laballiance高效液相操作

1、液相色譜培訓(xùn)教材 天津蘭博實驗儀器設(shè)備有限公司 2011.04 主要內(nèi)容 ? 液相色譜儀的基本原理 ? 液相色譜儀的操作過程與一般規(guī)則 ?LabAlliance 液相色譜儀組成與使用方法 ? 常見使用故障及維護 ? 液相色譜儀的基本原理 ? 早在年，俄國的植物學(xué)家茨維特將含有植物色素的石油醚溶液倒入一根內(nèi)部填充著碳酸鈣粉末的玻璃管中，再不斷用石油醚淋洗，隨著石油醚的不斷下降，玻璃管中形成了不同顏色的譜帶，從而成功地將不同的色素分離開來。“色譜”也就由此而得名。 ? 淋洗用的石油醚稱為流動相，玻璃管中的碳酸鈣稱為固定相，玻璃管稱為色譜柱，后來這種方法廣泛地應(yīng)用于多種混合物的分離，并成為一種很重要

2、的儀器分析方法。 ? 色譜法(chromatography) 是一種物理、化學(xué)的分離、分析方法。它利用混合物各組分在互相接觸的固定相和流動相中有不同的分配比（或吸附能力的差異），當(dāng)兩相作相對運動時，這些組分在兩相中多次反復(fù)分配平衡，從而使各組分得到分離，然后按順序被檢測。 液相色譜儀原理示意圖 進樣器 色譜柱 流動相 檢測器 工作站 時間 ? 組分從色譜柱流出時，檢測器響應(yīng)信號大小隨時間變化所形成的曲線叫色譜圖，它是定性、定量分析和評價色譜分離情況的基本依據(jù) 液相色譜儀需要了解的幾個概念 液相色譜儀需要了解的幾個概念 ? 保留時間（tR）：自進樣至出現(xiàn)色譜峰最高點所用的時間，稱為保留時間，以分

3、鐘Min為單位 ? 峰高（h）： 色譜峰頂點與基線之間的垂直距離。以mv或mAu表示。 ? 峰面積（）： 由峰和峰底之間圍成的面積。峰面積被用作定量分析的指標(biāo)。 ? 理論塔板數(shù)(TP)：色譜的柱效參數(shù)之一,用于定量表示色譜柱的分離效率 ? 液相色譜儀的操作過程與注意事項 液相色譜分析流程-開機平衡 1.開機：依次打開泵、檢測器、柱溫箱、自動進樣器、工作站電源，在電腦上雙擊工作站圖標(biāo)進入工作站主界面。 2.用5%甲醇（或5%乙腈）沖洗色譜柱15分鐘 3.換上流動相，設(shè)定好參數(shù)（波長，柱溫，流速，采樣時 間等）后開泵，平衡系統(tǒng)大約30分鐘到小時 三聚氰胺 1. 對于三聚氰胺的檢測，波長設(shè)為240n

4、m,柱0溫40 C,流速1.0ml/min，采樣時間設(shè)為20-30min（根據(jù)出峰時間而定） 2. 平衡時間以基線走平為準(zhǔn)，只要基線平直就可以運行進樣程序。 液相色譜分析流程-進樣分析 1.按國標(biāo)要求進不同濃度標(biāo)樣，得到一系列譜圖，用濃度與峰面積的值導(dǎo)出2線性方程。計算該線性方程的R 值 2.進處理好的樣品。得樣品峰譜圖。 3.將樣品峰面積代入線性方程和國標(biāo)公式，計算含量。得到樣品中被測物的含量。 液相色譜分析流程-沖洗系統(tǒng) 1.進完樣品后，將流動相換成5%甲醇水溶液沖柱1小時，目的是為了徹底洗去系統(tǒng)中殘留的緩沖鹽 2.將5%甲醇水溶液換成100%甲醇沖洗30分鐘。 3.停泵，關(guān)機，關(guān)電源。

