分子生物學平臺上的食品微生物快速檢測及鑒定技術ppt課件

1、在分子生物學技術上引領前行在分子生物學技術上引領前行營業(yè)收入$3.2B產(chǎn)品種類50,000國家160員工數(shù)量9,600客戶數(shù)量75,000專利許可3,600Note: LTM revenue as of September 30, 2009; does not include Mass Spec JV revenue臨床臨床分子診斷基因治療藥物再生醫(yī)學工業(yè)工業(yè)生物制藥法醫(yī)食品安全動物健康科研科研PCR技術測序技術細胞(分離, 操作，分析)“Tools Provider” 提供工具“Solutions Provider”提供解決方案 超過超過2525年的分子生物學產(chǎn)品開發(fā)歷程年的分子生物學產(chǎn)品開

2、發(fā)歷程 19821982年年, , 全球第一臺蛋白質(zhì)測序儀；全球第一臺蛋白質(zhì)測序儀；19861986年，全球第一臺核酸測序儀年，全球第一臺核酸測序儀 19861986年，全球第一個實時熒光定量技術和年，全球第一個實時熒光定量技術和TaqManTaqMan技術技術 全球全球30,00030,000 個實驗室的個實驗室的220,000 220,000 儀器正在被使用儀器正在被使用樣品前處理Dynabead磁珠富集MagMAX Express核酸自動提取快速檢測RapidFinder常規(guī)qPCR檢測超高通量的篩查OpenArray芯片芯片鑒定與分型MicroSEQ ID 基因分析靈活的組合方案，滿足

3、不同層次的應用需求PrepSEQPrepSEQ 快速離心核酸提取試劑盒快速離心核酸提取試劑盒 AB專利的離心柱材料 較化學法，更加有效去除PCR抑制劑 步驟少、操作簡單 可處理多達750uL的樣品 無需額外的設備適合少量樣品適合少量樣品采用采用PrepSEQPrepSEQ快速離心試劑盒，結(jié)果明顯優(yōu)于普通直接裂解；尤其對于存在快速離心試劑盒，結(jié)果明顯優(yōu)于普通直接裂解；尤其對于存在PCRPCR抑制劑的樣品，抑制劑的樣品，普通裂解法可能無法檢出，普通裂解法可能無法檢出， 而而PrepSEQPrepSEQ快速離心法可以得到一致的結(jié)果快速離心法可以得到一致的結(jié)果樣品：巧克力檢測項目：沙門氏菌樣品：布里奶

4、酪檢測項目：李斯特菌*標注的是因PCR抑制劑的存在導致樣品中待測菌無法檢出SamplePCR compatibleNA solutionLysisMagnetic Particles +BindingSolutionWash2XMagneticSeparationMagneticSeparationElutionMME-96 核酸提取儀核酸提取儀 自動化 高通量自動化的理想自動化的理想選擇選擇PrepSEQ 核酸提取試劑盒核酸提取試劑盒 提高核酸回收率 有效去除抑制劑 食品，環(huán)境及臨床樣品+自動化的核酸提取流程，一次最多處理自動化的核酸提取流程，一次最多處理96個樣個樣品品樣品制備軟件 Rap

5、idFinder Express 軟件軟件PrepSEQ RapidSpin樣品制備樣品制備系統(tǒng)系統(tǒng)檢測試劑MicroSEQ 食品致病菌食品致病菌檢測試劑盒檢測試劑盒儀器7500 快速快速實時熒光定量實時熒光定量PCR儀器儀器PrepSEQ NA Extraction 樣品制備樣品制備系統(tǒng)系統(tǒng)致病菌系列致病菌系列沙門氏菌 （AOAC certificated）單增李斯特菌（AOAC certificated）李斯特菌屬 （AOAC certificated）大腸桿菌O157:H7 （AOAC certificated）阪崎腸桿菌空腸彎曲桿菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌彎曲桿菌多重檢測：空腸/大腸

6、/紅嘴鷗金黃色葡萄球菌創(chuàng)傷、霍亂和副溶血性弧菌的多重檢測定制設計環(huán)境和生物安全系列環(huán)境和生物安全系列軍團菌屬定量檢測試劑盒嗜肺軍團菌定量檢測試劑盒土拉弗朗西斯菌檢測試劑盒炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒布魯氏菌屬檢測試劑盒鼠疫耶爾森菌檢測試劑盒 引物、探針設計：基于 SOLiD 測序技術分析結(jié)果 新的設計，針對O157:H7特有的序列，避免O55:H7被測出- 雙重目標基因設計，提高特異性- 將O55 全基因組測序，并與 O157相比較ORFs(both strands)GC content per 1000 bpO157:H7 (EDL933) reference sequenceO157:H7 SO

