pUC19質(zhì)粒DNA地提取、純化及檢測(cè)

1、大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2013年_9_月19日至10月3日 系年級(jí)2011級(jí)生物技術(shù)組別四 科目分子實(shí)驗(yàn) 學(xué)號(hào)同組者_(dá)題目PUC19質(zhì)粒dNA的提取，純化及檢測(cè)一、【實(shí)驗(yàn)題目】PUC19質(zhì)粒DNA勺提取，純化及檢測(cè)二、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握堿變性提取法提取質(zhì)粒的基本原理和方法，理解各種試劑的作用。2. 掌握質(zhì)粒純化的基本原理及各種試劑的作用。3. 掌握瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)分離的原理。4. 掌握瓊脂糖凝膠電泳的制備和電泳方法。5. 掌握瓊脂糖凝膠電泳的觀察方法及凝膠成像儀的操作方法。三、【實(shí)驗(yàn)試劑與器材】1. 材料大腸桿菌 DH5 （ E.COli DH5 ）2. 試劑LB液體培養(yǎng)基，氨芐青霉素（

2、Amp）母液（20mg/ml）,溶液I,溶液H,溶液叭 3MNaAc 溶液，無(wú)水乙醇，70比醇，TE溶液，Rnase A,苯酚/氯仿/異戊醇（25: 24： 1）,滅菌雙蒸 水 ddHO, 1 x TAE 6X loading buffer , Supercoiled DNALadder Marker,入-Hind III digest DNA Marker，溴化乙錠（EB）3. 儀器培養(yǎng)皿，接種環(huán)，三角瓶（100ml、300ml）,酒精燈，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，50ml離心管，1.5ml 塑料離心管（eppendorf 管）,高速離心機(jī)，漩渦振蕩器，移液槍?zhuān)煌吞?hào)槍頭（10ul ,200ul ,

3、 1ml）,電泳儀，微波爐，滅菌鍋，吸水紙，記號(hào)筆，移液管，洗耳球，PE手套，橡膠手套，滴管，天平，稱(chēng)量紙，冰箱，凝膠成像儀等 四、【實(shí)驗(yàn)原理】1. 堿變性法提取質(zhì)粒及酚、酚 /氯仿、氯仿/異戊醇純化質(zhì)粒質(zhì)粒由于分子小、能自主復(fù)制、攜帶抗性基因、便于分離和提取，經(jīng)常用在DNA重組中， 攜帶目的基因進(jìn)入細(xì)菌、 動(dòng)物細(xì)胞或植物體進(jìn)行擴(kuò)增與表達(dá)，是基因工程中一種非常重要的載體。構(gòu)建重組DNA分子需要首先從宿主細(xì)胞中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA提取和純化質(zhì)粒 DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯度離心法和 Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和

4、常用， 適于不同量質(zhì)粒 DNA勺提取。該方法操作簡(jiǎn)單，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測(cè)定及分析。堿變性提取質(zhì)粒 DNA 一般包括三個(gè)步驟：培養(yǎng)細(xì)菌以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分 離和純化質(zhì)粒DNA在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體 DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價(jià)閉合環(huán)狀形式存在。細(xì)胞破碎后，染色體 DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來(lái)，但是兩者變性與復(fù)性所依賴(lài)的溶液pH值不同。在pH值高達(dá)12.0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性； 共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA勺大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。 當(dāng)用pH值4.6的KAc （或NaA

5、c）高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可以恢復(fù)原來(lái)的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見(jiàn)的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過(guò)離心，與復(fù)性的溶 于溶液的質(zhì)粒 DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒 DNA可用無(wú)水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成 沉淀。由于DNA與 RNA性質(zhì)類(lèi)似，乙醇沉淀 DNA的同時(shí)，也伴隨著 RNA沉淀，可利用 RNase A將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過(guò)酚 /氯仿抽提除去， 最后獲得純度較高的質(zhì)粒 DNA。2. 瓊脂糖凝膠電泳 電泳是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中

6、向著與其電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH 條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介 質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。 含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因電離子的大小、 形態(tài)及電荷量的不同而有差異。 利用移動(dòng)速度差異， 就可以區(qū)別各種 大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)單而迅速，分辨率高，分辨圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接

