流式細(xì)胞術(shù)樣品制備技術(shù)

1、流式細(xì)胞術(shù)樣品制備技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞的分析檢測必須基于單細(xì)胞的基礎(chǔ)上，這是流式細(xì)胞術(shù)的基本要求。 因此就必須把實(shí)體組織制備成單細(xì)胞懸液。在應(yīng)用 FCM 技術(shù)中，制備出合格的單分散細(xì)胞 是流式細(xì)胞術(shù)樣本制備技術(shù)中重要的一環(huán)。 它要求這種分散細(xì)胞方法既要使細(xì)胞成為單個(gè)細(xì) 胞，又能保持細(xì)胞的固有生物化學(xué)成分及生物學(xué)特性。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備大致可分為下面五個(gè)步驟：取材：取手術(shù)或活檢組織必須具有代表性， 如取手術(shù)腫瘤組織， 必須取瘤細(xì)胞生長旺盛部位； 組織等標(biāo)本必須在取材后保持樣 本的新鮮； 一般在室溫 1 個(gè)小時(shí)之內(nèi)處理好樣本或及時(shí)用固定劑或低溫對組織進(jìn)行保存；對細(xì)胞的待測生物化學(xué)成分進(jìn)行熒光染色；

2、按照廠家提供的軟件程序?qū)颖具M(jìn)行獲取、檢測和存儲(chǔ)； 再依照軟件提供的程序?qū)z測結(jié)果進(jìn)行定量分析； 檢測分析結(jié)果在生物、 醫(yī)學(xué)上的意義進(jìn)行分析和評價(jià)。第 1 節(jié) 樣本單細(xì)胞懸液的制備方法 一 新鮮實(shí)體組織樣本的制備FCM 對單細(xì)胞快速進(jìn)行各種參數(shù)分析必須基于單細(xì)胞基礎(chǔ)上，根據(jù)各種組織成分的特 點(diǎn)，可選擇不同的分散細(xì)胞方法，以期達(dá)到單細(xì)胞產(chǎn)額高、損傷少的目的。盡管標(biāo)本制備已形成了標(biāo)準(zhǔn)化的程序， 但實(shí)際操作中總會(huì)出現(xiàn)這樣或那樣的問題。 在實(shí)體組織分散為單個(gè)細(xì) 胞過程中，解離的方法可能瞬間地或持久地影響細(xì)胞的性質(zhì)、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能等。所以， 在對各種不同組織進(jìn)行分散選擇方法時(shí)， 應(yīng)盡量減少對細(xì)胞的這種

3、影響。 目前常用的分散組 織細(xì)胞的方法有如下 3 種。（一）酶消化法1 作用原理：對實(shí)體組織分散的作用原理主要有3方面：可以破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等； 可以水解組織間的粘多糖等物質(zhì)；可以水解組織細(xì)胞間的緊密聯(lián)結(jié)裝置的蛋白質(zhì) 物質(zhì)。 酶消化法是實(shí)體瘤、培養(yǎng)細(xì)胞分散為單細(xì)胞的主要方法之一。常用的酶類試劑有：蛋 白酶類胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解離組織中的細(xì)胞。 胰蛋白酶能水解脂鍵和肽鍵； 膠原酶能降解幾種分子類型的膠原； 溶菌酶能水解糖蛋白和肽 的糖苷鍵； 彈性蛋白酶能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖維。 不同酶對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞 間不同組分有特異作用，可根據(jù)分散組

4、織類型來確定使用的酶類。2 注意事項(xiàng)： 酶需要溶解于適當(dāng)?shù)娜芤褐?，而這些溶液不致于造成酶效價(jià)降低；要注意酶的使 用濃度和消化時(shí)間；要注意酶活性的 PH值。如胃蛋白酶在堿性環(huán)境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶劑中活性不佳等； 要隨時(shí)注意影響酶活性的其它因素， 如酶的生產(chǎn)批號(hào)等。 3 方法學(xué)程序（1）將適合于酶消化的組織置于離心管中；（2）將選好的酶溶液 1-2ml 加入盛有被消化組織的試管中；（3） 一般消化20-30分鐘（恒溫37C或室溫），消化期間要間斷振蕩或吹打；（4）終止消化，收集細(xì)胞懸液，以 300 目尼龍網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞團(tuán)塊，以低速成離心除去細(xì)胞碎片；5） 將制備好的單細(xì)胞懸液進(jìn)行進(jìn)一步

