《毒理學新技術(shù)》

1、整理ppt體外試驗與生物新技術(shù)在毒理學中的應用整理ppt分類l依據(jù)體外試驗在決策過程中所起的作用l篩選試驗。它僅提供決策過程的最初的資料，還需要進行更權(quán)威的試驗，無論是整體還是體外試驗。l附加試驗。它可為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料，如機理的研究，但僅有它是不夠充分的。l替代試驗。它是在大量實驗的基礎上，使體外毒性試驗能替代整體動物試驗，以提供更多的信息。整理ppt基本原理l 體外試驗的基本原理是所觀察到的毒理學效應均是毒物和或反應活性代謝產(chǎn)物在敏感性細胞上或敏感細胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果。 整理ppt體外毒性試驗系統(tǒng)的優(yōu)點l能控制環(huán)境因素l可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)

2、、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響l每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細胞，細胞器等l試驗間的誤差較少l可同時和或反復多次取樣l可做成復雜的互相作用的試驗系統(tǒng)，如復合細胞培養(yǎng)等l較為快速和經(jīng)濟l需要較小量的受試化合物l產(chǎn)生較小量的有毒廢物l可以利用人體細胞l減少整體動物的使用整理ppt體外試驗系統(tǒng) l臟器灌流 l 肝臟灌流 l腸灌流 l膈肌-膈神經(jīng)標本 l臟器切片 l原代細胞培養(yǎng) l肝細胞原代培養(yǎng)l巨噬細胞 l淋巴細胞 l腦細胞 l心肌細胞 l細胞培養(yǎng) l組織勻漿 l亞細胞組分 l細胞膜 l微粒體 l線粒體 l酶 整理ppt哺乳動物細胞制備和培養(yǎng)哺乳動物細胞制備和培養(yǎng) l體外系統(tǒng)分離的細胞包括懸浮液中的

3、新鮮游離細胞、原代培養(yǎng)細胞、細胞株、細胞系及復合培養(yǎng)的細胞 l在毒理學中以哺乳動物細胞作為實驗動物的替代系統(tǒng)的原因 l來自公眾要求減少實驗中使用動物數(shù)量的壓力l整體動物實驗可顯著地減少常規(guī)整體動物實驗所需的高額費用l人們越來越不滿意實驗動物與人體結(jié)果之間相關(guān)性的缺乏。 整理ppt體外系統(tǒng)細胞在毒理學中應用的優(yōu)、缺點 l優(yōu)點 改善效率，減少費用l 使用實驗動物較少l 僅需少量的受試物 l 較大程度控制細胞族的性狀 l 直接控制胞外基質(zhì)、化學物濃度及接觸時間l 排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響l 可從同一實驗體系重復取樣l缺點 缺少整個器官的形態(tài)學觀察l 選擇性喪失整體器官特異性

4、功能，如毒性代謝酶的喪失l 缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)，l 一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導致營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。l 多為短期試驗，對亞慢性或慢性毒性的評估價值不大整理ppt毒理學研究中常用細胞 l各種物種的成纖維細胞l淋巴母細胞l腹水瘤細胞l淋巴細胞l角質(zhì)細胞l肝 細 胞l肝癌細胞l腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細胞l肺的各種類型細胞l培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細胞l培養(yǎng)的睪丸細胞l膀胱細胞l心臟細胞l脊髓微血管細胞l脂肪細胞整理ppt細胞實驗方法l建立正在迅速生長的細胞株，用以觀察受試物對整體細胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用l利用已高度分化的細胞，無論是原代培養(yǎng)或是特定的細胞株，

5、研究受試物對已分化成熟的細胞或其功能的特殊毒作用； 整理ppt細胞培養(yǎng)的基本條件無菌條件：無菌條件：凈化工作室，風淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細胞生長條件：細胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶， CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細胞檢測條件：細胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標儀 ，微孔板震蕩器，高速離心機，移液器 細胞保存條件：細胞保存條件：液氮罐實驗室安全：實驗室安全：生物實驗室安全，P1,P2,P3實驗室安全整理ppt整理ppt風淋室風淋室:風淋室是生物潔凈室的理想配套設備，它不僅可以清除人體和物品表面附著的

