基因工程—工具酶中國藥科大學生物工程所有

1、基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶賴一些酶( (如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNADNA聚聚合酶等合酶等) )作為工具對基因進行人工切割，拼接和擴作為工具對基因進行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶工具酶”。工。工具酶是對野生菌株（或真核生物如酵母）進行改具酶是對野生菌株（或真核生物如酵母）進行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。第二節(jié) 基因工程的工具酶自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類參與微生物的核酸代謝

2、參與微生物的核酸代謝，在核酸復制和修復等反應(yīng)中具有重要作用，有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的區(qū)別自己和非己的DNADNA進而降解非己進而降解非己DNADNA的防御工具的防御工具。在研究掌握了利用這些酶類對基因切割、拼接操作方法后，人類獲得了最好的基因工程工具。隨著越來越多的酶分子被發(fā)現(xiàn)，許多廠商已將其克隆并開隨著越來越多的酶分子被發(fā)現(xiàn)，許多廠商已將其克隆并開發(fā)成產(chǎn)品，工具酶的數(shù)量和用途不斷增加，不僅簡化了分發(fā)成產(chǎn)品，工具酶的數(shù)量和用途不斷增加，不僅簡化了分子克隆的操作，而且拓寬了研究領(lǐng)域。子克隆的操作，而且拓寬了研究領(lǐng)域。本章主要介紹用于基因工程的各種工具酶。本章主要介紹用于基因工程的各種工

3、具酶?；蚬こ坦ぞ呙富蚬こ坦ぞ呙?限制性內(nèi)切酶 連接酶 DNA聚合酶 DNA修飾酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶一、細菌的限制一、細菌的限制修飾作用和限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)修飾作用和限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶5050年代后年代后LuriaLuria和和Human(1952) BertaniHuman(1952) Bertani和和Weigle(1953)Weigle(1953)發(fā)現(xiàn)細菌的發(fā)現(xiàn)細菌的“限制限制”現(xiàn)象現(xiàn)象. .1 1、細胞的限制、細胞的限制修飾作用修飾作用Phage（k）感染感染E.coli k不感染不感染E .coli B (E .c

4、oli B 限制限制 （k）)仍有少量仍有少量(K)可在可在 E.coli B中生存，是因中生存，是因 E.coli B對對(K)進進行了修飾。行了修飾。E.coli B修飾修飾(k)*(k)感染感染E.coli(B)細菌如何對細菌如何對噬菌體進行限制和修飾？噬菌體進行限制和修飾？1962年W.Arber(瑞士)發(fā)現(xiàn)，寄主對噬菌體的修飾是在Phage入的DNA上。 1965年，Arber發(fā)現(xiàn)修飾與的降解有關(guān)，提出：細胞中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細胞中有限制限制修飾系統(tǒng)修飾系統(tǒng)(R-M Restriction-modification system)。

5、R-M系統(tǒng)是細菌安內(nèi)御外的積極措施。細菌的限制細菌的限制修飾系統(tǒng)修飾系統(tǒng) 即限制性內(nèi)切酶和與其對應(yīng)的甲基化酶系統(tǒng)，即限制性內(nèi)切酶和與其對應(yīng)的甲基化酶系統(tǒng)，稱稱R-M system 限制性內(nèi)切酶識別特異的限制性內(nèi)切酶識別特異的DNA序列并打斷序列并打斷DNA，同時對應(yīng)的甲基化酶能把該段特異的序列甲基同時對應(yīng)的甲基化酶能把該段特異的序列甲基化，使得限制性內(nèi)切酶無法識別?；?，使得限制性內(nèi)切酶無法識別。 這種系統(tǒng)在細菌中起到了免疫的作用，即外來這種系統(tǒng)在細菌中起到了免疫的作用，即外來入侵的入侵的DNA在限制性內(nèi)切酶的作用下被水解，在限制性內(nèi)切酶的作用下被水解，而細菌自身的而細菌自身的DNA在甲基化酶的

6、作用下被保護在甲基化酶的作用下被保護起來。起來。 細菌的限制和修飾現(xiàn)象細菌的限制和修飾現(xiàn)象 1968年年Linn和和Arber從從E.coli B中發(fā)現(xiàn)限制中發(fā)現(xiàn)限制酶酶,M.Meselson和和R.yuan從從E.coli K中分離到另一限中分離到另一限制性的內(nèi)切酶。制性的內(nèi)切酶。 1970年年Smith (美美)在流感嗜血桿菌又發(fā)現(xiàn)另一限制在流感嗜血桿菌又發(fā)現(xiàn)另一限制酶即限制酶酶即限制酶。 限制酶的功能：降解不同源限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源，而不降解同源DNA。 1978年年W.Arber、H.O.Smith(美美)，Nathans(美美)因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究

