATM小鼠IFN-g ELISA試劑盒是通過酶聯(lián)免疫吸附技術，定量檢測細胞培養(yǎng)上

2、清液和小鼠血清、血漿和其他體液中天然和重組IFN-g 的濃度。本試劑盒為預包被板，“夾心一步”完成，整個過程孵育時間不超過2.5hr，洗滌8次，操作時間大大減少。本試劑盒專用于科研，而非用于診斷。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑盒組分，若有任何疑問請與達科為生物技術有限公司聯(lián)系，E-mail：RD. 檢測范圍：5007.8pg/ml靈敏度：5 pg/ml重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均10。2、 知識背景：IFN-，亦稱為型干擾素，1965年Wheelock等首先發(fā)現(xiàn)其是由有絲分裂原活化的T淋巴細胞分泌的一種抗病毒活性物質(zhì)（1）。該蛋白與IFN-或各種IFN-家族蛋白沒有顯著的同源性。IFN-主要

3、由T淋巴細胞和自然殺傷細胞分泌，其分泌是由抗原刺激和細胞因子如IL-12誘導產(chǎn)生的（2）。- 1 -3、 試劑盒提供的試劑：試劑規(guī)格配制Cytokine standard2/1瓶*干粉狀，按瓶上說明操作Biotinylated antibody2/1瓶*1：100用Dilution buffer R（1×）稀釋Streptavidin-HRP2/1瓶*1：100用Dilution buffer R（1×）稀釋Dilution buffer R（1×）3/2瓶*即用型Washing buffer（50×）1瓶150 用蒸餾水稀釋TMB1瓶即用型Stop s

4、olution1瓶即用型Precoated ELISA plate8×12或8×6*即用型封板膜2/1張*即用型說明書1份*：96/48 Tests4、 需要實驗者自行準備的試劑與儀器：1 酶標儀（建議參考儀器使用說明提前預熱）2 微量加液器及吸頭：P10，P50，P100，P200，P10003 蒸餾水或去離子水4 全新濾紙5 旋渦振蕩器和磁力攪拌器6 37度溫箱5、 注意事項：1 試劑應按瓶上標簽說明儲存，使用前室溫平衡20-30min。實驗前室溫平衡對Washing buffer（50×）、Dilution buffer R（1×）、Precoat

5、ed ELISA plate和TMB有重要意義。2 凍干標準品冰上操作，用無菌蒸餾水溶解干粉，充分混勻，按照一次使用量分裝，-20貯存，避免反復凍融。3 預包被板條使用前，請恢復到室溫后再打開外包裝袋，實驗中不用的板條立即放回包裝中，密閉封口，4可保存1個月。其余不用試劑應包裝好或蓋好。4 Washing buffer（50×）在4保存可能有結(jié)晶析出，使用前務必使結(jié)晶完全溶解后（如加熱、平衡溫度后混勻等）再配置成Washing buffer（1×）工作液。5 HRP和檢測抗體體積量很小，使用前請高速短暫離心管子，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。6 實驗操作中請使用一次性的吸

6、頭，避免交叉污染。7 使用前檢查試劑盒內(nèi)各種試劑；試劑稀釋、加樣和中止反應充分混勻或者搖勻?qū)嶒灲Y(jié)果尤為重要，最好使用低速頻率振蕩器或者反應過程中每15分鐘手工搖勻一次。8 實驗板孔加入試劑的順序應一致，以保證所有反應孔的孵育時間一致。9 使用潔凈的塑料容器盛裝洗滌液。10 洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，濾紙上看不到水印。勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。11 TMB對光敏感，避免長時間暴露于光下，避免金屬接觸影響結(jié)果。有毒，避免用手接觸！準備使用的TMB若變?yōu)樗{色，表明TMB已經(jīng)污染，請丟棄。請在終止反應后10min內(nèi)讀取OD值。12 請嚴格按照說明書標明的時間和溫度進行孵育

7、。冬季室內(nèi)溫度偏低，請使用恒溫箱或培養(yǎng)箱孵育為好。13 試劑盒在保質(zhì)期內(nèi)使用，且不同批號試劑不要混用。14 500pg/ml以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結(jié)果。大于500pg/ml IFN-g的樣品應以Dilution buffer R(1×)稀釋后重做。在結(jié)果分析時，結(jié)合考慮相應的稀釋度。15 特異性：不與小鼠其它細胞因子反應6、試劑的配制：1 提前20分鐘將Washing buffer(50×)和即用溶液從試劑盒中取出，以平衡至室溫。2. Cytokine standard：Standard為凍干粉。先按標簽說明將凍干粉溶解，靜置510分鐘，再用Di

8、lution buffer R（1×）稀釋到推薦檢測濃度。標準品溶解后混勻，準確倍比稀釋，嚴格操作非常重要。標準品的倍比稀釋最好在進口的或者硅化的EP管中完成，減少非特異性吸附。在實驗孔內(nèi)進行倍比稀釋時，注意操作規(guī)范，槍頭勿刮劃預包被的孔底。母液若沒有用完請按照一次用量分裝，-20保存。* 推薦標準品濃度梯度為：500 pg/ml、250pg/ml、125 pg/ml、62.5pg/ml、31.3 pg/ml、15.6 pg/ml、7.8pg/ml。3. Biotinylated antibody：1100用 Dilution buffer R(1×)稀釋，混勻制成1