7、檢測(cè)到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制 成各種形狀、 大小和孔徑， 也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。 選擇上述提及的參數(shù)或 條件主要取決于被分離的 DNA片段的大小。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，適用于較小分子核酸(5500bp)的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的分辨率非常高，長(zhǎng)度上相差1bp或質(zhì)量上相差0.1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA序列分析的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的DNA羊量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上還是繁瑣些。

8、聚丙烯酰胺凝膠電泳是在恒定電場(chǎng)中垂直方位上進(jìn)行的。瓊脂糖是從海藻中提取的長(zhǎng)鏈狀多聚物，由B-D-吡喃半乳糖與1,4連接的3,6-脫水-L-吡喃半乳糖組成，相對(duì)分子質(zhì)量為104105。當(dāng)瓊脂糖加熱至90 C左右，即可熔化形成清亮、透明的液體，澆在 模板上冷卻后固化形成凝膠，其凝固點(diǎn)為4045C。瓊脂糖比聚丙烯酰胺凝膠的分辨率略低，但它的分離圍更大(50至百萬(wàn)bp),小片段DNA( 5020000bp)最適合在恒定強(qiáng)度和方向的 電場(chǎng)中水平方向的瓊脂糖凝膠電泳分離。 瓊脂糖凝膠電泳易于操作， 適用于核酸電泳， 測(cè)定 DNA的相對(duì)分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA片段，進(jìn)一步純化 DNA等。瓊脂凝膠糖

9、電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基團(tuán)而帶負(fù)電荷，在 電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。 DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面6個(gè)因素：(1) 樣品DNA分子的大?。弘娪緯r(shí)，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其 遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量 (所含堿基) 的對(duì)數(shù)值成反比， 這是因?yàn)榇蠓肿佑懈蟮哪Σ磷枇Α?2) DNA分子的構(gòu)象：相對(duì)分子質(zhì)量相同而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過(guò)程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA的一條鏈斷裂，變成開(kāi)環(huán) DNA如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀DNA分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。 一般情況下，

10、超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子， 最慢的是 開(kāi)環(huán)狀分子。(3) 瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度不同。通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNA電泳遷移速度越快，因此，相對(duì)分子質(zhì)量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越低。(4) 電泳所用電場(chǎng)：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比，電壓越高，帶電顆粒泳動(dòng)越快，但隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同長(zhǎng)度DNA泳動(dòng)的增加程度不同，因此凝膠電泳分離 DNA勺有效圍隨著電壓上升而減少。為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場(chǎng)強(qiáng)度應(yīng)小于 5V/cm。（5）緩沖液：緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移

11、率。當(dāng)電泳液為去離子水，溶液的導(dǎo)電性很少，帶電顆粒泳動(dòng)很慢，DNA幾乎不移動(dòng)；而在高離子強(qiáng)度下，導(dǎo)電性極高，帶電顆粒泳動(dòng)很快，產(chǎn)生大量的熱，有時(shí)甚至熔化凝膠或使DNA變性。電泳時(shí)常用的緩沖液有乙酸鹽（TAE）、硼酸鹽（TBE和磷酸鹽（TPE幾種不同的電泳緩沖液，通常配成10X或5X的濃縮母液保存于室溫下，用時(shí)稀釋至工作濃度。電泳緩沖液的工作濃度約 50mmol/L,工作pH在7.57.8之間。TAE緩沖液緩沖能力弱，長(zhǎng)時(shí)間電泳 緩沖能力逐漸喪失邙日極變堿性，陰極變酸性），長(zhǎng)時(shí)間電泳需要更換緩沖液；TBE TPE緩沖液緩沖能力較強(qiáng)，可以重復(fù)使用數(shù)次。TAE緩沖液可以分離數(shù) kb長(zhǎng)度的DNA在精制

12、DNA片段以及染色體 DNA進(jìn)行雜交時(shí)比較常用。相反，TBE緩沖液適于鑒定、分離短小的DNA片段。（6） 溫度：瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，不同大小DNA片段的相對(duì)電泳遷移率在 430C無(wú)變化， 一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進(jìn)行， 而當(dāng)瓊脂糖含量少于 0.5%時(shí)，凝膠很脆弱，最好在4C 下電泳以增加凝膠強(qiáng)度。3. 常用的DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物的電泳圖譜及分子大小LambdaBs/EH (kb>LambdaHindin (kb)PBR322SsfNI (kb)B 457 246.375 6923.1 39.426.564 363 682 32 1 *931.371.262322 031861.06.70.