6、塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。整理ppt傳遞窗傳遞窗:該裝置是一種潔凈室的輔助設備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。整理ppt超凈工作臺l 超凈工作臺的工作超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機原理是利用鼓風機驅(qū)動空氣，通過高驅(qū)動空氣，通過高效濾器除去空氣中效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化氣得到凈化。凈化空氣徐空氣徐徐通過工作徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。構(gòu)成無菌環(huán)境。 整理ppt培培 養(yǎng)養(yǎng) 板板整理ppt培養(yǎng)瓶培

7、養(yǎng)瓶整理ppt整理ppt酶標儀 微孔板震蕩器整理ppt培養(yǎng)細胞生長的條件培養(yǎng)細胞生長的條件l1 細胞的營養(yǎng)需要l2 細胞的生存環(huán)境l 溫度: 37 ，O2l CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-l pH: 7.2-7.4l 滲透壓l 3 無污染l 4 無毒整理ppt細胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至加水至1000 ml整理pptl胰蛋白酶作用

8、于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰蛋白酶液濃度胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。定限度會損傷細胞。l胰蛋白酶是一種黃白色胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無粉末，用無Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的PBSPBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.250.25 。用濾。用濾器過濾除菌。器過濾除菌。l胰蛋白酶液消化時間：胰蛋白酶液消化時間：2-102-10分鐘。分鐘。

9、l用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用 消化液消化液：整理ppt培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：l培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。l天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基：l天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。浸液）。l優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好l缺點：來源受限。缺點：來源受限。 成分復雜，成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析取和實驗結(jié)果的

10、分析。易發(fā)生支原體污染。易發(fā)生支原體污染整理ppt合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低 。 缺點：缺點： 缺少某些成分不能完全滿足細胞生長需要。缺少某些成分不能完全滿足細胞生長需要。如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。等。整理ppt 無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用

11、時還需添加血清。需添加血清。 一般說來，含一般說來，含5小牛血清的培養(yǎng)基對大小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死，但支持細胞多數(shù)細胞可以維持細胞不死，但支持細胞生長一般需加生長一般需加 10血清血清整理pptl血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。l常用血清有胎牛血潔、小牛血情、兔血清、馬血清等，常用血清有胎牛血潔、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。其中以胎牛血清質(zhì)量最好。l優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。支原體、病毒污染。l血清的滅活（消除補體活性）：血清的滅活（

12、消除補體活性）：56 ，30 分鐘分鐘l血清的消毒：過濾除菌血清的消毒：過濾除菌整理pptl抗菌素的使用：抗菌素的使用：l 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。制可能存在的細菌的生長。l 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。單位。l 慶大霉素：每毫升慶大霉素：每毫升100單位單位方便、廣譜、穩(wěn)定。方便、廣譜、穩(wěn)定。整理pptl基礎培養(yǎng)基基礎培養(yǎng)基 8080一一9595l血清血清 5 5一一2020l碳

13、酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g/L2.0 g/Ll青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100100單位毫升單位毫升完全培養(yǎng)基的組成完全培養(yǎng)基的組成整理ppt RPMI-1640RPMI-1640培養(yǎng)粉培養(yǎng)粉 1 1袋袋 碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g2.0 g 青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100100單位毫升單位毫升 加三蒸水加三蒸水 至至 1000ml, 1000ml, 過濾除菌；過濾除菌； 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值至值至7.27.2； 加血清（終濃度加血清（終濃度 1010）。）。 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制整理ppt主要培養(yǎng)基主要培養(yǎng)基MEM：低限量：低限量Eagle培養(yǎng)基培養(yǎng)基DMEM：貼壁細胞：貼壁細胞IMD

14、M：密度低、生長困難細胞，雜交瘤細胞：密度低、生長困難細胞，雜交瘤細胞RPMI1640：懸浮、腫瘤、原代、傳代等細胞：懸浮、腫瘤、原代、傳代等細胞199、109培養(yǎng)基：原代培養(yǎng)、難以培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)基：原代培養(yǎng)、難以培養(yǎng)的細胞整理ppt細胞培養(yǎng)基本技術(shù)細胞培養(yǎng)基本技術(shù)整理ppt無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù) 體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。整理ppt【培養(yǎng)前準備培養(yǎng)前準備】 在開始實驗前要在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序制定好實驗計劃和操作程序。根據(jù)實驗要求，準備各種所需器材和物品、清