9、15;antibody工作液。4. Streptavidin-HRP ：1100用Dilution buffer R(1×)稀釋，混勻制成1×HRP工作液。5. Washing buffer(50×)：150 用蒸餾水稀釋。6. 即用型溶液Ø Dilution buffer R(1×): 用于稀釋Biotinylated antibody、Streptavidin-HRP和Cytokine standard。Ø TMBØ Stop solution - 8 -7、操作過程：1. 使用前，將所有試劑充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。2.

10、 根據(jù)實驗孔（空白和標準品）數(shù)量，確定所需的板條數(shù)目。樣品（含標準品）和空白都應做復孔。3. 加樣：100ul/well加入稀釋后的Cytokine standard至標準品孔，100ul/well加入樣品至樣品孔，設置空白孔，用Dilution buffer R (1×)代替樣本和標準品。4. 加檢測抗體：50ul/well加入稀釋后的Biotinylated antibody?；靹蚝?，蓋上封板膜，37溫育90min。5. 洗板：扣去孔內(nèi)液體，300ul/well加入1×washing buffer；停留1min后棄去孔內(nèi)液體。重復4次，每一次在濾紙上扣干。6. 加酶：1

11、00ul/well加入稀釋后的Streptavidin-HRP。蓋上封板膜，37溫育30min。7. 洗板：重復步驟5。8. 顯色：100ul/well加入TMB，37避光溫育5-30min之間，根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺（深藍色）來判定終止反應。通常顯色在10-20min可以達到很好的效果。9. 終止反應： 100ul/well迅速加入Stop solution 終止反應。10. 讀板：終止后10分鐘內(nèi)，用檢測波長（measurement wavelength）450nm讀值。推薦用雙波長即檢測波長（measurement wavelength）450nm、參考波長或校正波長（reference w

12、avelength）610-630nm同時讀板，測量結(jié)果會更準確。8、結(jié)果分析：1. 有兩種設定空白對照的方案：1) 將TMB空白顯色孔設為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去空白孔的吸光值后，在坐標紙上畫出曲線，以吸光值作為縱坐標，以濃度作為橫坐標。2) 將零孔設為對照。得到的數(shù)據(jù)可以直接在坐標紙上畫出曲線。2. 根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。 注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線來計算標本含量。9、試劑盒的保存：4ºC可穩(wěn)定保存6個月。10、操作步驟

13、一覽表：無需孵育，直接進行下一步操作加樣品或配好的標準品，設置對照，100ml/well 37 溫育90min；洗4次加生物素標記的抗體，50ml/well，混勻 37 溫育30min；洗4次加親和素-HRP 標記物，100ml/well 加TMB顯色液，100ml/well37 顯色10-20min 10min內(nèi)讀板加Stop solution 100ml/well，終止反應 在450nm處讀取吸光值11、參考文獻（1） Wheelock, E.F. (1965) Science. 146:310.（2） Magram, J. et al. (1996) Immunity. 4:471.（3

14、） 曾潔 等. 武漢大學學報(醫(yī)學版). 2007, 28(1): 77-80.（4） 左慧敏 等. 中國實用兒科雜志. 2008, 23(4): 269-271.（5） 曹帆帆 等. 中國輸血雜志. 2007, 20(6): 498-500.（6） 周曉莉 等. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志. 2008, 3(2): 80-82.（7） 鄧曉芳 等. 廣州醫(yī)學院學報. 2006, 34(3): 6-8.（8） 鄒文雄 等. 嶺南心血管病雜志. 2006, 12(3): 178-181.- 11 -12、ELISA測定中可能會出現(xiàn)的問題及解決方法問 題可能的原因解決方法1非常弱的結(jié)果（1）溫育的時間或溫

15、度不夠；（2）顯色反應時間太短；（3）所用配制緩沖液的蒸餾水有問題；（4）加入抗體/酶的稀釋液濃度太低；（5）酶標儀濾光片不正確；（6）不正確的試劑儲存方式；（7）試劑盒沒有充分平衡；（8）移液器吸液量不足，吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔。a. 校正溫育箱溫度；b. 校正定時鐘準確定時；c. 使用新鮮合格的蒸餾水；d. 按照說明書保存試劑盒和準確配制工作液；e. 試劑室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25）；f. 校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密，吸嘴內(nèi)壁要清潔，最好一次性使用。- 18 -2標準曲線和測定的重復性差這是典型的由測定操作引起的問題，包括（1）加樣本及試劑量不