13、93225613381211t849 bp 10.085 bp 8,023 bp 6t133 bp5,026 bp3.997 bp 3,049 bp2,087 bp五、【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)配制LB液體培養(yǎng)基，分裝至 100ml三角瓶中20ml, 300ml的三角瓶中50ml，包扎。另配 LB固體培養(yǎng)基，包扎；準(zhǔn)備 10ul、200ul、1ml槍尖各一盒，1.5ml離心管若干于 500ml三 角瓶中，50ml離心管2個(gè)，移液管，包扎、標(biāo)記，連同 LB培養(yǎng)基一同滅菌。2. 菌體培養(yǎng)(1) 點(diǎn)燃酒精燈，將接種環(huán)在酒精燈上灼燒，冷卻，滅菌(2) 向20ml液體LB培養(yǎng)中加入20ul氨芐青霉素，混

14、合均勻。(3) 在含有氨芐青霉素的LB平板上，用接種環(huán)挑取提前活化的含有有質(zhì)粒pUC19的E.coliDH5單菌落，接種于(2)的培養(yǎng)基中，之一接種環(huán)的圓環(huán)處在液壁交界面研磨至菌苔分散 進(jìn)入培養(yǎng)液。(4 )用棉塞塞住瓶口，用牛皮紙包住，并用繩子系緊。(5) 37 C, 200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，約 12h。3. 擴(kuò)大培養(yǎng)吸取菌液0.8ml轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的 80ml LB液體培養(yǎng)基(Amp100ug/ml )中,37 C, 200rpm 振蕩培養(yǎng)6h。4. 質(zhì)粒提取(1 )稱(chēng)量一個(gè)50ml離心管的重量 w,記錄為14.53g。(2) 將35ml菌液轉(zhuǎn)入離心管，標(biāo)記為 2-4-1。菌液應(yīng)距管口

15、 1cm以防離心時(shí)菌液外溢，與 其它組同學(xué)配平后，于6000rpm離心5min,棄上清。(3) 加入5ml溶液I打散菌體洗滌，用漩渦振蕩器混勻，于6000rpm離心5min,棄上清， 稱(chēng)重w為14.69g,所以菌泥重量為 0.16g.(4) 向離心管中加入 2.0ml溶液I ,充分渦旋振蕩，冰浴 5min。(5) 向離心管中加入 4.0ml溶液n,懸滴快速加入，輕柔顛倒混勻，發(fā)現(xiàn)離心管中的溶液變得有一些粘稠，冰浴5min。(6) 向離心管中加入 3.0ml溶液川，緩慢輕柔上下顛倒混勻，發(fā)現(xiàn)離心管中出現(xiàn)了白色絮狀沉淀物，冰浴5mi n。(7) 12000rpm離心15min，將上清液輕輕轉(zhuǎn)入新的

16、離心管2,標(biāo)記為2-4-2，記錄上清液體積V為9ml.(8) 加入18ml冰乙醇，混勻，-20 C靜置15-30min。(9) 12000rpm 離心 15min,棄上清。(10) 加入5ml 70%乙醇，12000rpm離心5min,棄上清。(11 )重復(fù)洗滌一次；吸棄上清， 37 C風(fēng)干5-10min。(12 )分次加入1mlTE溶解沉淀并轉(zhuǎn)移到 Ep管中，得到質(zhì)粒 DNA粗提物，加入50ul RNase A, 37C靜置1-2h,-20 C保存待用。5. 質(zhì)粒純化(1 )向上次得到的粗提物平均分裝至兩個(gè)Ep管中。(2) 用滴管懸滴加入 500ulTris 飽和酚溶液，振蕩混勻，配平后于1