5、液相色譜分析流程-沖洗系統(tǒng) 注意： 1. 做完實驗后系統(tǒng)中存在含鹽流動相的情況下，萬萬不可直接將甲醇或乙腈導(dǎo)入系統(tǒng)中，因為大部分緩沖鹽在甲醇或乙腈中是不溶的，從而導(dǎo)致鹽析出，損壞儀器。 2. 用5%甲醇而不用純水是為了保護色譜柱。 液相色譜分析流程-三聚氰胺平衡，沖洗方法 針對三聚氰胺的流動相中含有的離子對緩沖鹽的情況，我們建議在做完實驗之后用同樣比例不含鹽的乙腈：水=15:85或是10:90沖洗系統(tǒng) 1小時，然換成50：50的乙腈：水沖洗 30分鐘后關(guān)機，再次做實驗時，直接用流動相平衡系統(tǒng)即可。長時間不用時，再用純甲醇沖洗，保存。 操作注意事項-流動相 1. 流動相須現(xiàn)用現(xiàn)配。 2. 使用H

6、PLC級或相當(dāng)于該級別的流動相，并要先經(jīng)0.45m薄膜過濾。 3. 如有仍有氣泡產(chǎn)生，還需超聲15分鐘。 4. 在使用儀器過程中，注意貯液瓶里的流動相是否夠用，在一次分析中，不要加注流動相，加注或更換后需重新平衡。 操作注意事項-電源 1. 電壓需保持穩(wěn)定，配3KW凈化穩(wěn)壓電源防止電壓不穩(wěn)對儀器造成傷害。 2. 地線。必須確保獨立地線已連接好，否則會增加基線噪聲，造成靈敏度下降，甚至無法分析。 3. 不能短時間內(nèi)反復(fù)開關(guān)機。尤其是紫外檢測器，兩次開關(guān)機時間間隔5分鐘以上。 4. 由于液相色譜組件較多，請選用質(zhì)量較好的接線板，防止虛接造成瞬間電流過大，損壞儀器。 操作注意事項- 色譜柱 1、色譜

7、柱的保存 （1）反相色譜柱每天實驗后的保養(yǎng)：使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應(yīng)用5%的甲醇/水沖洗60分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入5%的甲醇。 （2）長期保存色譜柱：如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度最好是室溫。 操作注意事項- 色譜柱 2. 更換色譜柱時，需將管子完全插入開口端，直至其與開口端的末端相碰為止。否則將產(chǎn)生死體積，引起峰展寬，或是肩峰。

8、操作注意事項-自清洗液 ? 在線自清洗。在線自清洗是SSI的專利設(shè)計 ，其的作用的是為了自動清潔泵頭柱塞，延長其使用壽命，自清洗液為20%的甲醇溶液，在用含鹽流動相時，建議每三天更換一次，不含鹽時每周換一次，達(dá)到最好的清洗效果。 小結(jié)： ? 必須嚴(yán)格按照上述操作規(guī)程進行操作，才能避免損壞儀器。 ? LabAlliance 液相色譜儀組成與使用方法 液相色譜儀原理示意圖 高效液相色譜系統(tǒng) ? 泵泵 進樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測器 工作站 柱后衍生裝置 液相色譜泵外觀圖 高壓自清洗泵 旁通閥 出口單向閥 模式切換 泵頭 調(diào)節(jié)流速 入口單向閥 開泵/關(guān)泵 出口過濾器 泵面板上的操作按鍵 泵的開啟和

9、關(guān)閉 增加流量 減小流量 最大流速沖洗泵，禁用。 流速，壓力，高壓，低壓限制的設(shè)定切換 泵頭演示圖 泵頭剖面圖 ? 泵 進樣器進樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測器 工作站 柱后衍生裝置 手動進樣器 ? 泵 進樣器 色譜柱色譜柱 檢測器 工作站 柱后衍生裝置 色譜柱固定相分子結(jié)構(gòu) 色譜柱類型 ? 泵 進樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測器檢測器 工作站 柱后衍生裝置 201+檢測器 操作界面 201+檢測器的菜單 ? SIGNAL 菜單 signal: 0.0000 :254 t:0.2 ON 信號菜單或主菜單包涵信號強度signal:, 波長 :, 時間常數(shù)t: 和燈的狀態(tài)。 ? 實際測量的信號值顯示為

