細(xì)胞培養(yǎng)工程 02B 相關(guān)細(xì)胞生理

1、1前言 決定重組蛋白質(zhì)表達(dá)的主要因素 表達(dá)載體 表達(dá)載體整合位點(diǎn)：宿主細(xì)胞染色體轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)低于 3% 克隆篩選 合成蛋白質(zhì)產(chǎn)物的能力的評(píng)估 單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的數(shù)量 經(jīng)克隆篩選后，細(xì)胞株為單克隆，其合表達(dá)能力基本上已經(jīng)達(dá)到上限，進(jìn)一步重復(fù)篩選、提高產(chǎn)率的空間不大 過(guò)程開發(fā)與優(yōu)化 確定產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系 通過(guò)反應(yīng)器操作與培養(yǎng)基優(yōu)化， （1）提高活細(xì)胞密度 （2）延長(zhǎng)高密度培養(yǎng)時(shí)間1P=qpCv(t)dt0t細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)2代謝途徑 代謝途徑 胞內(nèi)生化反應(yīng)是在酶催化作用下完成胞內(nèi)生化反應(yīng)不是獨(dú)立的，而是相互聯(lián)系、并接受調(diào)節(jié)（如負(fù)反饋抑制），一個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物往往就是下一個(gè)反應(yīng)的

2、底物，由此構(gòu)成的一連串生化反應(yīng)，即代謝途徑細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)3生物體內(nèi)代謝活動(dòng)主要分類 分解代謝 由較大分子（多糖、蛋白質(zhì)、脂類等）降解為小分子（如 CO2、NH3、H2O、氨基酸、單糖）的過(guò)程 作用 為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量 為合成代謝提供多種前體物質(zhì) 合成代謝 由小分子（如氨基酸等）合成大分子（如蛋白質(zhì)）的過(guò)程 作用 產(chǎn)生重要的產(chǎn)物 為機(jī)體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成提供必要的大分子物質(zhì) 需要能量細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)4正常機(jī)體的能量代謝 在正常機(jī)體內(nèi)代謝受嚴(yán)格調(diào)控，處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài) 代謝途徑中關(guān)鍵限速酶的活性調(diào)節(jié)（酶活性）和合成調(diào)控（酶數(shù)量）是代謝調(diào)節(jié)主要方式 機(jī)體內(nèi)代謝調(diào)控層次 整體水平：主要通

3、過(guò)神經(jīng) - 內(nèi)分泌系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn) 細(xì)胞水平：主要由代謝底物、產(chǎn)物的多少來(lái)完成細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)5Glycerol Alanine LactateIntestinePancreasTriose phosphate Glucose Glycogen GlucosePyruvateGlucoseInsulinGlucose Glucose UDP-Glucose GlycogenGlucose TG GlycerolRBScAdiposeMuscleLiverLactateAlanine人體通常狀態(tài)人體通常狀態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)6Glucose GlycogenFA CO2TG FAAdipos

4、eMuscleLiverFatty acidsGlucoseGlucose CO2Brain人體饑餓狀態(tài)人體饑餓狀態(tài)FA CO2Kidney細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)7細(xì)胞體外培養(yǎng)代謝 在體外培養(yǎng)中，由于缺少整體水平的代謝調(diào)節(jié)和組織間的代謝協(xié)調(diào)作用，細(xì)胞自身代謝失去嚴(yán)格調(diào)節(jié)，常常出現(xiàn)代謝溢流，導(dǎo)致副產(chǎn)物積累，不但浪費(fèi)原料、惡化細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，而且降低細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的效率和產(chǎn)率 體內(nèi) 空腹血糖：3.9 - 6.2 mM 餐后 1 小時(shí)： 7.8 - 9.0 mM 餐后 2 小時(shí)： 3.9 - 7.8 mM 細(xì)胞培養(yǎng)： 一般低于 25 mM 在體外培養(yǎng)中，大多數(shù)細(xì)胞往往不能利用大分子營(yíng)養(yǎng)物，而是以小分子如

