宏基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)方法

1、簡(jiǎn)介：宏基因組測(cè)序介紹宏基因組學(xué)是以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì) 象，通過現(xiàn)代基因組技術(shù)手段包括功能基因的篩選和測(cè)序分析，對(duì)環(huán)境中微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系以及環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn) 行研究的新的微生物研究方法。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為宏基因組學(xué)研究 提供了新的理想研究方法。高通量測(cè)序的方法無(wú)需分離環(huán)境中各種微生物， 也無(wú) 需構(gòu)建克隆文庫(kù)就可以直接對(duì)環(huán)境中所有微生物進(jìn)行測(cè)序?？梢哉鎸?shí)客觀的反映環(huán)境中微生物的多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系等。目前又可以分為針對(duì)16sDNA/18sDNA/ITSM序和針對(duì)宏基因組全序列的測(cè)序研究。下面就是對(duì)這兩者的 具體介紹。一、1

2、6s DNA/18s DNA/ITS 測(cè)序16sDNA是最常用的微生物物種分子鑒定的標(biāo)簽，通過對(duì) 樣品中16sDNAW序可以鑒定其中微生物物種的豐度和分布情況。目前，普遍使用Roche 454平臺(tái)來對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行16s DNAW序。因?yàn)?6s DNAff列比較相似， 讀長(zhǎng)短的話，難以進(jìn)行有效的比對(duì)，而454平臺(tái)的平均讀長(zhǎng)在400bp左右，可以 很好的避免此類問題。二、宏基因組全測(cè)序在這種測(cè)序方式中，我們可以假定一個(gè)環(huán)境中的所有微生物 就是一個(gè)整體，然后對(duì)其中所有的微生物進(jìn)行測(cè)序0 這樣我們就可以研究樣品中 的功能基因以及其在環(huán)境中所起的作用而不用關(guān)心其來自哪個(gè)微生物?？梢园l(fā)現(xiàn)新的基因，可以進(jìn)行

3、基因的預(yù)測(cè)，甚至有可能得到某個(gè)細(xì)菌基因組的全序列。此外，該項(xiàng)測(cè)序不單可以針對(duì)DNAK平，也可以針對(duì)全RNA8行基因表達(dá)水平的研 究。樣品處理：宏基因組樣品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮膚和糞便。樣品采集遵照樣品采集規(guī)范（人）所規(guī)定的操作來進(jìn)行。盡量留足備份樣品。核酸提?。汉昊蚪M核酸提取主要有兩種方法： 膜過濾法和直接裂解提取。對(duì)于液體樣品如 痰液，灌洗液兩種方法都適用，對(duì)于固體樣品如糞便宜采用直接裂解的方法。核 酸提取后用 NanoDrop ND-1000測(cè)定，260/280 = , 260/230 =,電泳檢測(cè) DNA 應(yīng)是完整的一條帶。測(cè)序 Sequencing1. 1

4、6S/18S 測(cè)序：Sanger 測(cè)序：用于低通量的16S/18S DNAW序，提取宏基因組后，首先通過PCRa 16S/18S 序列擴(kuò)增出來，再將其連接到克隆載體上，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，涂平板做藍(lán)白斑篩 選，選出陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序反應(yīng)后純化后用ABI 3130 或ABI 3730進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序。由于其測(cè)序準(zhǔn)確率比較高，而通量非常低，現(xiàn)通常用做二代測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證。454 Platform454平臺(tái)主要包括兩種測(cè)序系統(tǒng)：454 GSFLX+System和454 GSJunior System。454 GSFLX+ System測(cè)序讀長(zhǎng)可以達(dá)到 600-1000bp,通量 4

5、50-700M, GSJunior System測(cè)序讀長(zhǎng)在400bp左右，通量在35M文庫(kù)構(gòu)建：用fusion Primer 擴(kuò)增核糖體RNA將已擴(kuò)增的rRNA直接做乳液PCR在 GS FLX+和GS Junior系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序深度：數(shù)據(jù)分析：使用免費(fèi)的軟件包對(duì)微生物的種群多樣性進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行比較。聚類分析。2. MG-RAST用于注釋宏基因組樣品的全自動(dòng)軟件。3. IMG/M基于宏基因組序列微生物群體的功能性。4. CAMER A致力于微生物生態(tài)學(xué)研究。5. CARMA可以通過未拼接的序列來進(jìn)行物種組成和微生物的遺傳潛力的研究。6. GALAXY用于高等真核生物的研究，例如昆蟲等。7