7、的突出貢獻獲因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾獎。得諾貝爾獎。限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性核酸內(nèi)切酶二、限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列特定核苷酸序列（48bp），），并由此處切割切割DNA雙鏈雙鏈的核酸內(nèi)切酶內(nèi)切酶。（Restriction endonuclease）2.2.性質(zhì)性質(zhì)內(nèi)切酶。內(nèi)切酶。原核生物。原核生物。即在核酸分子鏈的即在核酸分子鏈的內(nèi)部內(nèi)部制造切口的酶。制造切口的酶。自我保護作用。自我保護作用。3. 3. 功能功能細菌的限制和修飾系統(tǒng)（細菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/MR/M體系）體系）1. 1. 來來源源

8、限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外外源源DNADNA切成小片斷。切成小片斷。（1 1）限制（）限制（RestrictionRestriction）細菌自身的細菌自身的DNA堿基被堿基被甲基化酶甲基化酶甲基化甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。酶識別切割。（2）修飾（）修飾（Modification） Dam甲基化酶甲基化酶(Mec甲基化酶甲基化酶)GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm甲基化酶甲基化酶CCAGG或或CCTGG序列在第二個序列在第二個C上上C5位置上引入甲基位置上引入甲基1973年H.O

9、 Smith和D. Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：三、限制性內(nèi)切酶的命名1.用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。4. 限制酶前面要帶上限制酶前面要帶上R（Restriction)，修飾酶前面要帶上修飾酶前面要帶上M（Modification）。）。（現(xiàn)已省略）。（現(xiàn)已省略）。2. 用一個右下標的大寫字母表示菌株或型菌株或型。如如Ecok, EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。）。3. 如果

10、一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復系統(tǒng)，用羅馬字母表示。的限制與修復系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如如EcoR I，EcoR V。EcoR IEscherichia屬名屬名Coli種類種類Ry13株系株系編號編號 若種名頭若種名頭2個字母相同則其中一個可用個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。種名的第一和第三個字母。I 型限制性內(nèi)切酶型限制性內(nèi)切酶 目前鑒定出目前鑒定出三種不同類型三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。的限制性內(nèi)切酶。四、限制性內(nèi)切酶的類型四、限制性內(nèi)切酶的類型II 類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶 III類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶 首先由首先由M.

11、 Meselson和和R. Yuan在在1968年年從大腸桿菌從大腸桿菌 B株株和和 K株株分離的。分離的。（1）識別位點序列）識別位點序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1. I類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶 如如 EcoB和和 EcoK。未甲基化修飾的特異序列，非對稱性。未甲基化修飾的特異序列，非對稱性。需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。（3）作用機理）作用機理在距離特異性識別位點約在距離特異性識別位點約10001500 bp處處隨機隨機切開一條切開一條單鏈單鏈。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位點）

12、切割位點 I類酶與DNA識別位點結(jié)合依賴于M亞基與輔助因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的相互作用，后者通過變構(gòu)作用使酶處于活性狀態(tài)。 酶分子與識別位點結(jié)合之后，根據(jù)該位點的甲基化狀態(tài)發(fā)揮相應(yīng)的酶活性，或限制、或修飾、或既不限制也不修飾。 I類酶的切割位點與識別位點通常相距1,000-5,000bp，切割位點的序列并不表現(xiàn)出嚴格的特異性，兩條DNA鏈上的斷裂位點相距70-75個核苷酸，因此切開的DNA分子末端是單鏈形式。首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。2.II類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶 分離的第一個酶是Hind 該類酶是一種分子量較小的單體蛋

13、白，其雙鏈DNA的識別與切割活性僅需要Mg2+，且識別與切割位點的序列大都具有嚴格的特異性，因而在DNA重組及分子生物學實驗中被廣泛使用。 （1）識別位點序列未甲基化修飾的雙鏈DNA；四、五或六個堿基對，而且具有180旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu)。與DNA的來源無關(guān)。 絕大多數(shù)的II類酶均在其識別位點內(nèi)切割DNA，切割位點可發(fā)生在識別序列的任何兩個堿基之間。一部分酶識別相同的序列，但切點不同，這些酶稱為同位酶（Isoschizomers），其中識別位點與切割位點均相同的不同來源的酶稱為同裂酶，如SstI與SacI、HindIII與HsuI等。有些酶識別位點不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，這些

14、酶稱為同尾酶（Isocandamers）。 根據(jù)被切開的DNA末端性質(zhì)的不同，所有的II類酶又可分為5突出末端酶、3突出末端酶以及平頭末端酶三大類。II類酶分類（2 2）切割位點）切割位點切開切開雙鏈雙鏈DNADNA。形成。形成粘性末端粘性末端（sticky sticky endend）或）或平齊末端平齊末端（blunt endblunt end）。如：）。如：識別位點處。識別位點處。 （3）粘性末端（）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有幾個核苷酸單鏈突出的末端。分兩種類型： 5端凸出（如EcoR I切點）GAATTC CTTAA GG AATTCCTTAAG