5、葡萄糖、氨基酸作為代謝的起點(diǎn)底物，通過(guò)糖酵解、三羧酸循環(huán)等能量代謝途徑，分解葡萄糖或氨基酸，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成提供必需的能量細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)8細(xì)胞體外培養(yǎng)代謝 能量代謝以及其它代謝途徑（如磷酸戊糖途徑）的中間代謝產(chǎn)物，是合成代謝的前體物質(zhì) 分解代謝是一個(gè)發(fā)散的過(guò)程，而合成代謝是一個(gè)集合過(guò)程 合成代謝一般不是分解代謝的簡(jiǎn)單逆向反應(yīng)，而是由不同酶催化，通常需要消耗 ATP，并以NADPH 為主要的還原供氫體 了解體外培養(yǎng)細(xì)胞的代謝特點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上提出相應(yīng)的代謝調(diào)節(jié)策略，對(duì)提高細(xì)胞培養(yǎng)的效率具有重要意義細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)9糖代謝 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn) 葡萄糖不能以直接擴(kuò)散方式進(jìn)入細(xì)胞 在動(dòng)物

6、體內(nèi)，葡萄糖可以通過(guò)與 Na+ 共轉(zhuǎn)運(yùn)方式，逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，但需要耗能 通過(guò)細(xì)胞膜上特定轉(zhuǎn)運(yùn)載體（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子）將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，順濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，不需要耗能 在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，葡萄糖主要通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子進(jìn)入細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)10糖代謝 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì) 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì) 膜蛋白質(zhì)，協(xié)助葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn) 至少有 5 種亞型 （GLUT-1 to 5） Glut 2： 細(xì)胞 / 肝臟 Glut 4：脂肪組織 / 肌肉組織；當(dāng)在胰島素與脂肪、肌肉細(xì)胞表面胰島素受體結(jié)合之后，引起 GLUT-4 外遷至細(xì)胞表面，加速葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)（吸收） 對(duì)葡萄糖的親和力：Km 值約為 5 mM 除

7、脂肪和肌肉組織外，一般細(xì)胞內(nèi)外葡萄糖處于平衡狀態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)11糖代謝 葡萄糖磷酸化 已糖激酶 催化糖酵解途徑的第一個(gè)不可逆反應(yīng) 作用：催化葡萄糖、果糖、甘露糖、氨基葡萄糖的磷酸化反應(yīng)（不可逆），生成相應(yīng)的 6-磷酸酯，使其不再逸出 需要消耗 ATP 和反應(yīng)激活劑 Mg2+ 類型： 同工酶 I-III 型主要存在于肝外組織，對(duì)葡萄糖的 Km 值為 10-3 - 10-2 mM，但對(duì)果糖親和力很低 同工酶 IV 型主要存在于肝臟，特稱葡萄糖激酶，對(duì)葡萄糖的 Km 值為10-2 - 1 M細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)12己糖激酶（不可逆）磷酸己糖異構(gòu)酶磷酸果糖激酶（不可逆）醛縮酶磷酸甘油醛酸激

8、酶磷酸甘油醛脫氫酶磷酸甘油酸變位酶烯醇酶丙酮酸激酶（不可逆）糖酵解途徑葡萄糖 + 2 ADP + 2 NAD+2 丙酮酸 + 2 ATP + 2 NADHNAD 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化型輔酶 I）NADH （還原性輔酶 I ）細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)13有氧氧化 - 三羧酸循環(huán)FAD 黃素腺嘌呤二核苷酸FADH 乙酰CoA3 NADH + GTP + FADH + 2 CO2細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)14缺氧氧化 乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶丙酮酸 + NADH 乳酸細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)15有氧氧化 - 呼吸鏈線粒體內(nèi)缺氧氧化：葡萄糖 2 乳酸 + 2 ATP有氧氧化：葡萄糖 6 CO2 + 36 A