17、2000rpm離心5min, 觀察到溶液分為三層，上層澄清，中間為白色的蛋白，下層淡黃色。(3) 將上清液轉(zhuǎn)入新管，記錄兩管的體積均為450ul。(4) 用滴管分別向兩管懸滴加入450ul苯酚：氯仿：異戊醇溶液，顛倒混勻，觀察到溶液分為兩層，兩層均是透明無(wú)色，配平后于12000rpm離心5min。(5) 將上清液轉(zhuǎn)入新管，其中1號(hào)管體積為400ul，2號(hào)管體積為360ul。(6) 用滴管向1號(hào)管懸滴加入400ul氯仿/異戊醇，向1號(hào)管懸滴加入360ul氯仿/異戊醇， 顛倒混勻，配平后于 12000rpm離心5min。(7) 將上清液轉(zhuǎn)入新管，兩管轉(zhuǎn)移的液體的體積均為350ul。(8) 向上清液

18、中加入 35ul3M NaAc,混勻，加入770ul的冰無(wú)水乙醇混勻，-20 C沉淀30min。(9) 配平后于12000rpm離心15min.，棄上清。(10) 加入500ul 70%乙醇潤(rùn)洗沉淀表面一次，12000rpm離心2min，棄上清。(11) 重復(fù)洗滌一次，吸棄上清，37 C風(fēng)干5min。(12) 向其中一管加入 30ul TE溶解沉淀，然后將溶液轉(zhuǎn)移至另一管中，最終得到30ul純 化的質(zhì)粒DNA6. 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化的質(zhì)粒(1 )配制緩沖液：將50 X TAE稀釋至1X TAE緩沖液(2 )制膠：稱(chēng)取0.4g瓊脂糖于300ml三角燒瓶中，加40ml 1 X TAE制成1%瓊

19、脂糖凝膠。微 波爐加熱至瓊脂糖完全溶化，待冷卻至60C左右，緩慢倒入架有梳子的電泳膠板中，勿產(chǎn)生氣泡，靜置冷卻30min以上。待其完全凝固，垂直向上拔出梳子，將膠連同托盤(pán)一起放入電 泳槽中央，加入緩沖液，液面應(yīng)高于膠面1-2mm,準(zhǔn)備上樣。(3) 上樣：取 2.0ul 質(zhì)粒 DNA樣品、2.0ulddH 20及 1.0ul 6 X loading buffer 混勻，在加 樣孔上方1-2mm處垂直點(diǎn)樣，同時(shí)點(diǎn)樣5.0ul超螺旋 marker，100ngpUC19 5.0ulpUC19/Hind III 、10ul 入 DNA 5ul 入 DNA/Hind III ，100-120V 電泳 30

20、-40min (實(shí)際時(shí)間根據(jù)電泳條帶 的遷移情況判斷)。(4) 染色及觀察電泳完成后，將膠放入0.5ug/ml的EB染液中染色約10min，水洗，在凝 膠成像儀中觀察電泳結(jié)果，攝片，剪輯，保存，分析結(jié)果。7. 菌株的驗(yàn)證(1) 配制加入氨芐青霉素和不加氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基，滅菌，分別倒一個(gè)平板，標(biāo) 加入氨芐青霉素的標(biāo)號(hào)為 1,沒(méi)加氨芐青霉素的標(biāo)號(hào)為 2。(2) 用記號(hào)筆將平板分別分為兩部分，在酒精燈下分別將1號(hào)平板的左半部分接種 E.coliDH5，右半部分接種含 pUC19的 E.coli DH5 。（3）于37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天（4）觀察大腸桿菌的生長(zhǎng)情況，菌落的形態(tài)以及培養(yǎng)基的顏色變

21、化，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。六、【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表1 pUC19質(zhì)粒提取、純化和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄實(shí)驗(yàn)步驟項(xiàng)目量質(zhì)粒提取菌泥（g）0.16溶液1 (ml)2溶液II （ ml）4溶液 III （ ml）3質(zhì)粒檢測(cè)提取質(zhì)粒上樣量（ul）2純 pUC19±樣量（ul）5純 pUC19含量（ng）1002. 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表2 pUC19質(zhì)粒提取、純化和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象記錄和分析實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象分析質(zhì)粒提取向離心管1中加 入溶液II溶液變粘稠如蛋清狀溶液II是強(qiáng)堿性溶液，染色 體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié) 構(gòu)解開(kāi)而變性；質(zhì)粒 DNA大 部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ) 鏈不完全分離，在溶液中不 溶解向

