基因工程載體和工具酶周五

1、【載體（ Vector）】基因工程操作中，把能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴增和表達(dá)的工具叫載體。【工具酶工具酶】是基因重組技術(shù)不可缺少的工具，主要用于核酸分子的切割、連接、聚合、修飾、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、磷酸酶和磷酸激酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等。 基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到擴增和表達(dá)，而目的基因本身無法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)、不易進(jìn)入受體細(xì)胞、不能穩(wěn)定維持，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細(xì)胞”來實現(xiàn)?！据d體載體】能載帶微量物質(zhì)共同參與某能載帶微量物質(zhì)共同參與某種化學(xué)或物理過程的常量物質(zhì)，種化學(xué)或物理過程的常量物質(zhì)，在基在基因工程操作中，把能攜

2、帶目的基因進(jìn)因工程操作中，把能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞并進(jìn)行入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴增擴增和和表達(dá)表達(dá)的工具的工具叫載體。三種最常用的載體是細(xì)菌叫載體。三種最常用的載體是細(xì)菌質(zhì)質(zhì)粒粒、噬菌體噬菌體和和植物病毒植物病毒。 （1 1）載體必須是復(fù)制子。 具有復(fù)制起始 點，最好要有 較高的自主復(fù)制能力。（2 2）有）有選擇性標(biāo)記，如抗選擇性標(biāo)記，如抗KanKan、抗、抗AmpAmp（3 3）有一段）有一段多克隆位點多克隆位點 外源外源DNADNA插入其中，不影響其復(fù)制插入其中，不影響其復(fù)制（4 4）分子量小，拷貝數(shù)多分子量小，拷貝數(shù)多（5 5）容易容易從宿主細(xì)胞中從宿主細(xì)胞中分離純化分離純化（1）載體必須

3、是復(fù)制子。 最好要有較高的自主復(fù)制能力。 【復(fù)制子（復(fù)制子（repliconreplicon）】是DNA復(fù)制時從一個DNA復(fù)制起點開始最終由這個起點起始的復(fù)制叉完成的片段。像E.coli 質(zhì)粒DNA獨立復(fù)制的單位均為復(fù)制子。 （2）有選擇性標(biāo)記抗生素抗性標(biāo)記基因:標(biāo)記基因是與外源目的基因構(gòu)建在同一表達(dá)載體上，一起轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞，而后在特定條件下幫助篩選出已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。 藍(lán)白篩選：藍(lán)白篩選： pUC19pUC19等載體攜帶細(xì)菌等載體攜帶細(xì)菌laclac操縱子中的操縱子中的lacZlacZ基因編碼，基因編碼，-半半乳糖苷酶乳糖苷酶N N端狀端狀146146個氨基酸的段落，當(dāng)培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)物個氨基酸

4、的段落，當(dāng)培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)物IPTGIPTG和和XgalXgal時，時，lacZ lacZ 基因被誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的基因被誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端肽端肽與與宿主菌表達(dá)的宿主菌表達(dá)的C C端肽互補端肽互補而具有而具有-半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性（質(zhì)（質(zhì)粒和宿主編碼的肽段各自都沒有酶活性，兩都融為一體而具酶粒和宿主編碼的肽段各自都沒有酶活性，兩都融為一體而具酶活性，稱為活性，稱為-互補互補， -complementation-complementation），），半乳糖苷酶水半乳糖苷酶水解解XgalXgal而使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色而使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；轉(zhuǎn)化空載體大腸桿菌受體菌pUC19產(chǎn)生L

5、ac Z 的N端146個氨基酸的多肽大腸桿菌產(chǎn)生Lac Z 的C端的多肽IPTG誘導(dǎo)表達(dá)LacZ（ -半乳糖苷酶）X-Gal藍(lán)色產(chǎn)物水解反應(yīng) 在在lacZ lacZ 中間又插入了一段人工設(shè)計合成的中間又插入了一段人工設(shè)計合成的DNADNA序列，其序列，其中密集多個常用的限制性核酸內(nèi)切酶的位點，使外來的基因中密集多個常用的限制性核酸內(nèi)切酶的位點，使外來的基因和序列能很方便地被插入此位置，當(dāng)和序列能很方便地被插入此位置，當(dāng)外來序列插入后則破壞外來序列插入后則破壞了了lacZ lacZ 編碼的半乳糖苷酶活性，生長的菌落就呈白色編碼的半乳糖苷酶活性，生長的菌落就呈白色，這，這種顏色標(biāo)志的變化就很容易區(qū)

6、分和挑選含有和不含有插入序種顏色標(biāo)志的變化就很容易區(qū)分和挑選含有和不含有插入序列或基因的轉(zhuǎn)化菌落，稱為列或基因的轉(zhuǎn)化菌落，稱為藍(lán)白篩選藍(lán)白篩選插入外源片段后的載體大腸桿菌受體菌pUC19產(chǎn)生Lac Z 的N端146個氨基酸被打斷的多肽大腸桿菌產(chǎn)生Lac Z 的C端的多肽IPTG誘導(dǎo)表達(dá)無LacZ產(chǎn)生X-Gal白白色色產(chǎn)產(chǎn)物物無水解反應(yīng)發(fā)生（3 3）有一段多克隆位點）有一段多克隆位點多克隆位點（多克隆位點（multiple cloning site, MCS），），是包含多個（最多20個）限制性酶切位點（restriction site）的一段很短的DNA序列。也稱為多位點接頭（polylink