9、TP細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)16體外培養(yǎng) - 三羧酸循環(huán)丙酮酸羧化酶哺乳動(dòng)物細(xì)胞株缺乏或者酶活力低進(jìn)入TCA 循環(huán)比例低乳酸比例高細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)17氨基酸代謝 氨基酸底物特性 體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞一般只利用氨基酸、二肽或小分子寡肽，不能利用蛋白質(zhì)作為細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物 氨基酸代謝類型 合成代謝：多肽、蛋白質(zhì)及其它含氮物質(zhì)合成 分解代謝：為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量 氨基酸分類 必需氨基酸：構(gòu)成人體蛋白質(zhì)的氨基酸中，有些不能直接在人體合成，只能在植物及微生物體內(nèi)合成，并通過(guò)食物攝取進(jìn)入人體 非必需氨基酸：其余的氨基酸可利用代謝中間產(chǎn)物合成，或者由必需氨基酸轉(zhuǎn)化而成細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)18氨基酸代

10、謝 細(xì)胞體外培養(yǎng) 細(xì)胞直接利用培養(yǎng)基中的氨基酸，而無(wú)需合成 氨基酸的代謝調(diào)控主要是針對(duì)氨基酸的合理利用 氨基酸通過(guò)分解、氨基轉(zhuǎn)移或其他途徑，也可生成其它氨基酸（如丙氨酸、谷氨酸），因此大多數(shù)培養(yǎng)基不包括這些氨基酸，其中丙氨酸也是細(xì)胞培養(yǎng)中典型的代謝副產(chǎn)物 由于細(xì)胞對(duì)于某些氨基酸有較高數(shù)量要求，細(xì)胞生物合成不能滿足需要，因此體現(xiàn)“必需氨基酸”特征細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)19氨基酸代謝 氨基酸結(jié)構(gòu) - 氨基 - 羧基 不同的側(cè)鏈基團(tuán)（R） 不同的氨基酸結(jié)構(gòu)不同，因此它們的代謝也有各自的特點(diǎn) 分解代謝的主要途徑是脫氨基或轉(zhuǎn)氨基，生成相應(yīng)的 - 酮酸、氨或另一種氨基酸 氨具有明顯的細(xì)胞毒性，在體內(nèi)主要以

11、尿素形式排出 在體外培養(yǎng)中，氨作為代謝終產(chǎn)物而在培養(yǎng)環(huán)境中積累 氨基酸在脫氨基后生成的酮酸可進(jìn)一步氧化分解，生成 CO2 和 H2O 并提供能量細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)20氨基酸的脫氨基作用（1） 氨基酸在酶的催化下脫去氨基生成 -酮酸的過(guò)程 氧化脫氨基作用氧化脫氨基作用：在酶的催化下，氨基酸在氧化脫氫的同時(shí)脫去氨基的過(guò)程 如谷氨酸在線粒體中由谷氨酸脫氫酶催化氧化脫氨 該反應(yīng)為可逆反應(yīng)。一般情況下偏向于谷氨酸的合成，但當(dāng)谷氨酸濃度高而 NH3 濃度低時(shí)，則有利于脫氨和 -酮戊二酸的生成。在細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，谷氨酸的代謝也受到谷氨酰胺濃度的影響。細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)21氨基酸的脫氨基作用（2）

