MS培養(yǎng)基及配制注意事項

1、、MS培養(yǎng)基母液的配制母液成分規(guī)定量濃縮倍數(shù)稱取量(mg)母液體積(ml)配制1升 培養(yǎng)基吸 取量定容編號種類1大量 元 素KNO3190010190001000100NH4NO316501016500MgSO4 7H2O370103700KH2PO41701017002CaCl2 2H2O44010440010001003微量元 素MnSO4 4H2O22.31002230100010ZnSO4 7H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO4 7H2O0.2510025CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.025100

2、2.54鐵鹽Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有機物甘氨酸2.010010050010鹽酸吡哆醇0.510025鹽酸硫銨素0.11005煙酸0.5100256肌酸100100500050010注意：1 大量元素按照使用時高io倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量后，除CaCl2 2H2O單獨配制夕卜，其余化合物混合在 500ml燒杯中加適量蒸餾水溶解，用玻璃棒攪 拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，置小口瓶中保存，貼上標簽注明化合 物名稱(或編號)，濃縮倍數(shù)，配制日期和配制者姓名，CaCl22H2O配制同上置于另一小口瓶

3、中。2 微量元素母液的配制按要求濃縮 100倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量除鐵鹽(FeSO4 7H2O和Na2-EDTA.2H 2O)作為一組單獨配制外，其余化合物可混合置于燒杯內加少量蒸餾水溶解后，定容在 1000ml 容量瓶中，置小口瓶中保存，貼上標簽。3. 鐵鹽配制將 FeSO4 7H2O和Na2-EDTA.2H 2。分別溶于450ml蒸餾水中，加熱，（很重要） 不斷攪拌，溶解后，兩液混合，調PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，貼上標簽。4. 有機物母液配制，按母液要求濃縮50 倍，除蔗糖按 3%單獨臨時稱量外，其余分別稱量 后，溶解，定容在 500ml 容量瓶中，置于

4、小口瓶中保存，貼上標簽。5. 母液最好在 24C的冰箱中貯存，特別是有機類物質，貯存時間不宜過長，無機鹽母液 最好在一個月內用完，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀產(chǎn)生，就不能再使用。1 . 制備母液和營養(yǎng)培養(yǎng)基時，所用蒸餾水或無離子水必須符合標準要求，化學藥品必須是 高純度的（分析純） 。2. 稱量藥物采用高靈敏度的天平，每種藥品專用一藥匙。 .生長調節(jié)劑母液配制：為了操作方便，節(jié)約時間，生長調節(jié)劑也可如同配制母液一樣，先配成原液，這樣配制 培養(yǎng)基時只要稍加計算，按需要量取即可。不同藥品在配制時若不溶于水，可用少量不同的溶劑先溶解，萘乙酸（NAA ），吲哚乙酸（IAA ）赤霉素（GA3）, 2, 4-D等生

5、長素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然 后加水，如溶解不完全再加熱。激動素（KT）和6-芐基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的鹽酸中，葉酸需用少量稀氨水溶解。稱取 50mg 生長調節(jié)物質，溶解后，在 100ml 的容量瓶中定容，配制的母液每毫升則含有生 長調節(jié)物質0.5mg，配制后一般要求在低溫（04 C）保存，配制培養(yǎng)基時如每升（1000ml） 需添加的生長調節(jié)劑物質為 0.5mg 時，則取 1ml 母液即可。二、培養(yǎng)基配制和滅菌一.養(yǎng)培養(yǎng)基配制程序（一）.母液吸取量的計算配制培養(yǎng)基的升數(shù)公式1:母液吸取量=母液體積（CC）X母液濃縮倍數(shù)培養(yǎng)基要求的含量公式 2:母液吸取量（各種

6、生長調節(jié)劑）母液每 CC 的含量（二）各種母液按順序編號排列A. 大 量 元 素 ； B.CaCl2.2H2O； C. 微 量 元 素 ； D. 鐵 鹽 ； E. 有 機 物 ；F.生長素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA稱取50mg , NAA用少量95%酒精溶解 后加蒸餾水定容至 1000ml; G.細胞分裂素、激動素（KT ）配制0.5mg/ml的KT 稱50mgKT 用少量1N HCL溶解后，加蒸餾水定容至100ml。（三）配制培養(yǎng)基（ 1000ml）1. 瓊脂 : 稱取 57g 瓊脂，加入 300ml 蒸餾水，加熱溶解直至完全溶解為止 .2. 蔗糖 3%用質量較好的白糖代

7、替，稱取 30g 白糖， 溶于溶有瓊脂的 300ml 蒸餾水中。3. 各種母液的吸?。ㄅ?養(yǎng)基1L）（1）用50ml量筒量取大量元素母液（ A）和CaCl2 2H2O母液（B）各100ml（2）分別用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C）,鐵鹽（D）母液各10ml（ 3） 用 10ml 移液管或吸管吸取有機物（ H） 10ml（4） 移取激素將上述溶液全部混合于瓊脂與蔗糖溶液中，混合均勻后，加熱至80 C左右，用酸度計或精密 PH 試紙測定培養(yǎng)基的 PH 一般要求 5.86.0，過酸過堿則用 1N NaoH 和 1N HCL 調 整。二分裝：用一個接有膠管的分裝器趁熱裝培養(yǎng)基，1000ml 培

8、養(yǎng)基分裝到 25-30 個三角瓶中，每個三角瓶約 30ml 左右（一般占試管、三角瓶容量 1/41/3 左右）注：培養(yǎng)基勿碰瓶 壁。三. 包裝：分裝好的三角瓶用封口膜包扎好，標明培養(yǎng)基代號即可進行滅菌。 用具清理和洗滌：各種母液按原位置擺整齊，用過的量筒，移液管、燒杯、鋁鍋等用水 洗滌干凈，然后按次序放回原處。三、高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法具體操作步驟：1. 高壓鍋放水至平把架；2. 把包扎好的培養(yǎng)基裝入高壓鍋 ;3. 蓋上熱壓鍋蓋 ,上緊螺帽 （注意對角擰緊螺帽 ）關上氣閥和安全閥 .4. 然后接通電源 .5. 壓力計升至 0.05MPa 時，打開放氣閥 ,排除冷空氣 （此步很重要 ）。6.