15、點無根據(jù)實驗要求，準備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所誤后將其放置操作場所( (培養(yǎng)室、超凈臺培養(yǎng)室、超凈臺) )內(nèi)，然后內(nèi)，然后開始消毒。避免開始實驗后，因物品不全往返拿取開始消毒。避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。而增加污染機會。整理ppt【操作與消毒操作與消毒】 無菌培養(yǎng)室每天都要用無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%0.2%的新潔爾滅拖洗地的新潔爾滅拖洗地面面次次( (專用拖布專用拖布) )，紫外線照射消毒，紫外線照射消毒30-50min30-50min，超凈，超凈工作臺臺面每次實驗前要用工作臺臺面每次實驗前要用7575酒精擦洗。然后紫外酒精擦洗。然后紫外線消毒線

16、消毒30min30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細胞和在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，物品不要重疊放置。培養(yǎng)用液同時照射紫外線，物品不要重疊放置。移液移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%75%酒精擦洗后置酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。于臺內(nèi)同時紫外線消毒。整理ppt【火焰消毒火焰消毒】 首先要點燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或首先要點燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。進行。 整理ppt【操作操作】 進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但

17、又不必太快，以防空氣流動。必太快，以防空氣流動。整理ppt培養(yǎng)細胞的觀察培養(yǎng)細胞的觀察肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)整理ppt整理ppt細胞計數(shù)細胞計數(shù)l培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)。度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。細胞計數(shù)細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。l血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞整理ppt細胞計數(shù)：細胞計數(shù)： 1 1、將

18、計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，將蓋片蓋在計數(shù)板上。、將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，將蓋片蓋在計數(shù)板上。 2 2、吸少許細胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋、吸少許細胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。片和計數(shù)板之間。 3 3、靜置、靜置3 3分鐘。分鐘。 4 4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計只計左側(cè)和上方左側(cè)和上方的。然后按下式計算：的。然后按下式計算：細胞數(shù)細胞數(shù)/ml/ml4 4大格細胞總數(shù)大格細胞總數(shù)/ 4/ 41000010000注意：若兩個以上的細胞團，按單個細胞計算，若細注意：若兩個以上的細胞團，按單個細胞計算，

19、若細胞團占胞團占10%10%以上，需重新制備細胞懸液。以上，需重新制備細胞懸液。整理ppt整理pptl根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3 3種：種：l1 1懸浮生長細胞傳代懸浮生長細胞傳代l離心法傳代：離心（離心法傳代：離心（10001000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分）去上清，沉淀分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除養(yǎng)液去除l l2 2一一2 23 3，然后用吸管直接吹打形，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。成細胞懸液再傳代。細胞傳代方法細胞傳代方法整

20、理ppt2 2半懸浮生長細胞傳代（半懸浮生長細胞傳代（HelaHela細胞）細胞） 此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。落下來，進行傳代。3 3貼壁生長細胞傳代貼壁生長細胞傳代 采用采用酶消化法酶消化法傳代。常用的消化液有傳代。常用的消化液有0.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。整理pptl總細胞中活細胞所占的百分比叫做總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力細胞活力檢測的細胞：檢測的細胞：l組織分離的細胞組織分離的細胞l復蘇后的細胞復蘇后的細胞 培養(yǎng)細胞活力測定整理p

21、ptl1臺盼藍法l活細胞不被染色，死細胞染成藍色；活細胞不被染色，死細胞染成藍色；l方法：方法： 1 1、將細胞懸液以、將細胞懸液以0.5ml0.5ml加入試管中；加入試管中； 2 2、加入、加入0.5ml 0.4%0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色臺盼蘭染液，染色2 2一一3 3分鐘；分鐘； 3 3、鏡檢計細胞活力。、鏡檢計細胞活力。 死細胞深蘭色，活細胞呈無色透明狀。死細胞深蘭色，活細胞呈無色透明狀。整理pptl2 2四唑鹽四唑鹽（MTT）比色法比色法l四唑鹽四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍；）商品名為噻唑藍；原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干

22、水的藍紫色產(chǎn)物，而死細胞沒有這種溶干水的藍紫色產(chǎn)物，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解藍紫色，）能溶解藍紫色，溶液顏色深淺與所含的溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。量成正比。酶標儀測定酶標儀測定OD值。值。整理ppt整理ppt細胞凍存和復蘇細胞凍存和復蘇l細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。l凍存和復蘇的原則：慢凍快融凍存和復蘇的原則：慢凍快融慢凍程序：慢凍程序：l 將冷凍管放入紗布袋內(nèi)，通過線繩將紗布將冷凍管放入紗布袋內(nèi)，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12的速