7、LiDcoverageO55:H7 SOLiDcoverageO157:H7 unique sequencesTaqMan 實驗數(shù)據(jù)驗證： 包括低濃度的O157:H7/HM 不同菌株 包括對非O157:H7的大腸桿菌菌株的檢測 不含O157的真實牛肉樣品Strain IDSerotypeAssay CtPE30O157:H736.21+PE677O157:H731.16+PE678O157:H731.61+PE679O157:H733.97+PE700O157:H736.46+PE701O157:H733.7+PE702O157:H735.66+PE703O157:H736.57+PE40O1

8、57:NM31.4+PE674O55:H7Undetermined -PE704O55:H7Undetermined -PE705O55:H7Undetermined -PE706O55:H7Undetermined -PE31O26:H11Undetermined -PE37O145:NMUndetermined -PE38O78:K80:H12 Undetermined -PE39O103:H2Undetermined -PE673O5:NMUndetermined -PE684O137:H41Undetermined -PE687O18:H21Undetermined -PE688O28

9、:H35Undetermined -PE731O26:H32Undetermined -PE735O55:H9Undetermined -PE826O154:H25Undetermined -PE827O156:H8Undetermined -Beef (17 samples)n/aUndetermined -最新O157:H7檢測試劑盒：提升特異性6小時小時 BHI增菌增菌60分鐘分鐘 DNA 提取提取40分鐘分鐘PCR25g 牛肉手工操作時間手工操作時間 1小時小時10 分鐘分鐘10 分鐘分鐘整個流程整個流程 8小時小時MicroSEQ 大腸桿菌大腸桿菌 O157:H7 工作流程工作流程1

10、0分鐘樣品分鐘樣品制備設置制備設置10 分鐘分鐘10分鐘分鐘 PCR 設置設置市場上最快的檢測方法市場上最快的檢測方法已經(jīng)獲得已經(jīng)獲得 AOAC 及及 AFNOR 的認可的認可 18 小時獲得結(jié)果小時獲得結(jié)果過夜增菌過夜增菌提取提取反應設置反應設置 運行及分析運行及分析16S rDNA雙氮養(yǎng)弧菌與創(chuàng)傷弧菌，解蛋白弧菌與副溶血性弧菌，最小弧菌與霍亂弧菌的親緣關系很近基于公共數(shù)據(jù)庫， AB自有數(shù)據(jù)庫，特定基因測序分析，篩選出針對三個目標菌種的8個不同基因的19個AssayMicroSEQ 微生物鑒定系統(tǒng)微生物鑒定系統(tǒng)快速同時檢測創(chuàng)傷弧菌，副溶血性弧菌，霍亂弧菌快速同時檢測創(chuàng)傷弧菌，副溶血性弧菌，霍

11、亂弧菌考慮到多重檢測在一起的相互影響，三個不同的種分別設計了考慮到多重檢測在一起的相互影響，三個不同的種分別設計了1-2套套不同的不同的Assay通過不同的熒光標記，將副弧、霍亂、創(chuàng)傷這三個不同種的弧菌區(qū)分開來通過不同的熒光標記，將副弧、霍亂、創(chuàng)傷這三個不同種的弧菌區(qū)分開來 致病菌檢測試劑盒致病菌檢測試劑盒沙門氏菌，單增李斯特菌大腸桿菌O157:H7空腸彎曲桿菌，金葡菌綠膿桿菌，副弧/霍亂/創(chuàng)傷軍團菌,坂崎桿菌個性化訂制個性化訂制引物、探針合成服務 轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒大豆轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒 動物健康檢測試劑盒動物健康檢測試劑盒禽流感，新城疫藍耳病，豬胎毛滴蟲豬肺

12、炎支原體，豬瘟藍舌病，副結(jié)核牛病毒性腹瀉病毒 牛呼吸道合胞體病毒 客戶實驗室設計合成客戶實驗室設計合成實驗室設計實驗室設計 人類傳染病檢測試劑盒人類傳染病檢測試劑盒甲型H1N1檢測甲型流感通用型流感亞型 H5/H7/N1炭疽芽孢桿菌/布魯氏菌鼠疫耶爾森土拉弗朗西斯菌 肉類肉類IDID鑒定試劑盒鑒定試劑盒豬肉ID鑒定牛肉ID鑒定雞肉ID鑒定 HydrophilicHydrophobicData Points per day with OpenArray基因分型基因表達70,000 32,000 OpenArray Plate Layout子陣48 (12 x 4)通孔 : 33nl64 通孔/子