6、. Greengenes： 16S rRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以用來做16S rRNA的比對(duì)。8. QIIME:針對(duì)454測(cè)序數(shù)據(jù)的宏基因組分析。9. The Ribosome Database Project (RDP：針對(duì)焦磷酸測(cè)序的分析方法。Miseq PlatformMiseq 平臺(tái)讀長(zhǎng)可以是 2X250bp 或 2X300bpb 使用 Miseq Reagent Kit V2 可以產(chǎn)出的數(shù)據(jù)，使用 Miseq Reagent Kit V3 可以產(chǎn)出的數(shù)據(jù)。文庫(kù)構(gòu)建：根據(jù)感興趣的片段設(shè)計(jì)引物，通過PCFT增出片段做為模板構(gòu)建文庫(kù)。使用 Nextera XT Sample Prep Kit構(gòu)建

7、文庫(kù)，按照試劑盒說明書操作。將建好的文庫(kù)歸一化處理并將其混到一起。在Miseq系統(tǒng)里自動(dòng)進(jìn)行成簇反應(yīng)，進(jìn)而完成測(cè) 序。文庫(kù)檢驗(yàn)：用Agilent 2100檢測(cè)文庫(kù)大小片段是否與預(yù)期一致。文庫(kù)片段是否集中。測(cè)序深度：16S rRNA測(cè)序深度應(yīng)至少在50,000條reads以上，以保證較好的覆蓋度。數(shù)據(jù)分析：對(duì)微生物生態(tài)進(jìn)行定量觀察Greengenes： 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)和分析工具；核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)劃(RDP)Ion Torrent PlatformIon Torrent平臺(tái)主要有兩個(gè)測(cè)序系統(tǒng)：Ion PGM System 和Ion ProtonSystem0 Ion PGMt兩種讀長(zhǎng)，2

8、00bp和 400bp, Ion PGMfc要應(yīng)用三種芯片，Ion 314 Chip, Ion 316 Chip 和 Ion 318 Chip,最多數(shù)據(jù)產(chǎn)出可以達(dá)到 2Gb Ion Proton 讀長(zhǎng)為200bp,最多數(shù)據(jù)產(chǎn)出可達(dá)到10Gb 文庫(kù)構(gòu)建：使用 Ion Plus Fragment Library Kit 為 16S rRNA 擴(kuò)增產(chǎn)物加上 barcode 標(biāo)簽，一共有96個(gè)barcode可以選擇。加上標(biāo)簽后使用Ion PGIM Template OT2 200 Kit在Ion OneTouch? DL System上進(jìn)行乳液PCR完成文庫(kù)構(gòu)建。測(cè)序時(shí) 根據(jù)需要不同的讀長(zhǎng)選擇不同的測(cè)

9、序試劑盒。測(cè)序深度：對(duì)于人體腸道微生物16S rRNA測(cè)序，對(duì)于檢測(cè)高豐度的樣品，每個(gè)樣品至 少要測(cè)10000條reads,而對(duì)于檢測(cè)低豐度的樣品，則需要 1,000,000以上的 reads 數(shù)。2)全宏基因組測(cè)序 Whole-metagenomics SequencingRoche 454 platform:文庫(kù)構(gòu)建：提取宏基因組DNA總量不低于10ug,且樣品DNAK相對(duì)完整。使用GSFLX Titanium Rapid Library Preparation Kit 構(gòu)建文庫(kù)，按照說明書進(jìn)行相應(yīng)操 作。文庫(kù)檢驗(yàn)：DNA reads數(shù)與微球的比例在8流右，可以達(dá)到比較理想的測(cè)序結(jié)果。 測(cè)

10、序深度：每個(gè)樣品應(yīng)至少保證10,000條以上的reads數(shù)。Hiseq platform:Hiseq平臺(tái)主要有 Hiseq 2000和Hiseq 2500兩個(gè)測(cè)序系統(tǒng)。Hiseq 2000測(cè)序讀長(zhǎng)是2X100bpPaired-end測(cè)序，一次運(yùn)行通量可達(dá)600Gb以上，Hiseq 2500有兩種運(yùn)行模式：快速運(yùn)行和高通量，快速運(yùn)行可以達(dá)到2X150bp,產(chǎn)生最多180Gb的數(shù)據(jù)，高通量讀長(zhǎng)在 2X125bp,數(shù)據(jù)產(chǎn)出在600Gb以上。文庫(kù)構(gòu)建：將提取的宏基因組 DNAffi Covaris M220片段化后，使用Truseq DNA XT/LT Sample Prep Kit (illumina) 按照protocol 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，DNA起始投入量應(yīng) 在1ug以上。文庫(kù)檢驗(yàn)：將建好的宏基因組文庫(kù)使用 KAPASYBRFASTABI Prism 2X qPCRMaster Mix (KAPABiosystems)試劑盒