23、度，在的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，分鐘內(nèi)降至液氮表面，停停30分鐘后，直接投入液氮中。分鐘后，直接投入液氮中。常用的低溫常用的低溫保護劑是保護劑是DMSO整理ppt細胞復蘇方法細胞復蘇方法 （1 1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入）從液氮中取出冷凍管，迅速投入373738 38 水浴水浴中，使其融化（中，使其融化（1 1分鐘左右）；分鐘左右）； （2 2）5 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的1010倍以上；倍以上；（3 3）低速離心）低速離心1010分鐘；分鐘；（4 4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。整理ppt培養(yǎng)細

24、胞的生物學特征培養(yǎng)細胞的生物學特征植物輸導水分的細胞植物輸導水分的細胞哺乳類的肌肉細胞哺乳類的肌肉細胞人類脊髓神經(jīng)細胞人類脊髓神經(jīng)細胞整理ppt體外培養(yǎng)細胞的分型體外培養(yǎng)細胞的分型 （一）貼附型：（一）貼附型： 大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，大致分成以下四型：整理ppt培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程 整理ppt（一）培養(yǎng)細胞生命期（一）培養(yǎng)細胞生命期（Life Span of Culture Cells）所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。 整理ppt1 1原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)期期即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一

25、次傳代階段，一般持續(xù)代階段，一般持續(xù)1一一4周。與體內(nèi)原組織周。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。各細在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。各細胞的遺傳性狀互不相同，依存性強，獨立胞的遺傳性狀互不相同，依存性強，獨立生存性差。生存性差。整理ppt2 2傳代期：傳代期：初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細細胞系胞系。呈二倍體核型的細胞稱。呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞二倍體細胞系系。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在初。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當傳代當傳代1050次左右，細胞增殖逐漸緩慢，次

26、左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。以至完全停止，細胞進入第三期。 整理ppt3衰退期：衰退期：生存，但增殖慢或不增殖；最后衰退凋亡。生存，但增殖慢或不增殖；最后衰退凋亡。由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標志之一是細胞可能獲得化的標志之一是細胞可能獲得永生性永生性即細胞獲持久即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系無限細胞系，主要，主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成后，核型大多變成異倍體異倍體。整理ppt（

27、二）組織培養(yǎng)細胞一代生存期（二）組織培養(yǎng)細胞一代生存期所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在細胞一代中，細胞能倍增36次。細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：整理ppt2指數(shù)增生期（指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：）：這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺指數(shù)增

28、生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù)表示，表示，即細胞群中每即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于的分裂指數(shù)介于0.1%0.5%，初代細胞分裂指數(shù)低，初代細胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%5%。 整理ppt在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)35天天后，隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞后，隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞

29、相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制接觸抑制（Contact Inhibition）。）。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生產(chǎn)物增多時，細

30、胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制密度抑制（Density Inhibition），導致細胞分裂停止。），導致細胞分裂停止。 整理ppt特點：特點：是細胞是細胞增生最活躍增生最活躍、活力最旺盛活力最旺盛的階段的階段培養(yǎng)物中培養(yǎng)物中細胞數(shù)量呈指數(shù)增長細胞數(shù)量呈指數(shù)增長, ,細胞群體均一細胞群體均一是理想的實驗用細胞是理想的實驗用細胞。整理ppt判斷細胞生長的指標：判斷細胞生長的指標：指數(shù)生長期內(nèi)細胞分裂活動的程度指數(shù)生長期內(nèi)細胞分裂活動的程度(增殖活性增殖活性)可作為判斷可作為判斷細胞生長是否旺盛的重要指標細胞生長是否旺盛的重要指標1.有絲分裂指數(shù)有絲分裂指數(shù)(MI):指培養(yǎng)物中指培養(yǎng)