13、陣 (8 x 8)SPATIAL MULTIPLEXING3072 3072 個通孔：個通孔：相當于相當于 32 x 9632 x 96孔板或者孔板或者 8 8 x 384x 384微孔板微孔板SNP位點數(shù)位點數(shù)163212864192256樣本數(shù)樣本數(shù)1449648241612XXXXXXOpenArray SNP芯片：格式一次實驗，檢測并定量多種病原體生物一次實驗，檢測并定量多種病原體生物 一次檢測多樣本 快速快速出結(jié)果 靈敏度和準確性靈敏度和準確性優(yōu)于標準的培養(yǎng)法和免疫法Life Tech 可以幫助用戶設計所需的芯片應用案例：人類病原體檢測應用案例：人類病原體檢測來自Robert Sli

14、nger 小組在加拿大安大略省兒童醫(yī)院的實驗結(jié)果從臨床樣品(咽喉拭子棒）快速檢測多種呼吸道病毒或病菌. 驗證 在OpenArray 平臺上檢測納升級別的qPCR反應的適用性“We wanted to see if we could use qPCR to figure out the cause of infections, and thought the OpenArray platform had the most potential because we could do thousands of reactions at once,” Robert Slinger, CHEOViral

15、 Influenza A-pan Influenza A H3, H1 & H5 Influenza A H1 Swine 2009 strain Influenza A N1 oseltamivir-resistance mutation Influenza B Respiratory syncytial virus A and B Parainfluenza virus 1-4 Rhinovirus Enterovirus Coronavirus OC43, NL63, HKU1, 229E Human metapneumovirus Bocavirus Adenovirus一張芯

16、片整合多種呼吸道病原體檢測BacterialMycoplasma pneumoniaeChlamydophila pneumoniaeLegionella pneumophilaMycobacterium tuberculosisStreptococcus pneumoniaeStreptococcus pyogenesStaphylococcus aureusMethicillin-resistant Staphylococcus aureusStreptococcus dysgalactiae subsp. Equisimilis (Group C and G streptococci)S

17、treptococcus agalactiae (Group B streptococcus)Haemophilus influenzaeMoraxella cararrhalisBordetella pertussisBordetella parapertussisOne sample 每個樣本檢測22種呼吸道病毒和 16種呼吸道 細菌 每張芯片檢測12個樣本 每個檢測3重復 每個病毒檢測3個target 每個和樣品8個空白對照內(nèi)參人工合成對照qPCR AssaysMicroSEQ 微生物鑒定系統(tǒng) 第一階段：依據(jù)表型鑒定分型第一階段：依據(jù)表型鑒定分型 培養(yǎng)、培養(yǎng)、格蘭氏染色、生理生化、形態(tài)學

18、等格蘭氏染色、生理生化、形態(tài)學等 黃金時代：上世紀黃金時代：上世紀8080年代年代- - 本世紀初本世紀初 第二階段：片段長度多態(tài)性分析第二階段：片段長度多態(tài)性分析 限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性( (RFLP)RFLP)、隨機擴增的多態(tài)性、隨機擴增的多態(tài)性DNA(RAPD)DNA(RAPD)、脈沖場凝膠電泳、脈沖場凝膠電泳( (PFGE)PFGE)、細菌的核糖體基因分型、細菌的核糖體基因分型( (Ribotyping)Ribotyping)、多位點序列分析多位點序列分析( (MLST)MLST)、擴增片段、擴增片段長度多態(tài)性長度多態(tài)性( (AFLP)AFLP) 、重復序列擴增、重復

19、序列擴增( (rep-PCR)rep-PCR) 黃金時代：本世紀初黃金時代：本世紀初- -至今至今 第三階段：基因序列分析（分子生物學的方法）第三階段：基因序列分析（分子生物學的方法） 采用測序技術，確定目標基因的每個堿基采用測序技術，確定目標基因的每個堿基 黃金時代：現(xiàn)在黃金時代：現(xiàn)在- - 未來未來5-105-10年年/ /下一代單分子測序技術產(chǎn)生下一代單分子測序技術產(chǎn)生細菌命名學的新標準細菌命名學的新標準 伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊采用采用16S 16S rDNA rDNA 測序測序提供更高的分類學信息提供更高的分類學信息 快速準確提供鑒定結(jié)果快速準確提供鑒定結(jié)果客觀性，重