22、離心管1中加入溶液III出現(xiàn)白色絮狀沉淀溶液III是高鹽溶液，調(diào)節(jié) 堿性溶液至中性，此時(shí)變性 的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)到原來(lái)的 共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而 溶解在溶液中，染色體 DNA 不能復(fù)性，與不穩(wěn)定的大分 子RNA蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物 儀器形成纏繞、可見(jiàn)的白色 絮狀沉淀加入冰無(wú)水乙 醇，沉淀30min后溶液出現(xiàn)少量白色沉 淀，肉眼可見(jiàn)DNA不溶于無(wú)水乙醇中，以沉 淀形式存在無(wú)水乙醇沉淀離心后管底部一側(cè)壁上沉積有白色沉淀質(zhì)粒在離心力作用下沉積在 外側(cè)管壁粗提質(zhì)粒質(zhì)粒大部分呈透明 狀，少部分地方發(fā)黃粗提質(zhì)粒不純凈，含有蛋白 質(zhì)等雜質(zhì)向管中加入Tris飽和酚，溶液分為三層，中層 可見(jiàn)白色沉淀苯酚使蛋白

23、質(zhì)變性而沉淀， 由于密度關(guān)系，出現(xiàn)上層酚、質(zhì)粒純化混勻離心后中層蛋白，下層水的現(xiàn)象向管中加入苯 酚/氯仿/異戊 醇，混勻離心溶液出現(xiàn)兩個(gè)分層， 沒(méi)有明顯顏色差異苯酚使蛋白變性，氯仿溶解 苯酚、脂質(zhì)，密度咼于水， 在上層，下層為水相向管中加入氯 仿/異戊醇，混 勻離心溶液出現(xiàn)兩個(gè)分層， 沒(méi)有明顯顏色差異異戊醇幫助分層，氯仿不溶 于水，由于密度關(guān)系出現(xiàn)分 層加入冰無(wú)水乙 醇，靜置至少30mi n理應(yīng)可見(jiàn)沉淀，但是 沒(méi)有看見(jiàn)沉淀沉淀量較少，肉眼不可見(jiàn)無(wú)水乙醇沉淀 后，離心管底部一側(cè)壁上出現(xiàn) 白色沉淀質(zhì)粒在離心力作用下沉淀下 來(lái)，得到純化的質(zhì)粒純化質(zhì)粒干燥 后基本呈無(wú)色透明狀， 有極少部分仍有淺黃 色

24、純質(zhì)粒為無(wú)色，淺黃色說(shuō)明 質(zhì)粒中仍有蛋白等雜質(zhì)的污 染3.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖一：堿裂解法 pUC1質(zhì)粒提取、純化和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳圖注釋?zhuān)弘娪緢D從左至右為1-18號(hào)點(diǎn)樣孔，其中1號(hào)孔為5.0ul超螺旋marker，2號(hào)孔為取 100ngpUC19 3 號(hào)孔為 5.0ulpUC19/Hind III ,10 號(hào)孔為 6.0ul 超螺旋 marker，17 號(hào)孔為 10ul入DNA 18號(hào)孔為5ul入DNA/Hind III ，我們組純化的質(zhì)粒在 7號(hào)孔。電泳結(jié)果圖分析：(1) 超螺旋質(zhì)粒pUC19大小約為2.7kb，應(yīng)在超螺旋 marker 2kb和3kb條帶之間。從圖譜 分析，我們組提

25、取質(zhì)粒大小正確。與標(biāo)準(zhǔn)pUC19質(zhì)粒電泳條帶對(duì)比，我們提取的質(zhì)粒電泳條 帶粗且亮，表明質(zhì)粒濃度很高，且上樣量較多，使條帶出現(xiàn)“溢出”現(xiàn)象，屬于正?，F(xiàn)象。(2) 在超螺旋質(zhì)粒 pUC19上方可以看見(jiàn)兩條帶，應(yīng)為質(zhì)粒的其它兩種構(gòu)型，其中開(kāi)環(huán)的泳 動(dòng)速度較慢，位于上方，線性構(gòu)型位于下方。(3) 電泳圖譜上方靠近點(diǎn)樣孔的位置可見(jiàn)系列條帶，根據(jù)入 -Hind III digest DNAMarker各條帶的分子量大小判斷，應(yīng)為染色體DNA說(shuō)明質(zhì)粒中存在著少量的染色體 DNA說(shuō)明質(zhì)粒受到了染色體 DNA的污染。原因可能是加入溶液 II過(guò)程持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者加入溶液 II混勻動(dòng)作幅度過(guò)大，使染色體DNA發(fā)生斷