5、熒光染色后上機(jī)檢測，或保存?zhèn)溆谩＃ǘC(jī)械法機(jī)械法分散實(shí)體組織包括： 用手術(shù)剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織， 用勻漿器勻 漿，再用細(xì)注射針頭抽吸細(xì)胞或用 300 目尼龍網(wǎng)濾出單細(xì)胞懸液； 采用搓網(wǎng)法也能獲得大量 細(xì)胞。機(jī)械法易造成細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)塊，所以機(jī)械法常與其它方法配合使用。1 剪碎法： 將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水； 用剪刀將組織剪至勻漿狀； 加入 10ml 生理鹽水； 用吸管吸取組織勻漿，先以 100 目尼龍網(wǎng)過濾到試管中； 離心沉淀 1000prm,3-5min ，再用生理鹽水洗 3 遍，每次以低速（ 500-800prm ）短時(shí)離心 沉淀去除細(xì)胞碎片； 以 300 目

6、尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團(tuán)塊； 細(xì)胞用固定液固定或低溫保存?zhèn)溆谩? 網(wǎng)搓法 將 100 目， 300 目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上； 把剪碎的的組織放在網(wǎng)上， 以眼科鑷子輕輕搓組織塊， 邊搓邊加生理鹽水沖洗， 直到將 組織搓完； 收集細(xì)胞懸液，離心沉淀 500-800prm，2 分鐘； 固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆谩? 研磨法 準(zhǔn)備一只 70ml 研磨器。 先將組織剪成 1-2mm3 大小組織塊； 放入組織研磨器中加入 1-2ml 生理鹽水； 轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研至勻漿； 加入 10ml 生理鹽水，沖洗研磨器； 收集細(xì)胞懸液，并經(jīng) 300 目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀500-800 prm，1-2 min ，再以生理鹽水洗 3 遍

7、，離心沉淀； 固定或低溫保存細(xì)胞懸液，備用。（三）化學(xué)處理法1 作用原理 化學(xué)處理法是將組織細(xì)胞間起粘著作用的鈣鎂離子置換出來，從而使細(xì)胞分散開來。2 試劑的配制 0.2%EDTA配制：稱EDTA 0.2g，加入Hank / s液100ml，封裝高壓消毒。置 0C -4 C 保存； 胰酶加 EDTA 配制：胰酶 0.25g 力口 PBS （pH7.0） 200ml，濃度 0.125% , EDTA 0.2g 加 PBS（ pH7.0）100ml，濃度0.2%。各取40ml混合，分裝置冰箱保存，用時(shí)過濾即可使用。3 實(shí)驗(yàn)方法 將組織切成薄片，置入試管中； 首先加入EDTA液5ml，室溫下0.5h

8、，離心棄之; 再加入胰酶-EDTA液5ml。在37C恒溫水浴振蕩器內(nèi) 30min ; 用 300 目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀 1000prm， 5min 。再以生理鹽水洗 2-3 次; 細(xì)胞固定或低溫保存?zhèn)溆?。以上幾種分散細(xì)胞的方法都是目前對實(shí)體組織解聚的常用的方法。 實(shí)驗(yàn)證明， 用化學(xué)試 劑方法處理組織導(dǎo)致細(xì)胞成活率低， 細(xì)胞產(chǎn)額低， 細(xì)胞碎片和細(xì)胞聚集的量不穩(wěn)定； 化學(xué)試 劑可單獨(dú)使用， 也可與其它方法結(jié)合使用； 機(jī)械法常常造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷， 單細(xì)胞產(chǎn)量低； 酶學(xué)法、 化學(xué)法對實(shí)體組織的分散解聚較理想， 但對所測化學(xué)成分有不良影響。 所以要根據(jù) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜ミx擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法， 才能