15、5-33-55-33-5CTGCAG 3端凸出（如端凸出（如Pst I切點）切點）GACGTC5-33-55-33-5CTGCA G G ACGTC 連接便利（4）粘性末端的意義）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個平齊末端容易的多。 補平成平齊末端凸出的3端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 5末端標記末端標記凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切

16、酶。（5）同裂酶）同裂酶（Isoschizomers) 完全同裂酶(同位酶)：識別位點和切點完全相同。如Hind 和Hsu I。識別位點相同，但切點不同。如Xma I 和 Sma I。 不完全同裂酶：不完全同裂酶：識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等（6）同尾酶）同尾酶(Isocaudamers） Sau 3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的“雜種位點雜種位點”一般不能一般不能再被原來的酶識再被原來的酶識別。別。？Sau 3A限制性內(nèi)切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力

17、和位點的專一性。（7）限制酶的酶活性）限制酶的酶活性如果改變反應(yīng)條件就會影響酶的專一性和切割效率，內(nèi)切酶出現(xiàn)切割與識別位點相似但不完全相同的序列，這一現(xiàn)象稱為星號（*）活性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。 星號（*）活性 星活性可造成位點切割機率不等，降解不完全。EcoR I和BamH I等都有*活性,使用時要注意！在低鹽、高pH（8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoR I：如： ECORI識別特異性放寬，GAATTCAATT較高的甘油濃度（5% v/v）； 酶與底物DNA比例過高（不同的酶情況不同，通常為100 U/g）； 低鹽濃度（pH 8.0）

18、存在有機溶劑（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等） 用其他二價離子替代鎂離子（如Mn+，Cu+，Co+，Zn+等） 導致星號活性的因素 以下酶類易出現(xiàn)“星號活性”，它們是 BamH I，Bcl I，BseB I，BssA I，EcoRI，EcoR V，Hind III，Hpa I，Kpn I，NcoI， NruI，Pst I，Pvu II，Sal I，Sca I，SnaB I，Sph I，Ssp I，Xba I。以上因素的影響程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I對甘油濃度更敏感，而后者則對高pH值更敏感一些(2)。

19、 盡量用較少的酶進行完全消化反應(yīng)。這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。 盡量避免有機溶劑（如制備DNA時引入的乙醇）的污染。 將離子濃度提高到100-150 mM（若酶活性不受離子強度影響）。 將反應(yīng)緩沖液的pH值降到7.0。 二價離子用Mg+。 在離它的不對稱識別位點一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。（8 8）ss型限制性內(nèi)切酶型限制性內(nèi)切酶移動切割（shifted cleavage):533. III類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶 在完全肯定的位點切割在完全肯定的位點切割DNA，但反應(yīng)，但反應(yīng)需要需要ATP、 Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨腺苷蛋氨酸）。酸）。在基因工程操作中用途不大。在

20、基因工程操作中用途不大。 III類限制類限制-修飾酶由修飾酶由R亞基和亞基和MS亞基組成，其中亞基組成，其中MS亞基具有位點識別和甲基化修飾雙重活性。亞基具有位點識別和甲基化修飾雙重活性。 該類酶與該類酶與DNA識別位點的結(jié)合嚴格依賴識別位點的結(jié)合嚴格依賴ATP，在與識別位點結(jié)合之后，修飾作用與限制作用在與識別位點結(jié)合之后，修飾作用與限制作用取決于兩個亞基之間的競爭。修飾作用在識別取決于兩個亞基之間的競爭。修飾作用在識別位點內(nèi)進行，甲基化受體是腺嘌呤堿基，供體位點內(nèi)進行，甲基化受體是腺嘌呤堿基，供體仍為仍為SAM。 切割位點位于識別位點一側(cè)的若干堿基對處，切割位點位于識別位點一側(cè)的若干堿基對處

21、，但無序列特異性，只與識別位點的距離有關(guān)，但無序列特異性，只與識別位點的距離有關(guān)，而且不同的而且不同的III類酶具有各自不同的距離，從類酶具有各自不同的距離，從7至至26bp不等。不等。 五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素 1、底物 DNA1) DNA的純度 DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。 RNA 與 E 結(jié)合影響有效酶濃度；RNA影響(干擾)電泳區(qū)帶。 2) DNA濃度 DNA過大，會抑制酶活(影響酶分子擴散)。 如：4g DNA /1U HPa 50l 在37下 15h 而 1g DNA /1U HPa 50l 在37