26、裂。（4） 電泳圖譜的最下方可見(jiàn)微弱的條帶，該條帶應(yīng)為少量RNA殘留，說(shuō)明RNA酶未完全降 解RNA（5）如圖1所示，點(diǎn)樣孔附近有明顯亮光，分析原因可能是質(zhì)粒中仍有蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)污染，蛋白質(zhì)域 DNA吉合滯留在點(diǎn)樣孔，經(jīng)EB染色會(huì)發(fā)出熒光（6） 2號(hào)孔標(biāo)準(zhǔn)pUC19上樣含量100ng，我們加入的質(zhì)粒 DNA為2ul，粗略估計(jì)我們提取的 質(zhì)粒濃度約為100-150ng/ul之間。4. 菌株的驗(yàn)證圖二：菌株的驗(yàn)證左邊為含氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基，右邊為不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基，兩個(gè)培養(yǎng)基均接種了 E.coli DH5 , E.coli DH5（pUC19）表三：菌株的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象項(xiàng)目加氨芐青霉素

27、的麥康凱培養(yǎng)基沒(méi)加氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基E.coli DH5E.coliDH5(pUC19E.coli DH5E.coliDH5(pUC19生長(zhǎng)與否否生長(zhǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)菌落的形態(tài)、大 小、數(shù)量鮮桃紅色或微 紅色，菌落中 心呈深桃紅 色，圓形，扁 平，邊緣整齊， 表面光滑，數(shù) 量較多菌落白色，圓 形，扁平，邊 緣整齊，表面 光滑，菌落數(shù)量 稍微偏少菌落微紅，圓 形，扁平，邊 緣整齊，表面 光滑，菌落數(shù) 量較多培養(yǎng)基的顏色深紅（西瓜 紅）深紅（西瓜紅）橘黃色橘黃色上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說(shuō)明：氨芐青霉素是有效的。E.coli DH5 （ pUC19有氨芐青霉素抗性。七、【注意事項(xiàng)】1. 在接菌時(shí)，將挑有菌體的接種

28、環(huán)在三角瓶壁上靠近液面的地方輕輕碰觸，然后輕輕搖動(dòng)三角瓶，使液體LB培養(yǎng)基與菌體接觸，當(dāng)瓶壁接菌處有輕微渾濁現(xiàn)象時(shí)，說(shuō)明接菌成功。輕 輕震蕩三角瓶，使全部菌體進(jìn)入培養(yǎng)基中。2. 在離心管本身已經(jīng)有沉淀出現(xiàn)時(shí)，要在瓶壁上進(jìn)行標(biāo)記，以便在將離心管放入離心機(jī)時(shí)使沉淀朝外。另外使用離心機(jī)時(shí)要注意配平，取出離心管時(shí)注意小心輕拿，保持其傾斜狀態(tài)，防止沉淀重新進(jìn)入上清液中。3. 離心后，要去除上清液時(shí)，可以將離心管倒置在紙巾上除去殘留的液體，但要注意觀察沉淀是否穩(wěn)定，防止不小心把沉淀也去掉了。4. 加入溶液I時(shí)可以劇烈震蕩，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)菌還沒(méi)有與溶菌酶完全作用，染色體DNA還沒(méi)有釋放出來(lái)，不用擔(dān)心其斷裂。當(dāng)加