9、獲得理想的樣本和更好的 FCM 檢測結(jié)果。（四）注意事項(xiàng) 新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時(shí)進(jìn)行處理保存， 以免組織在室溫下放置時(shí)間過長， 產(chǎn)生中心組織壞 死以及細(xì)胞自溶，影響 FCM 測定結(jié)果； 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇最隹的固定方法，以免由于固定劑的原因，造成FCM 檢測結(jié)果的不穩(wěn)定； 酶學(xué)法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時(shí)間、pH 值、濃度等方面對酶消化法的影響。 需注意不同組織， 選擇相應(yīng)的方法； 如富于細(xì)胞的組織淋巴肉瘤、 視神經(jīng)母細(xì)胞瘤、 腦瘤、 未分化瘤、髓樣癌以及一些軟組織肉瘤等， 就不一定采用酶學(xué)法或化學(xué)法； 往往 用單純的機(jī)械法就可以獲得大量高質(zhì)量的單分散細(xì)胞； 在使用酶學(xué)方法時(shí)

10、， 要重視酶的選用， 如含有大量結(jié)締組織的腫瘤食管癌、 乳腺癌、 皮膚癌等， 選用膠原酶較好， 因?yàn)槟z原酶具有在 Ca+、Mg+ 存在或在血清狀態(tài)下不發(fā) 生活性降低的特性。組織活檢、內(nèi)窺鏡取材標(biāo)本單細(xì)胞懸殊液的制備正常組織、瘤組織和淋巴結(jié)等活檢組織以及內(nèi)窺鏡（胃鏡、食管鏡等）取材標(biāo)本，由于材料較少，制備起來比較麻煩。但其制備方法與實(shí)體組織基本相似。12取材后立即放入盛少許 PBS 液青霉素小瓶中； 另取一只小燒杯，杯口用 300 目尼龍網(wǎng)蓋住并用線繩固定好，并用 鮮組織標(biāo)本置尼龍網(wǎng)上；因標(biāo)本量較少，尤其是內(nèi)窺鏡取材只少要取 在操作前，先將剪刀用 PBS 液浸潤一下，然后開始剪碎組織； 先剪幾下

11、，視基本無組織塊存在時(shí)，用原來裝標(biāo)本的青霉素小瓶中的 胞均漿并過濾于小燒杯中； 如果這時(shí)仍有可見組織塊， 再用剪刀剪碎， 液沖洗，直至網(wǎng)上無組織塊為止。這樣可盡量多的收集細(xì)胞； 細(xì)胞加固定液或低溫保存，備用。PBS 液濕潤；取新3 塊以上；PBS 液，沖洗細(xì) 再加適量該 PBS擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍。 對大量臨床隨訪 可以重新得到深入研究和利用。 現(xiàn)將常用的石蠟石蠟包埋組織樣本的制備石蠟包埋組織單細(xì)胞分散方法的建立， 資料通過病理包埋組織的流式細(xì)胞術(shù)分析， 包埋組織制備單細(xì)胞方法介紹如下。1 實(shí)驗(yàn)方法： 把石蠟包埋組織切成 40-50um 厚的組織片 3-5 片，或用乳缽研成 0.5mm

12、直徑大小顆粒 狀，放入 10ml 的試管中； 加入二甲苯 5- 8ml, 在室溫下脫蠟 1-2 天，視石蠟脫凈與否，更換 1-2 次二甲苯，石蠟 脫凈后，棄去二甲苯； 水化：依次加入 100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步為10 min，去乙醇，加入 蒸餾水 3-5 ml ， 10 min 后棄之； 消化：加入2 ml 0.5%胰蛋白酶(pH 1.5-2.0 )消化液，置37C恒溫水浴中消化 30 min , 在消化期間，每隔 10min 用振蕩器振蕩 1 次； 消化 30 min 后，立即加生理鹽水終止消化； 經(jīng) 300 目尼龍網(wǎng)過濾，未消化好的組織可做第 2 次消化； 收集細(xì)

13、胞懸液， 離心沉淀 1500 prm ,再以生理鹽水漂洗 1-2 次，離心沉淀 500-800 prm 去 碎片； 保存細(xì)胞備用。2 注意事項(xiàng) 一定將石蠟從組織中脫干凈， 一般脫蠟第 1 遍應(yīng)在 12 小時(shí)左右， 第 2 遍為 30min 左右， 檢測是否將石蠟已脫凈的方法 : 是棄去二甲苯，加入無水乙醇如果無絮狀物浮起，即可 視為蠟已脫凈，反之則蠟尚未脫凈； 消化時(shí)間不可過長，以免造成已釋放出的細(xì)胞核被消化； 切片不可過薄或過厚，過薄細(xì)胞碎片過多，影響分析結(jié)果；過厚造成脫蠟不理想。 消化后的組織應(yīng)先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min , 37C，然后用尖吸管吹打成懸液狀； 消化

