基因工程的基本操作程序2

1、11DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具12基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序高頻考點突破高頻考點突破11DNA重重組組技技術(shù)術(shù)的的基基本本工工具具基礎(chǔ)自主梳理基礎(chǔ)自主梳理命題視角剖析命題視角剖析即時達標(biāo)訓(xùn)練即時達標(biāo)訓(xùn)練12基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序基礎(chǔ)自主梳理一、一、DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具1限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”(1)主要來源：原核生物。主要來源：原核生物。(2)特點：能夠識別特點：能夠識別DNA特定的特定的_，切，切開兩個核苷酸之間的開兩個核苷酸之間的_。(3)DNA末端：限制酶切割末端：限制酶切割DN

2、A產(chǎn)生的產(chǎn)生的DNA末端末端有兩種形式：有兩種形式：_和平末端。和平末端。核苷酸序列核苷酸序列磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端2DNA連接酶連接酶“分子縫合針分子縫合針”(1)作用：將雙鏈作用：將雙鏈_ “縫合縫合”起來，恢復(fù)起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_。(2)種類種類Ecoli DNA連接酶：只能縫合連接酶：只能縫合DNA的黏性末端的黏性末端.T4DNA連接酶：既可縫合連接酶：既可縫合DNA的黏性末端，的黏性末端，又可縫合雙鏈又可縫合雙鏈DNA的的_。3基因進入受體細(xì)胞的載體基因進入受體細(xì)胞的載體“分子運輸車分子運輸車”(1)載體的種類載體的種

3、類質(zhì)粒。質(zhì)粒。噬菌體的衍生物。噬菌體的衍生物。動植物病毒。動植物病毒。DNA片段片段磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵平末端平末端(2)質(zhì)粒載體的特點質(zhì)粒載體的特點能夠在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制。能夠在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制。具有一個或多個具有一個或多個_，便于供，便于供外源外源DNA片段插入其中。片段插入其中。具有特殊的遺傳標(biāo)記基因，供重組具有特殊的遺傳標(biāo)記基因，供重組DNA的的鑒定和選擇。鑒定和選擇。二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序1目的基因的獲取目的基因的獲取(1)目的基因：指編碼蛋白質(zhì)的目的基因：指編碼蛋白質(zhì)的_。(2)獲取目的基因的方法獲取目的基因的方法從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目

4、的基因限制酶切割位點限制酶切割位點結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因受體菌受體菌所有所有c目的基因的獲取依據(jù)：目的基因的獲取依據(jù)：()基因的核苷酸序列；基因的核苷酸序列；()基因的功能；基因的功能；()基因在染色體上的位置；基因在染色體上的位置；()基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA；()基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)?；虻姆g產(chǎn)物蛋白質(zhì)。利用利用PCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因aPCR的含義：是一項在生物體外的含義：是一項在生物體外_特定特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。片段的核酸合成技術(shù)。b條件：已知基因的核苷酸序列。條件：已知基因的核苷酸序列。 c過程：目的基因受熱形成單鏈過程：目的基因受熱形成單鏈DNA，與

5、引物，與引物結(jié)合，在結(jié)合，在_的作用下延伸形成的作用下延伸形成DNA。d方式：指數(shù)擴增方式：指數(shù)擴增2n(n為擴增循環(huán)的次數(shù)為擴增循環(huán)的次數(shù))復(fù)制復(fù)制DNA聚合酶聚合酶元貝駕考 http:/ 元貝駕考2016科目一 科目四駕考寶典網(wǎng) http:/ 駕考寶典2016科目一 科目四人工合成法：若基因較小、核苷酸序列已知，可人工合成法：若基因較小、核苷酸序列已知，可以人工合成。以人工合成。2基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體的構(gòu)建(1)表達載體的組成：目的基因表達載體的組成：目的基因_終止子終止子標(biāo)記基因。標(biāo)記基因。(2)表達載體的功能表達載體的功能使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給使目的基因在

6、受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代。下一代。使目的基因使目的基因_和發(fā)揮作用。和發(fā)揮作用。(3)啟動子：位于基因的啟動子：位于基因的_，它是，它是_識識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA。(4)終止子：位于基因的尾端，終止終止子：位于基因的尾端，終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。的轉(zhuǎn)錄。(5)標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞是否含有目的基因。標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞是否含有目的基因。啟動子啟動子表達表達首端首端RNA聚合酶聚合酶3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化的含義：目的基因進入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持_的過程。(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；_槍法；花粉管通道