29、入溶液II、III后，必須注意不能過(guò)度用力震蕩，但是又必須保證溶液混合充分，可以上下顛倒離心管數(shù)次直至混勻。5. 進(jìn)行沉淀干燥時(shí)要注意離心管管壁上有沒(méi)有液珠，沉淀邊緣2mm要干燥至透明才可以，不然會(huì)引入雜質(zhì)。6. 用ImITE溶解沉淀時(shí)要注意吹氣助溶，不要產(chǎn)生氣泡。7. 苯酚試劑具有腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)該小心，皮膚如果不小心沾到酚，應(yīng)該立即用堿性溶液、 肥皂或大量清水沖洗。8點(diǎn)樣時(shí)要小心操作，可以用兩只手點(diǎn)樣，避免損壞凝膠，也不要快速擠出吸頭的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣孔。9.使用溴化乙錠染色時(shí)一定要做好防護(hù)措施，應(yīng)該多戴幾層手套。八、【實(shí)驗(yàn)分析與討論】1何為質(zhì)粒？其大?。科淇截悢?shù)？質(zhì)粒是附

30、加到細(xì)胞中的非細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子（即細(xì)胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)形，然而目前也發(fā)現(xiàn)有少數(shù) 的質(zhì)粒屬于線性構(gòu)形， 它存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的線粒體等胞器中。天然質(zhì)粒的DNA長(zhǎng)度從數(shù)千堿基對(duì)至數(shù)十萬(wàn)堿基對(duì)都有。質(zhì)粒拷貝數(shù)分為嚴(yán)謹(jǐn)型與松馳型。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)有限，大約1幾個(gè)；松馳型質(zhì)粒拷貝數(shù)較多， 可達(dá)幾百2.pUC19的大小和質(zhì)粒圖譜？ECOO1O9輕刃哥 DRAIII?©/MT 11躍孟罰 _ S6PI<=5D<)"INI宙冏ampRCFfilOl 078q).,_-

31、egui pgpUC19zsee bp呷If!卑MAR I Q37)/eHEI(2 至'I3CZ S /尸匚Q刊嚴(yán))/ I ?Ah| 11 (4CT)/；恨M斗I啊)/.嚴(yán) I (407)f / y ：;!>SP7ie(aQ /ayAVAi 詞加外I皆Pill (41奇皆司=兀IWM OF.氣 '<-iyiAi(4iiqi珂V：；SXBAM HI (41 'l也粘皆.嚴(yán)0陽(yáng)弊2書(shū) SA LG (3® MCI (4S1) HINGII (4彌 IND II 43 '/pen <4gBSP lull (44>SPHI (4呵H IN

32、IDlll 址©l3cZ' promoterPMB1 ori圖三：pUC19圖譜3. 質(zhì)粒在細(xì)胞的構(gòu)型有哪些？有超螺旋質(zhì)粒，環(huán)狀，線型三種。4. E.COli DH5的菌株特性？E.coli DH5是大腸桿菌endA基因發(fā)生突變的菌株，在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可 與載體編碼的B-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)a-互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。菌株中很多重組酶、修飾酶等缺失，防止質(zhì)粒的重組、修飾，能夠保持?jǐn)y帶質(zhì)粒的穩(wěn)定性。一般 常用于質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增，較少用于蛋白表達(dá)。5. 如何將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分離？檢測(cè)中如何判斷？堿性條件下，染色體DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性，

33、質(zhì)粒DNA的氫鍵斷裂但兩條互補(bǔ)鏈彼此纏 繞。恢復(fù)中性時(shí)，染色體 DNA難以復(fù)性，質(zhì)粒DNA分子很快復(fù)性，離心時(shí)染色體 DNA與細(xì)胞 碎片一起被沉淀出來(lái)，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中，由于染色體DNA片段的大小比質(zhì)粒 DNA大，電泳時(shí)染色體 DNA的遷移速率比質(zhì)粒 DNA的小，距點(diǎn)樣孔的距離短，由此可以將質(zhì)粒 DNA與染色體DNA分離。6. 如何將質(zhì)粒DNA與細(xì)胞RNA組分分離？檢測(cè)中如何判斷？純化質(zhì)粒時(shí)加入 RNA酶將RNA消化，從而將質(zhì)粒DNA與細(xì)胞RNA分離，純化的質(zhì)粒中殘留的 RNA也是經(jīng)RNA酶消化的小片段的 RNA電泳時(shí)遷移速率較快，距點(diǎn)樣孔的距離比質(zhì)粒DNA遠(yuǎn)。7. 如何將質(zhì)粒DNA