12、轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)氨基作用：在轉(zhuǎn)氨酶催化下，將 -氨基酸的氨基轉(zhuǎn)給另一個(gè) -酮酸，生成相應(yīng)的 -酮酸和一種新的 -氨基酸。除甘氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和脯氨酸不參加轉(zhuǎn)氨基作用外，其余均可由特異的轉(zhuǎn)氨酶催化參加轉(zhuǎn)氨基作用。細(xì)胞培養(yǎng)中，最重要的氨基受體是 -酮戊二酸、丙酮酸和草酰乙酸，生成相應(yīng)的谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸。在體外培養(yǎng)細(xì)胞中，由于有豐富的丙酮酸來(lái)源，主要的氨基酸代謝副產(chǎn)物是丙氨酸。丙氨酸的積累不會(huì)給細(xì)胞培養(yǎng)帶來(lái)不良的副作用，而脫氨產(chǎn)生的游離氨達(dá)到一定濃度時(shí)，可帶來(lái)嚴(yán)重的細(xì)胞毒性作用。細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)22氨基酸的脫氨基作用（3） 聯(lián)合脫氨基作用聯(lián)合脫氨基作用 由 L-谷氨酸脫氫酶和轉(zhuǎn)氨酶聯(lián)合

13、催化的聯(lián)合脫氨基作用 在轉(zhuǎn)氨酶催化下，將某種氨基酸的 -氨基轉(zhuǎn)移到 -酮戊二酸上生成谷氨酸；然后，在 L-谷氨酸脫氫酶作用下，將谷氨酸氧化脫氨生成 -酮戊二酸，而 -酮戊二酸再繼續(xù)參加轉(zhuǎn)氨基作用（可逆反應(yīng)） 嘌呤核苷酸循環(huán) 骨骼肌和心肌中含豐富的腺苷酸脫氨酶，能催化腺苷酸加水、脫氨生成次黃嘌呤核苷酸（IMP）。一種氨基酸經(jīng)過(guò)兩次轉(zhuǎn)氨作用可將 -氨基轉(zhuǎn)移至草酰乙酸生成天冬氨酸，天冬氨酸又可將此氨基轉(zhuǎn)移到次黃嘌呤核苷酸上生成腺嘌呤核苷酸（不可逆反應(yīng)） 該代謝途徑將氨基酸代謝與糖代謝、脂代謝、核苷酸代謝聯(lián)系起來(lái)23 非氧化脫氨基作用非氧化脫氨基作用脫水脫氨基 絲氨酸可在絲氨酸脫水酶的催化下生成氨和丙

14、酮酸。蘇氨酸在蘇氨酸脫水酶的作用下，生成 -酮丁酸，再經(jīng)丙酰輔酶 A 和琥珀酰 CoA 參加代謝脫硫化氫脫氨基 半胱氨酸可在脫硫化氫酶的催化下生成丙酮酸和氨直接脫氨基 天冬氨酸可在天冬氨酸酶作用下直接脫氨生成延胡索酸和氨 氨基酸脫氨基代謝產(chǎn)生的游離氨將在培養(yǎng)基中積累，達(dá)到 一定的濃度時(shí)將造成對(duì)細(xì)胞的毒性作用。因此，利用過(guò)程優(yōu)化或基因工程的手段，降低培養(yǎng)中游離氨的生成是細(xì)胞培養(yǎng)工程的重要研究?jī)?nèi)容。氨基酸的脫氨基作用（4）24-酮酸的代謝（1） 氨基酸經(jīng)聯(lián)合脫氨或其他方式脫氨所生成的 - 酮酸，可經(jīng)過(guò)聯(lián)合加氨反應(yīng)生成相應(yīng)的氨基酸 8 種必需氨基酸中，除賴氨酸和蘇氨酸外，其余 6 種亦可由相應(yīng)的 -

15、酮酸加氨生成。相對(duì)應(yīng)的 -酮酸不能在體內(nèi)合成，但可氧化生成 CO2 和水，這是氨基酸作為能源物質(zhì)代謝的必要途徑。 -酮酸通過(guò)一定的反應(yīng)途徑先轉(zhuǎn)變成丙酮酸、乙酰 CoA 或三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)三羧酸循環(huán)徹底氧化分解。細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)25氨基酸代謝途徑（2）細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)26谷氨酰胺的代謝 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最重要的氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)基中重要能源物質(zhì)之一；在培養(yǎng)基中濃度最高，通常是其它氨基酸的10 倍；作為細(xì)胞生物合成中氮的主要來(lái)源，核酸中嘌呤、嘧啶和氨基糖中的氮來(lái)自谷氨酰胺；作為碳源直接參與細(xì)胞大分子物質(zhì)的合成；其存在可促進(jìn)其它氨基酸的運(yùn)輸和利用。 血清具有谷氨酰胺酶活性，產(chǎn)生氨