22、下 1h 3） 識別位點及鄰近位點特異性序列 由于切點鄰近序列不同，水解速度不同。如： DNA有5個ECORI切點，其中兩個相差10倍。 pBR322 DNA 有4個Nar切點(GGCGCC)其中2個切點用1U酶水解1h完全切開,2個切點用50U酶水解16h水解不完全。 Xma切點是CGGCCG，但在GGCGGCCGCC時不切割 4) DNA二級/三級結(jié)構(gòu) 超螺旋DNA(病毒或質(zhì)粒)比線狀DNA需更多酶。 5) 提取時混入雜質(zhì)可改變識別特異性 如： 高濃度Hg2+、酚，氯仿、乙醇、EDTA SDS、NaCl等。大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2. DNA2. DNA的甲基化程的甲基化程度度

23、 dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木?。不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 oC，少數(shù)要求40-65 oC。3. 3. 溫度溫度 是影響限制酶活性的重要因素。4. 4. 緩沖液緩沖液(Buffer) (Buffer) （1）緩沖液的化學組成金屬離子 如型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如Hind，ECORI）則特異性改變。 離子濃度，合適激發(fā)酶活；不合適抑制酶活。 牛血清蛋白(BSA)MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl： 維持pH；二硫蘇糖醇（DTT

24、）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定； BSA 是酶穩(wěn)定劑，機制：減少蛋白酶及非特異性吸附作用。避免熱、表面張力、化學品導致的酶變性。過量BSA會引起電泳拖尾?？赏ㄟ^加SDS/65/5min除去。 水無離子水，ddH2O，雙蒸水。無菌、無污染、配成核心緩沖液，即幾種酶的相近buffer商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。六、限制性內(nèi)切酶對六、限制性內(nèi)切酶對DNADNA的消的消化化1. 1. 內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式 1986年J.A. McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG內(nèi)切

25、酶在內(nèi)切酶在DNADNA上的上的所有所有識別位點都被切開。識別位點都被切開。2. 2. 完全消完全消化化 12 341234只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。少酶的用量可達到局部消化的目的。3. 3. 局部消化局部消化 12 3414大多數(shù)酶可用大多數(shù)酶可用65 65 o oC C溫育溫育5 5分鐘失活。分鐘失活?；蛴没蛴靡掖家掖汲恋沓恋鞤NADNA。4. 4. 限制酶酶切反應(yīng)的終限制酶酶切反應(yīng)的終止止 5. 5. 幾種常用限制酶識別位點幾種常用限制酶識別位點 要做定向

26、克隆，通常要作雙酶切。同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選要做定向克隆，通常要作雙酶切。同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓擇能讓兩種酶同時作用兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。的最佳緩沖液是非常重要的一步。 酶切所用的緩沖液可以從各公司的酶活性圖表中選擇。酶切所用的緩沖液可以從各公司的酶活性圖表中選擇。 6. 6. 雙酶切雙酶切雙酶切注意事項雙酶切注意事項 選活性至少都在選活性至少都在8080以上的以上的bufferbuffer 注意反應(yīng)溫度注意反應(yīng)溫度 1 1）溫度一致時可同時進行）溫度一致時可同時進行 2 2）溫度不一致時，先切溫度低的，再切）溫度不一致時，先切溫度低

27、的，再切溫度高的溫度高的先切一個，回先切一個，回收后再切另一個收后再切另一個. . 由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液中進行雙酶切反應(yīng)時，反應(yīng)速度會減緩，因此需要由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液中進行雙酶切反應(yīng)時，反應(yīng)速度會減緩，因此需要增加酶量或延長酶切時間來提高酶切速率。增加酶量或延長酶切時間來提高酶切速率。 從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié)第二節(jié) DNA DNA 連接酶連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復制一定有斷口。 DNA連接酶舊稱“合成酶”。 是1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的，最初發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP

28、或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5-PO4與另一DNA鏈的3-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。（1 1）大腸桿菌連接酶）大腸桿菌連接酶1. 1. 兩種兩種DNADNA連接酶連接酶只能連接只能連接粘性末端。粘性末端。分子量分子量74000dal,74000dal,輔因子輔因子NAD+,NAD+,其作用是封其作用是封閉雙螺旋骨架上具有閉雙螺旋骨架上具有5-5-磷?；土柞；?-3-羥基的缺口，形成磷酸羥基的缺口，形成磷酸二酯鍵。二酯鍵。二、二、DNA ligaseDNA lig

29、ase的特點的特點（2 2）T4T4噬菌體的連接酶噬菌體的連接酶T4DNA連接酶來自于T4噬菌體感染的E.coli，為T4噬菌體自身的表達產(chǎn)物。分子量6.8萬dal，輔因子位ATP，該酶既能連接粘性末端，亦能連接齊平末端。（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3端有游離的-OH， 5端有一個磷酸基團（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中： NAD+2. 2. 連接條件連接條件1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應(yīng)的機理三、連接反應(yīng)的機理2. ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復合物，并釋放出焦磷酸PPi。3. AMP與連接酶的賴氨酸e-氨基相連。OC-C