31、物中分裂相數(shù)量占全部細胞數(shù)量的百分比，分裂相數(shù)量占全部細胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計統(tǒng)計時，每瓶至少需計數(shù)時，每瓶至少需計數(shù)1000個細胞。個細胞。一般細胞的一般細胞的MI約為約為0.10.5%；原代培養(yǎng)物的原代培養(yǎng)物的MI比繼代比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞高，可達培養(yǎng)物低。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞高，可達3%5%。整理ppt判斷細胞生長的指標：判斷細胞生長的指標：2.細胞群體倍增時間細胞群體倍增時間:培養(yǎng)物中細胞數(shù)量翻倍的平均時間培養(yǎng)物中細胞數(shù)量翻倍的平均時間3.MTT法法：反映細胞內(nèi)一種酶活性程度：反映細胞內(nèi)一種酶活性程度4.標記核苷酸標記核苷酸(3H-TdR)摻入量：摻入量：反映反映DNA整

32、理ppt 細胞生長一定階段細胞生長一定階段(指數(shù)生長期一般持續(xù)指數(shù)生長期一般持續(xù)3 35 d5 d）, ,即可即可長滿培養(yǎng)器皿，相互匯合成片長滿培養(yǎng)器皿，相互匯合成片(鋪滿鋪滿 confluence) 當細胞相互接觸連接成片，出現(xiàn)當細胞相互接觸連接成片，出現(xiàn)接觸抑制接觸抑制，接觸抑制以，接觸抑制以后，雖然運動受抑制，但只要營養(yǎng)成分充足，仍可短期后，雖然運動受抑制，但只要營養(yǎng)成分充足，仍可短期的分裂增殖，只有當細胞密度增大到一定程度，細胞便的分裂增殖，只有當細胞密度增大到一定程度，細胞便不再分裂增殖。為不再分裂增殖。為密度依賴性細胞生長抑制密度依賴性細胞生長抑制當細胞分裂停止后，細胞數(shù)量即不再增

33、加進入平臺期當細胞分裂停止后，細胞數(shù)量即不再增加進入平臺期 整理ppt3停滯期（停滯期（Stagnate Phase）：）：細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期平臺期（Plateau）。）。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的

34、機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳還要再傳12兩代，通過換液淘汰死細胞和使受損輕微的兩代，通過換液淘汰死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。細胞得以恢復后，才能再用。 整理pptl概述概述 細胞細胞鋪滿后鋪滿后再再1-2倍增倍增, , 進入細胞達進入細胞達飽和密度飽和密度, , 可可存活存活仍有代謝活動，但仍有代謝活動，但基本不分裂基本不分裂， 細胞數(shù)量維持在某一水平上，生長活動停滯細胞數(shù)量維持在某一水平上，生長活動停滯整理pptl特點特點 (1)(1)細胞數(shù)量：細胞數(shù)量： 細胞達細胞達飽和密度，

35、出現(xiàn)密度抑制飽和密度，出現(xiàn)密度抑制。 停止生長原因停止生長原因: : 細胞數(shù)量多、生長細胞數(shù)量多、生長地區(qū)占滿地區(qū)占滿、營養(yǎng)營養(yǎng)消耗消耗、培養(yǎng)液中代謝、培養(yǎng)液中代謝廢物積聚漸多，細胞停止生長廢物積聚漸多，細胞停止生長。即使經(jīng)常更換培養(yǎng)液，細胞也會變性即使經(jīng)常更換培養(yǎng)液，細胞也會變性, ,從生長基質(zhì)表面從生長基質(zhì)表面脫落、死亡脫落、死亡唯有唯有進行進行傳代傳代方可緩解。方可緩解。 整理ppt(2)(2)細胞活動小細胞活動小, , 細胞膜的細胞膜的活動小活動小(3)(3)生長組分下降生長組分下降: 0: 010%10%(4)(4)及時傳代：及時傳代：細胞細胞已中毒已中毒，即使即使傳代傳代，也會，也

36、會影響下一影響下一代細胞代細胞的功能狀況的功能狀況整理ppt體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。 整理ppt體外培養(yǎng)細胞的種類體外培養(yǎng)細胞的種類 整理ppt（一）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細胞系。 整理ppt（二）細胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)

37、后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（Finite Cell Line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系（Infinite Cell Line）。無限細胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞系。無限細胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明已惡性化。 整理ppt（三）細胞株 從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細

38、胞群，亦可稱之為亞株（Substrain） 整理ppt（四）二倍體細胞 細胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細胞染色體數(shù)相同細胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細胞染色體數(shù)相同或基本相同（或基本相同（2n細胞占細胞占75或或80以上）的細胞群，稱以上）的細胞群，稱二二倍體細胞培養(yǎng)倍體細胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為態(tài)有改變者為假二倍體假二倍體。二倍體細胞在正常情況下具有限。二倍體細胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細胞系。但隨供體年齡和組織細胞的不生命期，故屬有限細胞系。但隨供體年齡和組織細胞的不同，二倍體細胞的壽命長短各異。同，二倍體