10、一個帶四位小數(shù)的數(shù)字。測量波長: 可以在 190 至 740 納米區(qū)間，變動精度為一個納米。 ? 使用時間常數(shù)t: 您可以使信號更平滑。它的值可以被設(shè)置為0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 或10 秒. 這個值設(shè)置得越大，信號就越平滑。時間常數(shù)為1秒時一般是作分析時的最佳值。 ?最后您可以在這個菜單開關(guān)燈，分別用ON和 OFF 按鈕。 201+檢測器的菜單 ? ?UNITS菜單 UNITS signal: au :nm t:s 這個菜單僅作信息顯示用，不能改變。顯示的是信號菜單中各個值的單位。 201+檢測器的菜單 ? SCAN 菜單 SCAN: 620-740 -F go AZ

11、speed:0Hz ?您可以在停止流通模式作掃描。有四種掃描速率供選擇。掃描范圍可以設(shè)置，此前可以先自動歸零。截止濾波器可以啟用(+F) 或無效 (-F). 201+檢測器的菜單 ? PROG 菜單 PROG 000.00-254 go 000.00- PROG菜單可以輸入一個可以改變波長的時序程序。 如何輸入和執(zhí)行一個程序的方法將在“輸入一個程序”部分詳述。程序包括起始和結(jié)束行最多可以包括11行。 201+檢測器的菜單 ? ?INT菜單 這個菜單僅作信息顯示用，不能改變。 INT sig:0.6543 1/8 ref:0.3848 sig 和 ref的值分別記錄信號的強度和參比信道。sig

12、和 ref值的范圍在0和1之間。它們依賴于所選的波長，使用的溶劑、流通池和燈的使用年限。兩者值的比率應(yīng)該在1:1.5和1:1.8之間。 如出入較大則說明有可能流通池臟了或者是溶劑在所選波長處吸收過強。 201+檢測器的菜單 ? EXT. CONTROL菜單 EXT. CONTROL: keyboard 此菜單可選擇控制模式，外部儀器(external control = analog)或單機模式（選擇鍵盤）。 201+檢測器的菜單 ? ANALOG OUT 菜單 ANALOG OUT: au full scale: 1e-0 ANALOG OUT菜單是用來標(biāo)定模擬輸出信號的。 一般說來最大輸出

13、信號是1 V. 根據(jù)實際情況您可以決定對于這個信號的最大值用多大的單位和相應(yīng)的滿量程偏差。可以選擇1e-4, 2e-4, 5e-4, 1e-3, 2e-3, 5e-3, 1e-, 2e-2, 5e-2, 1e-1, 2e-1, 5e-1, 1e-0, 2e-0, 5e-0 或 1e+1 單位 (分別對應(yīng)于 0.0001, 0.0002, 0.0005, 0.001, 0,002 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 和 10)。 201+檢測器的菜單 ? LAMP 菜單 ? ?LAMP: ? Deuterium ?這個菜單用于輸入適用

14、于軟件的燈的類型。選項有氘燈（Deuterium）和鹵（Halogen）燈。 ?如果確實更換了燈的類型，設(shè)置才可以改變。如果設(shè)置和實際裝備不符，儀器將無法正確地工作。 201+檢測器的菜單 ? ?-RANGE/FILTER菜單 -RANGE: 190-740 ? FILTER:380 波長范圍可以被限制為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。然后在此范圍內(nèi)的選值。大于380納米時可用一邊緣濾波器來增大選擇性。在這種情況下要注意靈敏度的降低問題。 201+檢測器的菜單 ? A-IN 菜單 A-IN Set-Zero actual 000nm A-IN-(Analog-IN) 菜單是用來調(diào)整模擬輸入的。使Set-Zero 有