20、現(xiàn)性好客觀性，重現(xiàn)性好方便不同團體、實驗室間信息方便不同團體、實驗室間信息共享和交流共享和交流正在成為微生物鑒定的金標準正在成為微生物鑒定的金標準 不需要事前掌握微生物的信息不需要事前掌握微生物的信息 微小的可見的單菌落即可微小的可見的單菌落即可 無需革蘭氏染色 無需生化試驗 無需鑒定的經(jīng)驗Easy 5-step Workflow結(jié)果 數(shù)據(jù)比對結(jié)果 種 最高匹配 同源性 遺傳進化樹 差異 全部經(jīng)過驗證全部經(jīng)過驗證 16S 500:16S 500: 2020 2020 entriesentries 16S 16S 全基因全基因: : 1261 1261 entriesentries D2 (D2

21、 (真菌真菌):):1113 1113 entriesentries每隔一年半定期更新每隔一年半定期更新 新增加的菌新增加的菌 最新的命名原則最新的命名原則包括諸多環(huán)境分離菌的信息包括諸多環(huán)境分離菌的信息使用者可以登錄公司網(wǎng)站提供使用者可以登錄公司網(wǎng)站提供建議建議 最大，最全面且經(jīng)過驗最大，最全面且經(jīng)過驗證的細菌和真菌數(shù)據(jù)庫證的細菌和真菌數(shù)據(jù)庫MicroSEQ ID 的方法 準確 重現(xiàn)性好 穩(wěn)定 簡單 將不能或難以鑒定的微生物種類從20 下降到2！MicroSEQMicroSEQ微生物鑒定系統(tǒng)微生物鑒定系統(tǒng) 基于基于16S rRNA 16S rRNA 序列測定實現(xiàn)細菌在種水平的鑒序列測定實現(xiàn)細

22、菌在種水平的鑒定定 基于核糖體大亞基基于核糖體大亞基 (LSU) (LSU) 序列測定實現(xiàn)真菌在序列測定實現(xiàn)真菌在種水平的鑒定種水平的鑒定菌株分型的分子平臺菌株分型的分子平臺 測序檢測測序檢測 MLSTMLST 片段分析片段分析 AFLPAFLP MLVAMLVA微生物耐藥機理的研究微生物耐藥機理的研究 SNaPshot MultiplexSNaPshot Multiplex SSCPSSCP多重多重 PCRPCR選擇正確的擴增引物是取得成功的關選擇正確的擴增引物是取得成功的關鍵鍵16 16 個甚至更多的個甚至更多的 STR STR 位點同時被擴位點同時被擴增增7 repeats8 repea

23、tsSTR STR 位點位點 由特定引物延伸的旁側(cè)序列具有保守由特定引物延伸的旁側(cè)序列具有保守性性 不同菌株的串聯(lián)重復序列拷貝數(shù)存在不同菌株的串聯(lián)重復序列拷貝數(shù)存在差異差異AMELD3TH01TPOXPenta DPenta EFGAD21D18CSFD16D7D13D5VWAD8由遺傳分析儀電泳分離由遺傳分析儀電泳分離PCRPCR擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物/ /片段片段 結(jié)合不同的熒光染料標記和遷移率的修飾結(jié)合不同的熒光染料標記和遷移率的修飾技術，實現(xiàn)多重分析技術，實現(xiàn)多重分析MLVA 是食源性微生物分型國際組織是食源性微生物分型國際組織Pulsenet推薦的食品微生物分型方法，推薦的食品微生物分型方

24、法，中國中國CDC及各省級及各省級CDC均設立相關機構參與其中均設立相關機構參與其中. Lindstedt, Lindstedt, et alet al. (2003) . (2003) Ann. Clin. Ann. Clin. Microbiol. Antimicr.,Microbiol. Antimicr., 2, 12. 2, 12.Seven locus MLVA scheme in a single dye Seven locus MLVA scheme in a single dye channelchannelIdentified 47 distinct MLVA patter

25、ns Identified 47 distinct MLVA patterns among 73 O157:H7 strainsamong 73 O157:H7 strainsSequence alignment of the Vhec4 VNTR loci from isolates G5300 and IHE5344. The results from the sequencing show that the electrophoretic mobility shift between isolates IHE5344 (upper strand) and G5300 (lower strand) is caused by different numbers of AAATAG repea