34、與細(xì)胞蛋白質(zhì)組分分離？檢測(cè)中如何判斷？Tris飽和酚使蛋白質(zhì)變性而去除蛋白質(zhì)，電泳時(shí)蛋白質(zhì)不移動(dòng)，依然滯留在點(diǎn)樣孔，點(diǎn)樣ATCC 37254孔附近有明顯亮光，分析原因可能是質(zhì)粒中仍有蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)污染，蛋白質(zhì)域 DNA 結(jié)合滯留在點(diǎn)樣孔，經(jīng) EB 染色會(huì)發(fā)出熒光。8. 瓊脂糖凝膠電泳的緩沖液選擇原則？緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移率。 當(dāng)電泳液為去離子水， 溶液的導(dǎo)電性很少， 帶電顆粒泳動(dòng)很慢，DNA幾乎不移動(dòng)；而在高離子強(qiáng)度下，導(dǎo)電性極高，帶電顆粒泳動(dòng)很快， 產(chǎn)生大量的熱，有時(shí)甚至熔化凝膠或使DNA變性。根據(jù)所鑒定的分子的大小選擇緩沖液。電泳時(shí)常用的緩沖液有乙酸鹽（ TAE、硼酸鹽（

35、TB日和磷酸鹽（TPE幾種不同的電泳緩沖 液，通常配成10X或5 X的濃縮母液保存于室溫下，用時(shí)稀釋至工作濃度。電泳緩沖液的工作濃度約50mmol/L,工作pH在7.57.8之間。TAE緩沖液緩沖能力弱，長(zhǎng)時(shí)間電泳緩沖能 力逐漸喪失邙日極變堿性，陰極變酸性），長(zhǎng)時(shí)間電泳需要更換緩沖液；TBE、TPE緩沖液緩沖能力較強(qiáng)，可以重復(fù)使用數(shù)次。TAE緩沖液可以分離數(shù) kb長(zhǎng)度的DNA在精制DNA片段以 及染色體DNA進(jìn)行雜交時(shí)比較常用。相反，TBE緩沖液適于鑒定、分離短小的DNA片段。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低， PH 值上升，緩沖性能下降，可能使 DNA 電泳 產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的 D

36、NA 帶遷移的現(xiàn)象 .9. 瓊脂糖凝膠電泳的濃度選擇原則？瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速 度不同。通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNA電泳遷移速度越快，因此，相對(duì)分子質(zhì)量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越低。11. 同一質(zhì)粒的不同構(gòu)型，在電泳中的遷移速率的差異？在凝膠上的表現(xiàn)行為如何？相對(duì)分子質(zhì)量相同而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過(guò)程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA的條鏈斷裂，變成開(kāi)環(huán) DNA如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀DNA分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。一般情況下， 超螺旋型遷移

37、速度最快， 其次為線狀分子， 最慢的是開(kāi)環(huán)狀分子。在凝膠上表現(xiàn)為距 點(diǎn)樣孔的距離為超螺旋型 線狀分子 開(kāi)環(huán)狀分子 .12. 同一構(gòu)型的不同大小的質(zhì)?；蛘咂卧陔娪緯r(shí)的遷移率差異？在凝膠上的表現(xiàn)行為如何？同一構(gòu)型的不同大小的質(zhì)?；蛘咂畏肿釉酱?， 摩擦阻力越大， 遷移越慢在凝膠上表現(xiàn)為分 子越大的距點(diǎn)樣孔的距離越小。13. 溶液 I 的作用溶液 I：50mmol/L 葡萄糖， 25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）， 10mmol/LEDTA。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力作用而降解。EDTA整合Mg+、Ca2+等金屬離子，抑制 DNase對(duì)DNA的降解作用。另外，EDTA的存在，有 利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。14. 溶液 II 的作用溶液 II : 0.2mol/L NaOH , 1%SD（臨用前用 10mol/L NaOH 和 20%SDS母液配制）。NaOH DNA在 pH大于5、小于9的溶液中是穩(wěn)定的。但當(dāng) pH 12或pHv 3時(shí)，就會(huì)引起雙 鏈之間的