30、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ + +H3NAMPATPPPi4. AMP隨后從連接酶的賴氨酸e-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”復合物。-OH HO-P-AMP-OHO-P-AMP5. 3-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。 用DNA連接酶，可催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組分子。 具體做法是，在體外將具有粘性末端的DNA限制片斷，插入到適當載體分子上，再用DNA連接酶連接，從而可以按照人們的意圖構(gòu)建出新的DNA雜種分子。粘性末端粘性末端DNADNA片段的連接（連接酶的作用）片段的連接（連接酶的作用）5 5GAATTC

31、CTTAAGGAATTCCTTAAG5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG用粘性末端構(gòu)建重組體用粘性末端構(gòu)建重組體DNADNA的最主要缺點：的最主要缺點：1、無法控制外源基因的插入方向；2、由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)混合物中會發(fā)生自我環(huán)化作用，經(jīng)連接酶作用，形成共價閉環(huán)的穩(wěn)定環(huán)形結(jié)構(gòu)?？朔撊秉c的方法是，用堿性磷酸

32、酶預(yù)先處理線性的載體DNA分子，以移去末端的5磷酸基團，于是在連接反應(yīng)中，它自身的兩個末端之間就再也不能被連接酶共價連接起來了。1 1、同聚物加尾法、同聚物加尾法 是由美國斯坦福大學的P.Labban和D.Kaiser1972年發(fā)展起來的，可以連接任何兩段DNA分子的普遍性方法。原理：利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，將同種核苷酸（dNTP)加到DNA分子單鏈延伸末端的3-OH上。如果在目的基因兩側(cè)加polydA，則在載體兩側(cè)加polydT。長度一般1040個殘基。 平末端平末端DNADNA片段的連接片段的連接同聚物加尾法優(yōu)點: 1)首先不易自身環(huán)化. 2)因為載體和外源

33、片段的末端是互補的黏性末端，所以連接效率較高.3)用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進行連接. 缺點： 1)插入的片段難以回收。 2)無法控制外源基因插入方向。 3)用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進行連接. C 3 GG5 G 3C5C3GGTTTTTTTTTT 3CC3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGC3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGCTGCA 3

34、GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGGCATGCCCCCC 3CC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTG

35、CAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCG5 55GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTA

36、GGGGGGGTTAAG銜接物（銜接物（linker)linker)連接法連接法所謂銜接物是指用化學方法合成的一段由1012個核苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸段片斷。將銜接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后通過T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來，接著用適當?shù)南拗泼赶咩暯游锏腄NA分子和載體分子，由此使兩者都產(chǎn)生出彼此互補的粘性末端。優(yōu)點：克隆后還可回收原插入片斷。 DNA DNA銜接物連接法盡管有諸多優(yōu)點，但明顯銜接物連接法盡管有諸多優(yōu)點，但明顯的的缺點缺點是，如果待克隆的是，如果待克隆的DNADNA片段或基因的內(nèi)部也含

37、片段或基因的內(nèi)部也含有與所加的銜接物相同的限制位點，這樣在酶切消化有與所加的銜接物相同的限制位點，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把所克隆的基因切銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把所克隆的基因切成不同的片段，從而對后繼的亞克隆及其他操作造成成不同的片段，從而對后繼的亞克隆及其他操作造成麻煩。麻煩。DNADNA接頭接頭(adaptor)(adaptor)連接法連接法DNADNA接頭接頭是由美國康奈爾大學吳瑞博士于1977年發(fā)明的，它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。頭為平末端的特殊的雙

38、鏈寡核苷酸短片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。問題：各個DNA接頭分子的粘性末端之間，會通過互補堿基間的配對作用，形成如同DNA銜接物一樣的二聚體分子，失去接頭的本來意義?？朔姆椒ㄊ菍?末端的磷酸修飾移去，其結(jié)果為暴露出的5-OH所取代。如此一來，雖然兩個接頭分子粘性末端之間仍具有互補堿基配對的能力，但終因DNA連接酶無法在5-OH和3 OH之間形成磷酸二酯鍵而不會產(chǎn)生出穩(wěn)定的二聚體分子。連接酶反應(yīng)的最佳溫度是連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。四、連接反應(yīng)的溫度四、連接反應(yīng)的溫度1. 最佳溫度最佳溫度但在但在37下下粘性