7、法。(2)將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞方法：_注射技術(shù)。操作程序：目的基因表達載體_取卵(受精卵)顯微注射移植到雌性動物體內(nèi)新性狀的動物。穩(wěn)定和表達穩(wěn)定和表達基因基因顯微顯微提純提純(3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點：繁殖快、多為原核生物特點：繁殖快、多為_、遺傳、遺傳物質(zhì)少。物質(zhì)少。轉(zhuǎn)化：用轉(zhuǎn)化：用Ca2處理細(xì)胞處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達載體與感受態(tài)細(xì)胞混合表達載體與感受態(tài)細(xì)胞混合促感受態(tài)細(xì)胞促感受態(tài)細(xì)胞吸收吸收DNA分子。分子。單細(xì)胞單細(xì)胞4目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定(1)檢測檢測方法：采用方法：采用_技術(shù)，抗原抗技術(shù)，抗原抗體雜交技術(shù)。體雜交

8、技術(shù)。內(nèi)容：內(nèi)容：a檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上的目的基上的目的基因。因。b檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了_。c檢測目的基因是否翻譯成檢測目的基因是否翻譯成_。(2)鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定等。鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定等。DNA分子雜交分子雜交mRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)高頻考點突破基因工程的基本工具基因工程的基本工具【易誤警示易誤警示】限制酶與限制酶與DNA連接酶的關(guān)系連接酶的關(guān)系限制酶不切割自身限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中的原因是：原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。DNA連接酶起作用

9、時不需要模板。連接酶起作用時不需要模板。即時應(yīng)用即時應(yīng)用(隨學(xué)隨練，輕松奪冠隨學(xué)隨練，輕松奪冠)1(2009年高考浙江卷年高考浙江卷)下列關(guān)于基因工程的敘下列關(guān)于基因工程的敘述，錯誤的是述，錯誤的是()A目的基因和受體細(xì)胞均可來自動、植物或目的基因和受體細(xì)胞均可來自動、植物或微生物微生物B限制性核酸內(nèi)切酶和限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常連接酶是兩類常用的工具酶用的工具酶C人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性素原無生物活性D載體上的抗性基因有利于篩選含重組載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細(xì)胞和促進目的基因的表達的細(xì)胞和促進目的基因

10、的表達解析：解析：選選D?；蚬こ讨心康幕騺碓从谧匀唤缰小；蚬こ讨心康幕騺碓从谧匀唤缰械暮心康男誀畹囊磺猩?，可以是動物、植物，的含有目的性狀的一切生物，可以是動物、植物，也可以是真菌、細(xì)菌，還可以是人等；在基因工也可以是真菌、細(xì)菌，還可以是人等；在基因工程中獲取目的基因以及將目的基因和載體結(jié)合構(gòu)程中獲取目的基因以及將目的基因和載體結(jié)合構(gòu)成基因表達載體必須使用同一種限制酶進行切割，成基因表達載體必須使用同一種限制酶進行切割，已獲得相同的黏性末端，再在已獲得相同的黏性末端，再在DNA連接酶的作用連接酶的作用下，將目的基因和載體連接，構(gòu)成基因表達載體；下，將目的基因和載體連接，構(gòu)成基因表達

11、載體；人的胰島素原基因可以在大腸桿菌體內(nèi)得以表達，人的胰島素原基因可以在大腸桿菌體內(nèi)得以表達，但是由于大腸桿菌是原核生物，沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高但是由于大腸桿菌是原核生物，沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器的加工，合成的胰島素原不具有爾基體等細(xì)胞器的加工，合成的胰島素原不具有胰島素的功能，即沒有生物活性；作為標(biāo)記基因，胰島素的功能，即沒有生物活性；作為標(biāo)記基因，有利于重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達的鑒定篩選，但對有利于重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達的鑒定篩選，但對于目的基因的表達沒有促進等調(diào)控作用。于目的基因的表達沒有促進等調(diào)控作用?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蚧蚬こ痰幕静僮鞒绦?構(gòu)建基因表達載體構(gòu)建基因表達載體(核心步驟核心步