39、細胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細胞可傳人胚肺成纖維細胞可傳50代土代土10代，人胚腎只有代，人胚腎只有810代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細胞代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細胞1530代代。由不同年齡供體取材建立的二倍體細胞系可供。由不同年齡供體取材建立的二倍體細胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在研究衰老之用。為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或初代或25代即大量凍存作為代即大量凍存作為原種（原種（Stook Cells），用時，用時再進行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細胞再進行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細胞的衰老。的衰老。 整理ppt（五）遺傳缺陷細胞 從有先天遺

40、傳缺陷者取材（主要為成纖維細胞）培養(yǎng)的細胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細胞，都屬遺傳缺欠細胞。這類細胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。 整理ppt（六）腫瘤細胞系或株（六）腫瘤細胞系或株 這是現(xiàn)有細胞系中最多的一類，我國已建這是現(xiàn)有細胞系中最多的一類，我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾十代或百建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。 整理ppt細胞系或細胞株的命名 HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）：為供體患者的姓名（來源于宮頸

41、癌）CHO：中國地鼠卵巢細胞（：中國地鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary）宮宮-743：宮頸癌上皮細胞，：宮頸癌上皮細胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（：美國國立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立；每建立；每3天傳代，每次接種天傳代，每次接種3105細胞毫升。細胞毫升。整理ppt基本技術(shù) l儀器與設備 l1. 培養(yǎng)箱 l2. 冰箱和冷柜 冰箱(4) ，冷柜(20)l3. 顯微鏡 ，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。 l4. 超凈工作臺 l5.電熱干燥箱消毒 器皿的清洗可用超聲波洗滌器。l6

42、. 培養(yǎng)器皿 ；多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細胞或單個細胞克隆的生長；培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶，；其它：凍存細胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，。 l吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；玻璃瓶， 離心管，l 7. 液氮貯存器l 8. 水純化裝置 但是，在細胞培養(yǎng)中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機物。l 9. 濾過消毒裝置 整理ppt三、培養(yǎng)細胞的鑒定 l目的：l觀察培養(yǎng)有無變化，以決定是否終止培養(yǎng)，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養(yǎng)細胞；l培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)液)變化，對培養(yǎng)細胞的影響。l鑒定l污染鑒定l生存指標l細胞性質(zhì)(如細胞形態(tài)

43、、生長特性、染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)等)。整理ppt污染鑒定l 細胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細菌和支原體等，此外有化學物和非同一種細胞的污染。l污染表現(xiàn)：l細胞培養(yǎng)可明顯地改變生長特性，l引起pH變化和生長遲緩l培養(yǎng)液表面起泡或起膜，l培養(yǎng)液中的絮狀物及細胞生長表面的斑點，搖動培養(yǎng)器皿可消失。肉眼見不到的污染可影響細胞的代謝。整理ppt細胞特性鑒定l1. 形態(tài)學檢查：評價細胞正常與否的最簡單方法是形態(tài)學檢查 。l“成纖維樣”l“上皮樣 l2.生長特性的檢查l主要通過測定更換培養(yǎng)液的時間和傳代的時間來完成 l接種效率=l小于30表示生長不正常l 3.其它檢查 除上述指標外，在細胞培養(yǎng)時，可進行染色體分析

44、，包括染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測定，來判斷培養(yǎng)細胞的特性。 %100植入細胞數(shù)目克隆數(shù)目整理ppt細胞培養(yǎng)在食品毒理學中應用 l一般毒性：主要為急性細胞毒性 l器官特異性毒性：利用有代表性細胞類型如肝細胞、腎近曲小管細胞、神經(jīng)細胞及心肌細胞等：l 毒作用機理l 生物轉(zhuǎn)化、毒性代謝產(chǎn)物的形成l 遺傳毒性，如程序外DNA合成測定l 繁殖毒性l 聯(lián)合毒性l 不同物種間的比較毒性l 光敏毒性 整理ppt毒性指標的選擇l依據(jù)不同的試驗目的和試驗條件，可選擇不同的觀察指標。下列指標在毒理學中經(jīng)常采用：l (1) IC50：即經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長速率減至對照組一半時所需受試物的濃