39、末端粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。的結(jié)合很不穩(wěn)定。2. 實用溫度實用溫度所以一般采用所以一般采用 416 C。增加插入片段與載體的接觸機會，增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。減少載體自我連接的現(xiàn)象。1. 1. 插入片段與載體的濃度比例插入片段與載體的濃度比例 2. 2. 反應(yīng)溫度反應(yīng)溫度五、影響連接反應(yīng)的因素五、影響連接反應(yīng)的因素10201020倍。倍。一般一般14161416第三節(jié)第三節(jié) DNA聚合酶聚合酶一、基因工程中常用的一、基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶1.DNA聚合酶聚合酶(全酶全酶)(E.coli)2.Klenow fragment (E.coli)3.TDNA聚

40、合酶聚合酶(TPhage感染的感染的E.coli)4.TDNA聚合酶聚合酶(TPhage感染的感染的E.coli)5.修飾的修飾的TDNA聚合酶聚合酶(測序酶測序酶) 6.DNA末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶(小牛胸腺小牛胸腺)7.反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶(依賴依賴RNA)聚合酶聚合酶1. 共同特點共同特點把把dNTPs連續(xù)地加到引物的連續(xù)地加到引物的3OH端。端。2. 主要區(qū)別主要區(qū)別T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。而不從模板上掉下來。其它幾種其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加聚合酶只能連續(xù)添加10多多個個dNTPs就會從模板上解離下來。就會從模板上解離

41、下來。二、常用的二、常用的DNA聚合酶的特點聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。高高快快無無無無遺傳修飾遺傳修飾T7DNA聚合酶聚合酶高高3. 常用常用DNA聚合酶的特性聚合酶的特性比較比較三、三、DNA聚合酶在基因工程中的用聚合酶在基因工程中的用途途1. 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 I主要用來制備帶放射性標記的主要用來制備帶放射性標記的DNA探針。探針。（1）大腸桿菌）大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I 的性質(zhì)的性質(zhì)一條一條單鏈多肽單鏈多肽。用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的端的部分。就成為部分。就成為Klenow fragm

42、ent。 底物：底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 帶有帶有3OH游離端的引物游離端的引物 DNA模板模板（2）DNA聚合酶聚合酶I（Pol I）的反應(yīng)）的反應(yīng)條件條件-OH53dNTPs標記標記能夠同某種被研究的核酸序列特異能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標記的寡聚核酸分性結(jié)合的，帶有標記的寡聚核酸分子。子。（3）用）用DNA聚合酶聚合酶I 制備探制備探針針已知序列的核酸片斷已知序列的核酸片斷顯示位置顯示位置與互補的待測序列雜交與互補的待測序列雜交標記標記已知序列的核酸片斷已知序列的核酸片斷 探針的標記方式探針的標記方式標記標記已知序列的核酸片斷

43、已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷53 DNA聚合酶聚合酶I 對探針序列的標對探針序列的標記記切口轉(zhuǎn)移法切口轉(zhuǎn)移法(nick translation )： 放射性同位素標記：放射性同位素標記：DNA聚合酶聚合酶I 同時具備同時具備53外切酶外切酶活性活性和和53的聚合酶的聚合酶活性（以及活性（以及35外切外切酶活性）。酶活性）。53外切酶活性從外切酶活性從DNA切口的切口的下一段下一段DNA5端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在切口端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在切口的的上一段上一段DNA的的3一側(cè)補上一個新的核苷酸。一側(cè)補上一個新的核苷酸。切口

44、切口切口切口55335353純化的純化的DNA片斷片斷DNase I 制制造單鏈切口造單鏈切口DNA Pol I 進行進行切口轉(zhuǎn)移切口轉(zhuǎn)移一種一種a-32P-dNTP和和dNTPs555555553333333332P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標記從頭至尾都被標記8 缺口平移法快速、簡便、成本相對較低、比活性較高、標記均一。主要利用了缺口平移法快速、簡便、成本相對較低、比活性較高、標記均一。主要利用了DNA聚合酶聚合酶修復修復DNA的功能，用于大分子的功能，用于大分子DNA標記（標記（1000bp最好）；最好）； 缺點：單鏈缺點：單鏈DNA、RNA不能用該法標記。不能用該法標記。

45、2. Klenow fragment (DNA2. Klenow fragment (DNA聚合酶聚合酶I I大片段大片段) ) 具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活性。外切酶活性。（失去了失去了53外切酶活性外切酶活性）。）。（1）Klenow fragment的性質(zhì)的性質(zhì)C 端端76，000 dKlenow活性活性 聚合聚合 5外切外切N 端端36，000 5外切外切 Jacobsen(1974),Joyce 和和 Grindley,(1983)克隆此克隆此大片段。大片段。DNA Pol I 枯草桿菌枯草桿菌蛋白酶蛋白酶 3 3端補平端補平5555klenowklenow補平限