12、驟)2將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射技術(shù)Ca2處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞(或受精卵)受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的DNA表達將含有目的基因的表達載體提純?nèi)÷?受精卵)顯微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動物Ca2處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子【拓展深化拓展深化】只有第三步將目的基因?qū)胧苤挥械谌綄⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞不需堿基互補配對，其余三個步驟都涉及體細(xì)胞不需堿基互補配對，其余三個步驟都涉及堿基互補配對。堿基互補配對。工

13、具酶只有兩種：限制酶在操作程序工具酶只有兩種：限制酶在操作程序1、2中用中用到且要求用同一種，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端；到且要求用同一種，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端；DNA連接酶只在操作程序連接酶只在操作程序2中用到。中用到。目的基因進入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)目的基因進入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實質(zhì)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。即時應(yīng)用即時應(yīng)用(隨學(xué)隨練，輕松奪冠隨學(xué)隨練，輕松奪冠)2目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定

14、維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定與檢測才能持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定與檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是()檢測受體細(xì)胞中是否有目的基因檢測受體細(xì)胞中是否有目的基因檢測受體檢測受體細(xì)胞中是否有致病基因細(xì)胞中是否有致病基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)質(zhì)ABC D答案：答案：C命題視角剖析緊扣教材重點緊扣教材重點基因工程的操作過程分析基因工程的操作過程分析 (2011年南京市質(zhì)量檢測年南京市質(zhì)量檢測)已知已知SARS是由是由一種一種RNA病毒感染所引起的疾病。病毒

15、感染所引起的疾病。SARS病毒病毒表面的表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人病人康復(fù)后的血清中有抗康復(fù)后的血清中有抗S蛋白的特異性抗體。某蛋白的特異性抗體。某研究小組為了研制預(yù)防研究小組為了研制預(yù)防SARS病毒的疫苗，開病毒的疫苗，開展了前期研究工作，其簡要的操作流程如下：展了前期研究工作，其簡要的操作流程如下：(1)實驗步驟實驗步驟所代表的反應(yīng)過程是所代表的反應(yīng)過程是_。(2)步驟步驟構(gòu)建重組表達載體構(gòu)建重組表達載體A和重組表達載和重組表達載體體B必須使用限制酶和必須使用限制酶和_酶，后者的酶，后者的作用是將用限制酶切割的作用是將用限制酶切割的_和和_連接起來

16、。連接起來。(3)如果省略步驟如果省略步驟 而將大量擴增的而將大量擴增的S蛋白基蛋白基因直接導(dǎo)入大腸桿菌，一般情況下，不能得因直接導(dǎo)入大腸桿菌，一般情況下，不能得到表達的到表達的S蛋白，其原因是蛋白，其原因是S蛋白基因在大腸蛋白基因在大腸桿菌中不能桿菌中不能_，也不能，也不能_。(4)為了檢驗步驟為了檢驗步驟所表達的所表達的S蛋白是否與病毒蛋白是否與病毒S蛋白有相同的免疫反應(yīng)特征，可用蛋白有相同的免疫反應(yīng)特征，可用_與與_進行抗原進行抗原抗體特異性反應(yīng)實驗，抗體特異性反應(yīng)實驗，從而得出結(jié)論。從而得出結(jié)論。(5)步驟步驟和和的結(jié)果相比，原核細(xì)胞表達的的結(jié)果相比，原核細(xì)胞表達的S蛋白與真核細(xì)胞表達

17、的蛋白與真核細(xì)胞表達的S蛋白的氨基酸序列蛋白的氨基酸序列_(填填“相同相同”或或“不相同不相同”)，根本原因是，根本原因是_?！緡L試解答嘗試解答】(1)逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄(2)DNA連接載體連接載體S蛋白基因蛋白基因(3)復(fù)制合成復(fù)制合成S蛋白基因的蛋白基因的mRNA(4)大腸桿菌中表達的大腸桿菌中表達的S蛋白蛋白SARS康復(fù)病人康復(fù)病人血清血清(5)相同表達蛋白質(zhì)所用的基因相同相同表達蛋白質(zhì)所用的基因相同【解析解析】(1)利用利用RNA獲取獲取DNA，一般采用，一般采用逆轉(zhuǎn)錄的方法，在這一過程中需要逆轉(zhuǎn)錄酶；逆轉(zhuǎn)錄的方法，在這一過程中需要逆轉(zhuǎn)錄酶；(2)目的基因與載體結(jié)合，先用限制酶在目的目的基因