45、度生長速率可用蛋白總濃度來表示，可用于細胞毒性的常規(guī)篩檢。此外，前述評價細胞特性的指標，如形態(tài)學和接種效率等，均可采用。l (2) 細胞膜損傷：可選擇臺盼藍攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放以及鈣泵的變化等指標來評價細胞膜的損傷。l (3) 大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用14C亮氨酸蛋白試驗和3H尿嘧啶參入RNA試驗等指標，以判斷受試物對培養(yǎng)細胞的大分子合成與降解的有無作用。l (4) 代謝能力：除可選擇ATP濃度、NADPNADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標外，還有毒物代謝酶的活性、細胞膜脂質(zhì)過氧化作用及14C-葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率，均可反映出細胞的代謝能力。 l (5)

46、 形態(tài)學觀察：通過光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可了解受試物對培養(yǎng)細胞的形態(tài)改變情況。整理ppt毒理學中應用細胞培養(yǎng)技術(shù)時應注意的幾個問題 l 1. 細胞類型的選擇 細胞類型的選擇取決于實驗的目的。l一般性篩選系列化合物的一般毒性時，應選擇生長迅速且易于處理的細胞系。l機理研究多不用細胞系，因為培養(yǎng)的細胞會逐漸喪失許多功能，如細胞色素P-450的活性。 l 細胞培養(yǎng)的優(yōu)點之一是可選擇來源于人體的組織細胞，可減少試驗結(jié)果的物種差異。成纖維樣細胞和上皮樣細胞均可選用。l常用的細胞系有CHO、V79、Hela、BHR及L929等。整理ppt 2. 代謝活化 l細胞經(jīng)8-24h培養(yǎng)后，細胞色素P-450

47、活性將迅速下降。l而在CHO細胞系中，涉及代謝活化的酶活性下降。所以，培養(yǎng)細胞對需代謝活化的化學物不能夠敏感。l 解決方法，l一是加S9。 S9需要NADPH才具有代謝活化作用，故在培養(yǎng)液中應加有NADPH生成系統(tǒng)(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸和NADP)。l與原代肝細胞復合培養(yǎng)。與原代肝細胞進行復合培養(yǎng)時也可采用其它不同的細胞系，如V79、中國地鼠肺成纖維細胞和人成纖維細胞。 整理ppt3. 受試物的給予 l許多受試物由于水溶性較低，在加入培養(yǎng)液前，常需溶于有機溶劑，有機溶劑對細胞有損害作用，故應限制有機溶劑濃度在1以下。l在試驗中可設立適當?shù)挠袡C溶劑對照和培養(yǎng)液對照。 整理pp

48、t4.設立陽性對照組l實驗系統(tǒng)的重現(xiàn)性應該用陽性對照物來檢查。陽性對照物指采用經(jīng)過研究或公認有特定作用的化學物。 整理ppt亞細胞組分制備及其檢測方法亞細胞組分制備及其檢測方法 l微粒體的制備l肝微粒體制備l肝外組織微粒體的制備 l線粒體的制備l亞線粒體顆粒的制備 整理ppt設備l設備l勻漿器l離心機：l低溫高速離心機，最大轉(zhuǎn)速為18 00024000rpm，l超速離心機，最大轉(zhuǎn)速為5000075000rpm。 l勻漿介質(zhì)和緩沖液l最常用的勻漿介質(zhì)為等滲的蔗糖(0.25molL)和氯化鉀(0.154molL) l生物樣品 l實驗動物如大鼠、小鼠、金黃地鼠應迅速處死，常用的方法是斷頭處死。l應避

49、免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。 整理ppt 肝微粒體制備 肝勻槳離心，10000g 20 min 上清液 沉淀離心，10500g 1h沉淀 （微粒體） 上清液棄去整理ppt線粒體的制備 肝勻槳 離心，460g 10 min上清液 沉淀(包括細胞核，紅細胞離心，12500g 10 min 及大的細胞碎片)沉淀 （含有線粒體） 上清液 棄去整個制備過程應在1h內(nèi)完成 細胞碎片和紅細胞 大量完整的線粒體和一些溶酶體大量完整的線粒體和一些溶酶體 一些破的線粒體和微粒體 整理ppt細胞程序性死亡及其檢測方法l 細胞程序性死亡(programmed cell death，