46、制性內(nèi)切酶切后形成的補平限制性內(nèi)切酶切后形成的33隱蔽端隱蔽端。在在33隱蔽端隱蔽端加上放射性標記的加上放射性標記的dNTPdNTP。klenowklenow（2 2）主要用途）主要用途33隱蔽末端的隱蔽末端的DNADNA片斷片斷Klenow fragmentKlenow fragment補平補平根據(jù)末端的順序選根據(jù)末端的順序選擇一種擇一種 a-a-3232P-P-dNTPsdNTPs末端標記的末端標記的DNADNA限制性內(nèi)切酶切限制性內(nèi)切酶切5-G35-G33-CTTAA53-CTTAA55-G5-GAAAA333-CTTAA53-CTTAA55-G5-GAAAATT3TT33-CTTAA5

47、3-CTTAA55-G35-G33-CCTAG53-CCTAG55-G5-GG G333-CCTAG53-CCTAG55-G5-GG GATC3ATC33-CCTAG53-CCTAG5EcoR IEcoR IBamH IBamH Ia-a-3232P-dATPP-dATPa-a-3232P-dGTPP-dGTP2525o oC 1hC 1h cDNA第二鏈的合第二鏈的合成成mRNAcDNA第一鏈第一鏈逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈第二鏈klenow533553引物引物 隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合模板結(jié)合,在在Klenow酶的作用酶的作

48、用下下,合成合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。通常和酶的量。通常,產(chǎn)物平均長度為產(chǎn)物平均長度為400-600個核苷酸。個核苷酸。隨機引物法標探針隨機引物法標探針 優(yōu)點：(1)Klenow片段沒有53外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。(2)反應(yīng)時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進行反應(yīng)。(3)反應(yīng)產(chǎn)物的比活性較高,可達4109 cpm/g探針 缺點：不能標記環(huán)狀DNA 純化的DNA片斷加熱變性klenow進行5-3聚合反應(yīng)隨機引物，一種a-32P-dNTP和

49、dNTPs5555555333333332P-dNTP32P-dNTP（1 1） T4 DNAT4 DNA聚合酶的性質(zhì)聚合酶的性質(zhì)3. T4 DNA3. T4 DNA聚合酶聚合酶從從T4T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由中分離純化。由噬菌體基因噬菌體基因4343編碼。編碼。有有5533聚合酶活性和聚合酶活性和3355外切外切酶活性（降解單鏈更快）。酶活性（降解單鏈更快）。 來源來源 酶活性酶活性 特點特點當沒有當沒有dNTPdNTP時，時，T4DNAT4DNA聚合酶行使聚合酶行使3355外切酶功能，制造出外切酶功能，制造出33隱蔽端。隱蔽端。如果只有一種

50、如果只有一種dNTPdNTP，則降解到該，則降解到該dNTPdNTP的的位置。位置。55335533T4 DNA聚合酶無dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs55（2 2） T4 DNAT4 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途標記末端（取代合成法）用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隱蔽端、5隱蔽端）制造出3隱蔽端。再利用它的53聚合酶活性補平，并加入放射性標記的dNTP。 補平隱蔽末端 DNA 3末端標記酶切中間產(chǎn)生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶（35外切）DNA酶切片斷T4 DNA聚合酶（53聚合）55335533553355335533內(nèi)切

51、酶切無dNTPs4. T7 DNA4. T7 DNA聚合酶聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成： T7基因5編碼的大亞基：有53聚合酶和35外切酶活性。 大腸桿菌編碼的小亞基： 硫氧還蛋白。增加大亞基對模板的親和性。（2 2）T7 DNAT7 DNA聚合酶的特點聚合酶的特點 持續(xù)合成能力強一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補鏈。 35外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。 不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙 進行末端標記 以大分子量DNA為模板的合成如M13 補平隱蔽末端（3 3）T7 DNAT7 DNA聚合酶的用聚合酶的用途途取代合成法

52、標記3末端。與T4 DNA聚合酶相同。合成補平3隱蔽末端；水解修平3突出末端。5. 5. 修飾的修飾的T7 DNAT7 DNA聚合酶聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學修飾去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7 DNA聚合酶的用途 DNA測序雙脫氧法。 標記DNA 3隱蔽末端 更有效地補平末端來源：是一種只在前淋巴細胞和淋巴細胞分化早期階段中存在的罕見的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。結(jié)構(gòu)：MW=60，000d.活性： 催化dNTP摻入DNA 3-OH末端，形成同聚物末端 反應(yīng)不需模板DNA，需Co2+。用途： 克隆DNA片段時加上互補同

53、聚物末端，便于與載體連接。 末端標記6.6.末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶( (不依賴模板的不依賴模板的DNADNA聚合聚合酶酶) )商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種來自禽類成髓細胞瘤病毒(AMV)。來自鼠類白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶。7. 7. 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶）。（1）來源酶類別肽鏈5-3聚合活性RNaseHRNaseH：以53或35方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。合成長cDNA M-MLV優(yōu)于AMV.RNaseHRNADNARNADNA（3 3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途 合成合成cDNAcDNA以以oligo dToligo dT為引