15、效意味著輸入端的電壓信號為000納米。例如當(dāng)在輸入施以一5V電壓時，actual欄將顯示500nm作為波長值。 假設(shè)1V = 100 nm, 500 nm. 生成另一個校準(zhǔn)點，可用波長 或 鍵改變波長值。 201+檢測器的菜單 ? GLP菜單 GLP S/N:00047755 01 00962.Oh 101 GLP菜單包涵了下列信息： 序列號，所用燈的總數(shù)，當(dāng)前燈的總工作時間和啟動燈的數(shù)量。 ? 泵 進樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測器 工作站工作站 柱后衍生裝置 工作站界面圖 采集步驟設(shè)定方法 打開工作站 在主界面中設(shè)置 “譜圖采集參數(shù)”- “ 采集時間 選項 此選項設(shè)置要與自動自樣器保持一致。

16、 開啟自動進樣程序 數(shù)據(jù)處理-打開譜圖 1. 打開標(biāo)樣譜圖 點擊 文件- 打開命令 在彈出的對話框中選擇標(biāo)樣的譜圖文件 數(shù)據(jù)處理-設(shè)定積分參數(shù) 1. 在打開的譜圖最前端點擊右鍵 。在彈出的對話框中選”自動生成譜圖處理表項”-“ 開始禁止判峰（刪除起點）“ 數(shù)據(jù)處理-設(shè)定積分參數(shù) 1. 在我們需要的峰的前面點擊自動生成譜圖處理表項-開始”峰分離處理（谷點改終點）“自動判峰積分 數(shù)據(jù)處理-設(shè)定積分參數(shù) ? 。 譜圖處理 表項中已自動填入?yún)?shù)。 完成時，我們所需要的峰已積分。 數(shù)據(jù)處理-設(shè)定組分表 1. 在峰的內(nèi)部點面擊右鍵選擇“自動填寫定量組份表中時間-套峰時間 2. 此時套峰時間中會自動填入峰的

17、保留時間 3. 填入組分名稱，濃度值 數(shù)據(jù)處理-定量計算 1. 點擊”定量方法“表項，選擇”計算校正因子“ 2.點擊定量計算按鈕 數(shù)據(jù)處理-查看計算結(jié)果 計算結(jié)果將顯示在上圖中。點擊”當(dāng)前表存檔。即保存了當(dāng)前的數(shù)據(jù)。 數(shù)據(jù)處理-制作工作曲線 ? 不斷重復(fù)上述過程，將不同濃度的標(biāo)樣全部處理過后，進入存檔。 ? 點擊“定量方法”表項,選擇“工作曲線”-計算按鈕 ? 點擊顯示,即可顯示出工作曲線。 數(shù)據(jù)處理-基于工作曲線的樣品含量計算 打開樣品譜圖，積分，設(shè)定組分（按前述方法） 選擇多點柆正 乘數(shù)1：定容體積 乘數(shù)2：稀釋倍數(shù) 除數(shù)： 稱樣量 輸入完畢后，點擊定量計算 數(shù)據(jù)處理-結(jié)果顯示 最終含量在

18、此顯示 報告打印 點擊打印機圖標(biāo)，打印報告 報告打印-通過word 或是寫字板 ? 泵 進樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測器 工作站 柱后衍生裝置柱后衍生裝置 柱后衍生系統(tǒng)PCR 主要應(yīng)用領(lǐng)域主要應(yīng)用領(lǐng)域 ? 氨基甲酸酯 ? 草甘膦 ? 黃曲霉毒素 ? 氨基酸 （OPA） ? 氨基酸 （Ninhydrin） 小結(jié)： 常用的液相色譜由以上幾部分組成。熟悉每個組件的功能與作用，能夠幫助我們對使用中出現(xiàn)的問題進行正確的判斷與排查。 ? 常見使用故障及維護 檢查指標(biāo) ?每日檢查，記錄： 1. 泵壓力，保留時間是否穩(wěn)定 2. 峰面積與濃度的比值 每周檢查： 1. 線性 2. 重復(fù)性 3. 標(biāo)準(zhǔn)品有效性 壓力過大 ? 1. 是否是剛剛換上流動相，未平衡，多等 10分鐘看壓力是不是已經(jīng)下降。同時檢查流動相配比是否正確，是否已過濾，混勻。 ? 2. 若壓力一直很穩(wěn)定，停泵，待壓力降下來后，拆下色