7、er），是基因工程中常用到的載體質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)配置序列。MCS中，每個限制性酶切位點通常是唯一的，即它們在一個特定的載體質(zhì)粒中只出現(xiàn)一次。 （4 4）分子量小，拷貝數(shù)多。分子量小，拷貝數(shù)多。（5 5）在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，容易容易從宿主從宿主細(xì)胞中細(xì)胞中分離純化。分離純化?？寺≥d體克隆載體: : 克隆一個基因或克隆一個基因或DNADNA片斷片斷表達(dá)載體表達(dá)載體: : 用于一個基因的蛋白表達(dá)用于一個基因的蛋白表達(dá)整合載體整合載體: : 把一個基因插入到染色體組中把一個基因插入到染色體組中(1)(1)按功能分按功能分A.【克隆載體克隆載體】克隆一個基因或克隆一個基因或DNA片斷，如片斷，如T載體等。載

8、體等。 pUCm-T載體載體 (pUCm-T Vector) ：是用于克隆含有A末端PCR產(chǎn)物的理想載體?？梢酝ㄟ^藍(lán)白斑篩選有插入片斷的重組克隆。 TA克?。涸S多高溫許多高溫DNA聚合酶，擴增的聚合酶，擴增的PCR產(chǎn)物產(chǎn)物3-末端都帶末端都帶有一個突出堿基有一個突出堿基A；pUCm-T載體是兩端各帶有一個載體是兩端各帶有一個突出堿基突出堿基T的雙鏈線性質(zhì)粒，與的雙鏈線性質(zhì)粒，與PCR產(chǎn)物可準(zhǔn)確地形產(chǎn)物可準(zhǔn)確地形成環(huán)狀質(zhì)粒成環(huán)狀質(zhì)粒DNA； PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體形成環(huán)狀質(zhì)粒DNA的過程叫TA克隆。B.【表達(dá)載體表達(dá)載體】用于一個基因的蛋白表達(dá)。常用于一個基因的蛋白表達(dá)。常用的有用的有原核

9、表達(dá)載體原核表達(dá)載體（如，（如，pQE 3.0等）和等）和真真核表達(dá)載體核表達(dá)載體(如，如，pQE 3.1（/-）等）等)。真核表達(dá)載體：綠色熒光蛋白載體真核表達(dá)載體：綠色熒光蛋白載體pEGFP-C3pEGFP-C3( (Green Fluorescent Protein，GFP) pEGFP-C3載體載體 pEGFP-C3載體是一種把異源性蛋白質(zhì)融合至EGFP C端的哺乳動物表達(dá)載體，為Clontech公司的產(chǎn)品。 含有巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動子，SV40 Poly A尾，pUC復(fù)制起始點（原核）和SV40復(fù)制起始點（真核），20個多克隆位點，具有篩選標(biāo)志卡納霉素（原核）和新霉素（真核）的抗

10、性基因。 異源性蛋白與EGFP閱讀框融合克隆入pEGFP-C3，形成的表達(dá)重組體在CMV啟動子啟動下，表達(dá)EGFP和目標(biāo)蛋白的融合蛋白。該融合蛋白保持了該融合蛋白保持了EGFP的熒光特性的熒光特性，可對融合蛋白進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi)定位。 EGFP融合蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)真核表達(dá)載體：綠色熒光蛋白載體真核表達(dá)載體：綠色熒光蛋白載體pEGFP-C2pEGFP-C2紅色熒光蛋白表達(dá)載體 pVisionRFP-CEGFP融合蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)pAVU6+27：RNAi哺乳動物載體，含有氨芐青霉素抗性和新霉素抗性。常用多克隆位點為Sal和Xba （3 3）整合載體：）整合載體：把一個基因插入到染色體組中，把一個基因插

11、入到染色體組中，如酵母附加載體如酵母附加載體YEpsYEps可以插入酵母的染色體DNA （2）有選擇性標(biāo)記抗生素抗性標(biāo)記基因:標(biāo)記基因是與外源目的基因構(gòu)建在同一表達(dá)載體上，一起轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞，而后在特定條件下幫助篩選出已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。 （2）有選擇性標(biāo)記抗生素抗性標(biāo)記基因:標(biāo)記基因是與外源目的基因構(gòu)建在同一表達(dá)載體上，一起轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞，而后在特定條件下幫助篩選出已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。 插入外源片段后的載體大腸桿菌受體菌pUC19產(chǎn)生Lac Z 的N端146個氨基酸被打斷的多肽大腸桿菌產(chǎn)生Lac Z 的C端的多肽IPTG誘導(dǎo)表達(dá)無LacZ產(chǎn)生X-Gal白白色色產(chǎn)產(chǎn)物物無水解反應(yīng)發(fā)生（3 3）有一段多克隆位點）有一段多克隆位點多