50、PCD)是一種與遺傳機制有關(guān)的、主動的自發(fā)性死亡方式，并在形態(tài)和生化上出現(xiàn)一系列特征表現(xiàn)。具有這些特征表現(xiàn)的細胞稱為細胞凋亡(apoptosis)。l細胞凋亡細胞凋亡：而細胞凋亡的特征表現(xiàn)是胞內(nèi)水分丟失，胞漿濃縮，胞膜結(jié)構(gòu)完好，細胞核濃縮聚集于核膜邊緣，形成新月形。到晚期，細胞核碎裂成小片，胞漿分割，形成由細胞膜所包繞的含有核碎片的小體，稱為凋亡小體(apoptotic body)。l細胞壞死細胞壞死(necrosis) ：壞死是指體內(nèi)、外致?lián)p傷因素作用達到一定強度、持續(xù)一定時間后，所導致的細胞死亡，它表現(xiàn)為細胞及細胞器腫脹、碎裂和溶解等。整理ppt細胞程序性死亡的檢測方法l 1. 形態(tài)學觀察

51、法 主要依靠光學顯微鏡或電子顯微鏡觀察細胞凋亡的形態(tài)學特點。l觀察材料可以是石蠟切片、冰凍切片或細胞涂片。l形態(tài)學觀察可用HE染色或熒光染料PI、DAPI等染色。normal整理ppt l 整理ppt 掃描電鏡l 整理ppt 透射電鏡觀察 整理ppt電泳檢測法l原理是在細胞發(fā)生凋亡時，由于內(nèi)源性核苷酸酶的激活，DNA被有規(guī)律地切割成約180bp或其倍體的雙鏈DNA片段，在凝膠電泳上可形成梯帶，即具有凋亡的特征DNA梯帶(DNAladder)。 ，整理ppt單細胞凝膠電泳單細胞凝膠電泳l將細胞包埋于低熔點瓊脂糖內(nèi)，置于堿性裂解液中，使細胞裂解后，瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色，觀察細胞DNA的斷裂情

52、況。 整理ppt末端轉(zhuǎn)移標記法l末端轉(zhuǎn)移標記技術(shù)是利用在發(fā)生凋亡時，DNA鏈被激活的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶切割成許多180bp左右的雙鏈DNA片段。l這些片斷均含有3-OH末端，在末端轉(zhuǎn)換酶或DNA多聚酶，(TdT酶)作用下，加入已標記的核苷酸或核苷酸混合物，再經(jīng)過酶顯色或用熒光抗體使之顯示出來。 整理ppt細胞分析儀檢測法l常用的細胞分析儀有兩類，l流式細胞分析儀，可對單個細胞懸液中的單個細胞進行檢測。l借助細胞標記技術(shù)和計算機分析技術(shù)，可快速檢出發(fā)生凋亡的細胞。其原理是在正常增殖狀態(tài)的細胞，處于不同周期時相，即G0Gl，S1，G2M期，其DNA含量分布在2n4n之間；。 l細胞形態(tài)分析儀，可對載

53、玻片上單個細胞進行檢測。 整理ppt整理ppt二、細胞凋亡相關(guān)基因l現(xiàn)已報道，有25個癌基因與細胞凋亡有關(guān)。l細胞凋亡相關(guān)基因大致可分為兩大類，即凋亡促進（apoptosis on）基因和凋亡抑制（apoptosis off ）基因。它們分別起著促進凋亡和抑制凋亡的作用，彼此之間還存在一定的相互關(guān)聯(lián)。l1凋亡抑制基因l凋亡抑制基因包括bcl-2、ced-9、bcl-X，其中最主要也是當前研究最多的是bcl-2，bcl-2是癌基因的一種，在人體多種形態(tài)的腫瘤中過度表達，可抑制由多種剌激包括化療和放療引起的細胞凋亡。bcl-2常在淋巴細胞系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中表達，抑制該部位的細胞凋亡。淋巴性白血病細胞中bcl-2也是過度表達的。整理ppt l2凋亡促進基因l凋亡促進基因有ced-3,4、p53、ICE、Bax、bcl-Xs、TGF等。其中ced-3，4是在線蟲索中發(fā)現(xiàn)的，而p53、ICE等存在于哺乳動物中。lp53為腫瘤的抑