54、物（與為引物（與mRNAmRNA的的polyApolyA尾尾巴互補結(jié)合）。巴互補結(jié)合）。AAAAATTTTT53mRNA 5cDNA 核酸探針是指帶有標記物的已知序核酸探針是指帶有標記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補的核列的核酸片段，它能和與其互補的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測核酸樣品中特定基因序列的檢測。待測核酸樣品中特定基因序列的檢測。 核酸探針核酸探針 (Nucleic acid (Nucleic acid probe)probe) 1).1).按來源及性質(zhì)劃分按來源及性質(zhì)劃分 可將核酸探針分為基因組可將核酸探針分為基因組DNADNA探針、

55、探針、cDNAcDNA探針、探針、RNARNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類。探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類。較常使用的是基因組較常使用的是基因組DNADNA探針和探針和cDNAcDNA探針。探針。 2).2).按標記物劃分按標記物劃分 有放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類。有放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類。 放射性標記探針用放射性同位素做為標記物。 常用的同位素32P、3H、35S。其中，以32P應(yīng)用最普遍。 1.1.放射性標記探針放射性標記探針優(yōu)點：優(yōu)點：靈敏度高，可以檢測到靈敏度高，可以檢測到pgpg級。級。 放射自顯影效果好。放射自顯影效果好。缺點：缺點：半衰期短（

56、半衰期短（3232P P只有只有14.314.3天）天）不易保存、不易保存、對人體有害。對人體有害。要求在專門實驗室操作。要求在專門實驗室操作。2. 2. 非放射性標記探針非放射性標記探針i i）生物素標記：）生物素標記：生物素（生物素（biotinbiotin），又稱維生素），又稱維生素H H、輔酶、輔酶R R可以與可以與dNTPdNTP?；Y(jié)合成為生物素?；Y(jié)合成為生物素-1,6-dUTP-1,6-dUTP、生物素生物素-1,4-dATP-1,4-dATP、生物素、生物素-1,1-dUTP-1,1-dUTP等。等。CHCH2 2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH-CH-NH-CO-NH

57、-CH-(CH2 2) )4 4-COOH-COOH也可以被生物素連接酶（也可以被生物素連接酶（biotin ligasebiotin ligase）催化與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。催化與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。純化的純化的DNADNA片斷片斷DNase I DNase I 制制造單鏈缺口造單鏈缺口DNA Pol I DNA Pol I 進進行缺口轉(zhuǎn)移行缺口轉(zhuǎn)移生物素生物素-dTTP-dTTP和和dNTPsdNTPs5555555533333333生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口轉(zhuǎn)移法將生物素摻入利用缺口轉(zhuǎn)移法將生物素摻入DNADNA探針探針中中光敏生物素標記光敏生物素標記生物素生物素連接臂連接臂光敏基

58、團光敏基團探針序列探針序列探針序列探針序列生物素生物素連接臂連接臂光敏基團光敏基團+ +光照光照在強光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團即在強光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標記核酸，可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標記效率不高，每方法簡單，靈敏度也不低，但標記效率不高，每100100150150個堿基才能標記一個生物素，對于短的基個堿基才能標記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標記因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標記數(shù)過少而影響靈敏度（數(shù)過少而影響靈敏度（Forster et

59、 al 1985Forster et al 1985）。）。 抗生物素蛋白（抗生物素蛋白（avidinavidin）：）：鏈霉抗生物素蛋白（鏈霉抗生物素蛋白（streptavidinstreptavidin）：）：生物素的識別生物素的識別親和素親和素：是一種是一種雞雞卵清蛋白。卵清蛋白。細菌細菌中中avidinavidin的類似物。的類似物。能與生物素特異結(jié)合的蛋白或抗體，常用：能與生物素特異結(jié)合的蛋白或抗體，常用：iiii）地高辛標記：）地高辛標記：可以與可以與dNTPdNTP連接成地高辛連接成地高辛-dUTP-dUTP等，參入等，參入DNADNA合成過程。形成地高辛標記的合成過程。形成地高

60、辛標記的DNADNA探針。探針。生物素和地高辛標記的探針都有商品化生物素和地高辛標記的探針都有商品化的試劑盒的試劑盒 (kit)(kit)。地高辛的結(jié)合物是地高辛的結(jié)合物是抗地高辛抗體抗地高辛抗體。iiiiii）偶聯(lián)酶及其底）偶聯(lián)酶及其底物物常用的兩種酶：常用的兩種酶：辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶（h horseorser radish adish p perero oxidasexidase，HRPOHRPO）堿性磷酸酶堿性磷酸酶（A Alkaline lkaline P Phosphatase, APhosphatase, AP）催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程中催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過