9、排除冷空氣后 ,關閉放氣閥，待壓力升到 0.11MPa 位置時，開始計算滅菌時間， 具體方 法：當壓力鍋指針升至 0.12MPa 時，關閉電源，待指針下降至 0.11MPa 時接通電源，不斷 重復此操作過程，維持 20 分鐘。7. 滅菌時間達到 20 分鐘后， 除去電源， 打開放氣閥 （注意要逐漸放氣 ）待高壓鍋內的空氣完 全排除后，打開熱壓滅菌鍋蓋 （注意對角扭松螺帽 ）稍待冷后再把培養(yǎng)基取出。8. 經(jīng)過滅菌的營養(yǎng)培養(yǎng)基不宜放置太長，應盡早使用，但為了在使用前能檢查培養(yǎng)基有無微生物污染，可將培養(yǎng)基置于25 C下保存4天，如果培養(yǎng)基需要貯存較長時間，可在4C低溫下保存。滅菌高壓鍋有大型臥式、中

10、型立式、小型手提式等多種型號和規(guī)格，無論哪種型號，操 作的步驟都很相近。進水t放進培養(yǎng)基t蓋緊鍋蓋t關上放汽閥t檢查安全閥t接上加熱源t待壓力升至0.05MPa時排鍋內冷空氣，關上放氣閥t0.11MPa（12C ）下滅菌2025分鐘，保持穩(wěn)定壓力t除熱源t逐漸打開放氣閥t鍋內空氣排除完后t開放鍋蓋t稍冷后取出培養(yǎng)基。四、無菌操作技術（一） 植物材料表面 消毒劑滅菌從外界或室內選取的植物材料， 都不同程度地帶有各種微生物。 這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基， 便會造成培養(yǎng)基污染。 因此， 植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理， 再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到 培養(yǎng)基 上，這一過程叫做接種。1. 接種步驟：第一步：清理

11、材料tt流水沖洗tt加入吐溫（或洗衣粉）清洗tt自來水沖洗第二步：對材料的表面浸潤滅菌：70%酒精浸10-30秒tt無菌水第三步：滅菌劑處理tt0.1-1%升汞5-8 min （或其他滅菌劑）第四步：無菌水進行沖洗注意事項：1. 滅菌劑一般要臨時配制，現(xiàn)配現(xiàn)用升汞可以短期儲存.2 .對去除較容易的滅菌劑滅菌后無菌水沖洗3-4次，升汞一般5 -8次，每次不少于3 min3 .滅菌時要輕輕的攪拌，消除氣泡，使消毒更徹底.4 .滅菌時間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時為止。5 .滅菌液要充分浸沒材料2. 無菌操作可按以下步驟進行：(1) 在接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前3小時打開其內紫外線

12、燈進行殺菌；(2) 在接種前20分鐘，打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外線燈；(3) 接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等；(4) 上工作臺后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺面；(5) 先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復過火尖端 處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；(6) 接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對材料進行適當?shù)那懈睢?如葉片切成0.5cm2 的小塊；莖切成含有一個節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含1-2片葉原基)在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。(7) 接

13、種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外線燈滅菌 30分鐘，若連續(xù)接種，每 5天要大 強度滅菌一次。常用植物激素類別名稱縮寫詞分子量使用濃度范圍母液配制說明生長素2, 4二氯苯氧乙酸2, 4 D221.00.001 10mg/L生長素通常 用NaOH溶 液滴至溶解 成溶液。能溶于乙醇IAA易被植物 細胞所氧化。 故培養(yǎng)基中很 少單獨使用。a 萘乙酸NAA186.20.001 10mg/L吲哚一3 乙酸IAA175.20.001 10mg/L吲哚一3丁酸IBA203.20.001 10mg/L細 胞 分 裂6芐基氨基嘌呤BA225.2分裂素通常 能溶于稀NaOH，含水乙醇或稀鹽曲厶酸玉米素不耐 熱，不

14、能高壓 滅菌。6-糠基氨基嘌呤KT215.2N異戊烯氨基嘌呤(玉米素)ZT219.2赤霉素赤霉素GA3346.4能溶于乙醇不耐熱不能高 壓滅菌在愈傷 組織和懸浮培 養(yǎng)物的啟動和 保持生長時才 需要有時小植 株再生時也需 要四、常用藥品的配置方法1.1mol/L HCl 的配制 ：根據(jù)鹽酸的密度 37%鹽酸溶液的密度為 1.19 克 / 毫升，假設要配制1000ml 1mol/L HCl ，則需要鹽酸的物質的量為1mol ，所以需要量取 37% 的鹽酸為1*36.5/37%/1.19=82ml2.1mol/L 的 NaOH3.95% 的酒精配制成 得到 75%的酒精。 如果用無水酒精配制4.0.1% 的升汞配制：的配制 ：稱 40gNaOH ，然后融于 1000ml 的蒸餾水中。 （定容到 100ml） 75% 的酒精： 用量筒量取 750ml 的 95%酒精加入 200ml 的蒸餾水即可75%的酒精，則量取 750ml 的無水酒精，再加水 250ml 。先稱取 1 克升汞粉末，然后用蒸餾