16、準；孔間不一致；（2）加樣過快，孔間發(fā)生污染；（3）加錯樣本；（4）加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區(qū)；（5）不同批號試劑盒中組分混用；（6）溫育時間、洗板、顯色時間不一致；（7）孔內(nèi)污染雜物；（8）酶標儀濾光片不正確；（9）試劑/樣品沒有混勻；（10）血清標本未完全凝固即加入，反應孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現(xiàn)假陽性反應等。a. 重復某一樣品時，加樣時間盡可能與第一次接近；b. 重復測定標本，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；c. 樣品稀釋前應充分混勻；d. 盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴。3白板（陽性對照不顯色）（1）漏加酶結(jié)合物；（2

17、）洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等；（3）添加的試劑錯誤或者被遺漏；（4）試劑過期；a. 請按說明書所示稀釋倍數(shù)配制；b. 注意不要漏加；c. 每次加液前均應核對標簽。4空白背景高（1）洗板不干凈；（2）顯色液變質(zhì)；（3）試劑過期；（4）不正確的試劑稀釋液，如加酶的濃度過高；（5）蒸餾水受酶等污染；（6）試劑混用；（7）培養(yǎng)箱溫度超過37或反應時間過長。a. 濃縮洗液準確配制；b. 50倍濃縮洗滌液如有結(jié)晶則應讓結(jié)晶于室溫全部溶解后再量取稀釋；c. 充分洗滌，徹底拍干；d. 加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用，不要反復使用，否則易造成污染；e. 吸嘴盡可能一次性使用；f

18、. 使用新鮮蒸餾水；g. 不同批號試劑勿混用；h. 請按說明書所示稀釋倍數(shù)配制；i. 顯色反應時間適當縮短。13、預包被ELISA試劑盒系列產(chǎn)品Quick EIATM 小鼠ELISA試劑盒DKW12-2000-048Mouse IFN- ELISA kit（預包被減步法）48TDKW12-2000-09696TDKW12-2011-048Mouse IL-1 ELISA kit（預包被減步法）48TDKW12-2011-09696TDKW12-2012-048Mouse IL-1 ELISA kit（預包被減步法）48TDKW12-2012-09696TDKW12-2020-048Mouse

19、IL-2 ELISA kit（預包被減步法）48TDKW12-2020-09696TDKW12-2040-048Mouse IL-4 ELISA kit（預包被減步法）48TDKW12-2040-09696TDKW12-2050-048Mouse IL-5 ELISA kit（預包被減步法）48TDKW12-2050-09696TDKW12-2060-048Mouse IL-6 ELISA kit （預包被減步法）48TDKW12-2060-09696TDKW12-2100-048Mouse IL-10 ELISA kit（預包被減步法）48TDKW12-2100-09696TDKW12-21

20、20-048Mouse IL-12 p70 ELISA kit（預包被減步法）48TDKW12-2120-09696TDKW12-2123-048Mouse IL-12/IL-23 p40 ELISA kit（預包被減步法）48TDKW12-2123-09696TDKW12-2170-048Mouse IL-17A ELISA kit（預包被減步法）48TDKW12-2170-09696TDKW12-2710-048Mouse TGF-1 ELISA kit（預包被）48TDKW12-2710-09696TDKW12-2720-048Mouse TNF- ELISA kit（預包被減步法）48

21、TDKW12-2720-09696TDKW12-2734-048Mouse VEGF-A ELISA kit（預包被）48TDKW12-2734-09696TDKW12-2820-048Mouse IgE ELISA kit（預包被）48TDKW12-2820-09696TQuick EIATM 人ELISA試劑盒DKW12-1000-048Human IFN- ELISA Kit（預包被減步法）48TDKW12-1000-09696TDKW12-1012-048Human IL-1 ELISA Kit （預包被減步法）48TDKW12-1012-09696TDKW12-1020-048Hum

22、an IL-2 ELISA Kit （預包被減步法）48TDKW12-1020-09696TDKW12-1040-048Human IL-4 ELISA Kit（預包被）48TDKW12-1040-09696TDKW12-1060-048Human IL-6 ELISA Kit（預包被減步法）48TDKW12-1060-09696TDKW12-1080-048Human IL-8 ELISA Kit（預包被減步法）48TDKW12-1080-09696TDKW12-1100-048Human IL-10 ELISA Kit（預包被減步法）48TDKW12-1100-09696TDKW12-11

23、20-048Human IL-12p70 ELISA Kit（預包被減步法）48TDKW12-1120-09696TDKW12-1170-048Human IL-17A ELISA Kit（預包被）48TDKW12-1170-09696TDKW12-1325-048Human sIL-2R ELISA Kit（預包被）48TDKW12-1325-09696TDKW12-1530-048Human Adiponectin ELISA Kit（預包被）48TDKW12-1530-09696TDKW12-1710-048Human TGF-1 ELISA Kit（預包被）48TDKW12-1710-09696TDKW12-1720-048Human TNF- ELISA Kit（預包被減步法）48TDKW12-1720-09696TDKW12-1730-048Human GM-CSF ELISA Kit（預包被）48TDKW12-1730-09696TDKW12-1731-048Human G-CSF ELISA Kit（預包被）48TDKW12-1731-09696TDKW12-1734-048Human VEGF-A ELISA Kit（預包被）48TDKW12-1734-09696TDKW12