18、與載體結(jié)合，先用限制酶在目的基因和載體上切出相同的黏性末端，將目的基基因和載體上切出相同的黏性末端，將目的基因片段插入載體的切口處，再加入適量的因片段插入載體的切口處，再加入適量的DNA連接酶，將黏性末端連接起來；連接酶，將黏性末端連接起來；(3)選擇性擴增后得到的含有遺傳信息的選擇性擴增后得到的含有遺傳信息的DNA片片段段(S蛋白基因蛋白基因)，直接導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，在，直接導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，在不與其不與其DNA整合的情況下，不進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，整合的情況下，不進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，得不到相應(yīng)的蛋白質(zhì)；得不到相應(yīng)的蛋白質(zhì)；(4)通過大腸桿菌合成的通過大腸桿菌合成的S蛋白，結(jié)構(gòu)和功能可能蛋白，結(jié)構(gòu)

19、和功能可能會發(fā)生變化，可與人體內(nèi)產(chǎn)生的抗會發(fā)生變化，可與人體內(nèi)產(chǎn)生的抗S蛋白的抗體蛋白的抗體進行抗原進行抗原抗體特異性反應(yīng)，以此進行檢測；抗體特異性反應(yīng)，以此進行檢測；(5)各種生物都共用一套遺傳密碼，因此轉(zhuǎn)入相各種生物都共用一套遺傳密碼，因此轉(zhuǎn)入相同的目的基因，表達出的蛋白質(zhì)一般應(yīng)相同。同的目的基因，表達出的蛋白質(zhì)一般應(yīng)相同。洞察高考熱點洞察高考熱點基因工程的基本工具基因工程的基本工具(1)獲取目的基因時要保證其完整性。獲取目的基因時要保證其完整性。(2)質(zhì)粒的切割要保證標(biāo)記基因的完整性。質(zhì)粒的切割要保證標(biāo)記基因的完整性。(3)非受精卵的植物組織細(xì)胞作為受體細(xì)胞時非受精卵的植物組織細(xì)胞作為受

20、體細(xì)胞時需用植物組織培養(yǎng)技術(shù)。需用植物組織培養(yǎng)技術(shù)。 (2010年高考江蘇卷年高考江蘇卷)下表中列出了幾下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答下列問題：下列問題：(1)一個圖一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma切割前后，切割前后，分別含有分別含有_個游離的磷酸基團。個游離的磷酸基團。(2)若對圖中質(zhì)粒進行改造，插入的若對圖中質(zhì)粒進行改造，插入的Sma酶切位酶切位點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越_。(3)用圖中的質(zhì)粒和外源用圖中的質(zhì)粒和外源DN

21、A構(gòu)建重組質(zhì)粒，不構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用能使用Sma 切割，原因是切割，原因是_。【嘗試解答嘗試解答】(1)0、2(2)高高(3)Sma會破會破壞質(zhì)粒的抗性基因、外源壞質(zhì)粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因中的目的基因(4)質(zhì)粒和含目的基因的外源質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化片段自身環(huán)化(5)DNA連接連接(6)鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)胞胞(7)蔗糖為唯一含碳營養(yǎng)物質(zhì)蔗糖為唯一含碳營養(yǎng)物質(zhì)【解析解析】環(huán)狀環(huán)狀DNA分子中磷酸全部參與形成分子中磷酸全部參與形成磷酸二酯鍵，被磷酸二酯鍵，被Sma 限制酶切開后相當(dāng)于一限制酶切開后相當(dāng)于一個正常的個正常的DNA分子，每個分子，每個DNA分子單鏈各含有分子單鏈各含有一個游離的磷酸基團；一個游離的磷酸基團；AT堿基對有兩個氫鍵，堿基對有兩個氫鍵，而而GC堿基對有三個氫鍵，堿基對有三個氫鍵，GC堿基對含量堿基對含量越多，熱穩(wěn)定性越高；越多，熱穩(wěn)定性越高；突破易錯疑點突破易錯疑點易混淆的幾種酶易混淆的幾種酶三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基礎(chǔ)自主梳理一、一、DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具1限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”(1)主要來源：原核生物。主要來源：原核生物。(2)特點：能夠識別特點：能夠識別DN