14、后的組織懸液經(jīng)過過濾后可能細(xì)胞數(shù)很少，這樣就要將組織片放在300 目尼龍網(wǎng)上，用底部圓滑的試管磨碎，再用 PBS 液沖洗一下；如此反復(fù)，就能得到較多的 單細(xì)胞懸液。四 外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本的制備血液是天然的單個(gè)細(xì)胞分散的細(xì)胞懸液， 血細(xì)胞在生理狀態(tài)下呈分散的游離狀態(tài)。 它是 流式細(xì)胞分析的理想樣品。 血液中的主要細(xì)胞成分為白細(xì)胞、 紅細(xì)胞和血小板； 而其中白細(xì) 胞主要成分又分為淋巴細(xì)胞、 單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。 但在血細(xì)胞中一般檢測單個(gè)核細(xì)胞較為多 見。1 外周血細(xì)胞樣本制備方法的選擇一般檢測細(xì)胞大分子成分 DNA、 RNA 、總蛋白質(zhì)、個(gè)別基因表達(dá)蛋白等，多采用 淋巴細(xì)胞分離液分離法制備單個(gè)核細(xì)

15、胞懸液。 這樣可以從血液中分離出單個(gè)核細(xì)胞淋巴 細(xì)胞、單核細(xì)胞、幼稚血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。外周血免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、某些基因蛋白、 細(xì)胞表面標(biāo)志檢測可采用溶紅細(xì)胞法。2 單個(gè)核細(xì)胞樣品制備程序： 取外周血2ml，肝素抗凝，用生理鹽水將血稀釋成4 ml ,混勻； 將稀釋后血液沿試管壁徐徐加入 4ml 淋巴細(xì)胞分離液到液面之上，勿用力過大，以免造 成血液與分離液混合，保持清晰的分層狀態(tài)； 離心2000prm,30min,室溫18-20 C,離心后可見試管內(nèi)的血液清楚的分為4層，上層為血漿層， 中層為分離液層 （單個(gè)核細(xì)胞所處于血漿層和分離液層中間） ，底層為紅細(xì)胞層， 紅細(xì)胞層上為粒細(xì)胞層； 用吸管

16、將上層與中層之間的淋巴細(xì)胞層吸出收集到另 1 試管中，用生理鹽水洗 2 遍， 每 次均以 1500 prm ,10 min , 棄上清后即得到高純度的單個(gè)核細(xì)胞懸液； 用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭ɑ蛑玫蜏乇浔４娲谩Ｎ?骨髓細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備1 制備方法（1）無菌抽取骨髓液 0.5 ml；（2）將骨髓標(biāo)本滴入 1000u/ml 肝素抗凝的 1 ml PBS 液中；（3）再加入PBS液稀釋至10ml;（4）用吸管吸取 5 ml 稀釋骨髓液徐徐加入盛有 4 ml 的人類淋巴細(xì)胞分離液液面之上；（5）在以上條件下，骨髓有核細(xì)胞分層在 PBS-人類淋巴細(xì)胞分離液之間形成的界面上；（6）吸取有核細(xì)胞層，加入到

17、 10 ml PBS液中，混勻；（ 7）以 1000 prm 離心 5 min ，棄上清；收集骨髓細(xì)胞，加固定液或置低溫冰箱備用。2 注意事項(xiàng)（1）抽骨髓液時(shí)，先將注射器針頭、針筒、針?biāo)ㄓ酶嗡亟?，抽取時(shí)力量適中；（2）在吸取淋巴細(xì)胞層時(shí)盡量少吸分離液，量應(yīng)掌握在 300 ul 左右，這樣有利于洗去多余的分層液；（3）紅細(xì)胞的方法：以等量的蒸餾水加入到沉淀中，輕輕搖動(dòng)片刻，見粉紅色出現(xiàn)，立 即加入大量生理鹽水，混勻，離心，去除上清即可。六 培養(yǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備1 培養(yǎng)細(xì)胞的特征高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液是 FCM 分析的保證。一般細(xì)胞培養(yǎng)分為懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)，由 于細(xì)胞的增殖， 都有可能形成大