16、高濃度谷氨酰胺傾向于產(chǎn)生氨與乳酸，利用率低。細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)27細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的代謝調(diào)控 目的：優(yōu)化細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，降低培養(yǎng)過(guò)程中代謝副產(chǎn)物積累，提高細(xì)胞密度、產(chǎn)物產(chǎn)量和質(zhì)量 代謝調(diào)控的主要方式：培養(yǎng)基優(yōu)化：通過(guò)優(yōu)化胞外營(yíng)養(yǎng)物的濃度控制來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑或物料通量反應(yīng)器操作方式：補(bǔ)料（流加過(guò)程）1. 代謝工程：通過(guò)基因工程方法，人為干預(yù)細(xì)胞原有的代謝途徑或引入新的代謝途徑，以調(diào)節(jié)胞內(nèi)的代謝途徑或物料通量細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)28培養(yǎng)基的優(yōu)化 葡萄糖在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，葡萄糖磷酸化（糖酵解的第一步反應(yīng)）失去有效控制，速率過(guò)高，導(dǎo)致過(guò)高的糖酵解通量，因此生成大量丙酮酸能進(jìn)入 TCA 循環(huán)的

17、丙酮酸只占極少部分，大部分的丙酮酸在胞質(zhì)中積累，在乳酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成乳酸高通量的糖酵解是導(dǎo)致乳酸積累的主要原因措施：將細(xì)胞維持在較低葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中，可以減少甚至消除乳酸積累雜交瘤細(xì)胞 CRL-1606： 葡萄糖濃度控制在 2 mM 時(shí)，乳酸對(duì)葡萄糖的得率系數(shù)為 0.1 mol/mol 葡萄糖濃度控制在0.2 mM 時(shí)，乳酸對(duì)葡萄糖的得率系數(shù)為 0. 067 mol/mol 二者均低于正常培養(yǎng)過(guò)程中乳酸對(duì)葡萄糖的得率系數(shù) 注：每個(gè)葡萄糖分子最高能產(chǎn)生兩個(gè)乳酸分子細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)29培養(yǎng)基的優(yōu)化 谷氨酰胺（1） 在細(xì)胞培養(yǎng)中，谷氨酰胺不穩(wěn)定，可以自降解 如果谷氨酰胺濃度高，細(xì)胞也

18、會(huì)過(guò)量利用，導(dǎo)致氨積累 措施：控制培養(yǎng)基中的谷氨酰胺濃度，可以有效降低氨的積累，改善細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)BHK 細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng) 當(dāng)谷氨酰胺濃度為 0. 52 mM，比消耗速率 0. 5510-6 nmole/細(xì)胞/分鐘 當(dāng)谷氨酰胺濃度為 0.14 mM，比消耗速率 0.2810-6 nmole/細(xì)胞/分鐘 消耗速率的下降，導(dǎo)致氨積累濃度從 0. 6 mM 減少至 0.4 mM 與葡萄糖代謝不同，氨對(duì)谷氨酰胺的得率系數(shù)不隨著谷氨酰胺濃度的降低而降低，反而從 1.1 mol/mol 升高到 1.5 mol/mol 由于谷氨酰胺下降，培養(yǎng)基中氨的積累還是隨著谷氨酰胺濃度的下降而下降，表明在低谷氨酰胺濃度下，更多的谷氨酰胺經(jīng)過(guò)谷氨酸脫氫酶的途徑反應(yīng)，生成酮戊二酸而進(jìn)入三羧酸循環(huán)30葡萄糖與谷氨酰胺之間的相互影響 在能