18、小不等的細(xì)胞團(tuán)塊或連接成片。 如果兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞粘連在 一塊或細(xì)胞碎片過多都將影響 FCM 結(jié)果，進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。所以，制備合格的培養(yǎng)細(xì)胞 單細(xì)胞懸液十分重要。2 培養(yǎng)細(xì)胞樣品的制備程序：（1） 將培養(yǎng)細(xì)胞用0.04%乙二胺四乙酸二鈉鹽 （EDTA2Na ）或0.29%胰酶消化3-7min，（根據(jù)室溫情況而定） ，至光鏡下見到貼壁細(xì)胞間出現(xiàn)篩狀間隙為止） ，棄去消化液，加 PBS 液；（2）用吸管將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹打下來，并移入離心管中；（3）短時(shí)低速離心，即 800-1000prm， 5 min；（4） 棄上清，加 pH7.4的PBS液5-8ml，低速短時(shí)離心，800-1000prm，3

19、-5 , min ;重復(fù)2- 3 次，以去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片；（ 5） 加少許 PBS 液，將沉淀細(xì)胞輕輕吹打均勻。加固定液或低溫保存待用。七 脫落細(xì)胞樣品單細(xì)胞懸液的制備在臨床工作中， 可以收集到大量自然脫落細(xì)胞， 這些細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)過簡單處理， 便可成為 較好的單細(xì)胞懸液，提供流式細(xì)胞術(shù)分析。主要包括脫落細(xì)胞、胸腹水細(xì)胞、尿液、內(nèi)鏡刷 檢細(xì)胞等。1 食管拉網(wǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備(1) 將食管拉網(wǎng)器上的細(xì)胞洗脫到20 ml PBS液中，以1500 prm離心后，再用PBS液洗2次，離心 500-800 prm, 1-2 min ，棄上清；(2) 再加入 PBS 液 5 ml ，以 300

20、目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；(3) 加少許 PBS 液混勻沉淀細(xì)胞，加固定液或低溫保存，備用。2 尿液脫落細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備(1) 用一清潔器皿收集 24小時(shí)尿液，置4C冰箱中自然沉淀2小時(shí)，輕輕倒去上清液， 留下少許帶細(xì)胞的沉淀物，用吸管移至 10-20 ml 離心管中；( 2)500 prm 離心 10min ，去上清；(3) 力口 PBS液8-10 ml，以1000 prm 離心10 min，去上清；重復(fù)再洗1次；(4) 再加 5 ml PBS 液混勻，用 300 目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；( 5) 再加少許 PBS 液，混勻。加固定液或低溫保存，備用。3 胸、腹水脫落細(xì)胞

21、的制備(1) 抽取胸、腹水50-100 ml ,加入1000ui/ml肝素液1 ml，放鹽水瓶中置于 4C冰箱 中靜置 6-12 小時(shí)，棄去上清；(2) 10-20mI ,用長吸管移入試管中，用PBS液洗3次，以1500 prm離心沉淀5min ；(3) 再加 5 ml PBS 液混勻，用 300 目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；( 4) 加少許 PBS 液，混勻；加固定液或低溫保存，備用。4 沖洗液細(xì)胞樣品的制備(1) 用 300-500 ml 生理鹽水沖洗膀胱 ,沖洗一定時(shí)間后 ,吸出沖洗液放入容器中于冰箱內(nèi)置 6-12 小時(shí)；(2) 取沉淀液 20-40 ml ,離心沉淀并以生理鹽水洗2

22、 次, 吸上清；(3) 加10 mIPBS液，混勻；以300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；( 4) 過濾后 1000prm,10 min ，離心沉淀，去上清；加固定液或低溫保存?zhèn)溆?。七、網(wǎng)織紅細(xì)胞樣品的制備計(jì)數(shù)血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)量，對估價(jià)骨髓中紅細(xì)胞的生成活性有重要意義。1 染色原理 網(wǎng)織紅細(xì)胞是一種未完全成熟紅細(xì)胞。在工細(xì)胞成熟過程中，其胞漿中的RNA 含量逐漸被血紅蛋白所取代，因此，檢測紅細(xì)胞中 RNA 的含量多，就代表了紅細(xì)胞的成熟程度。 從而成為檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞的重要方法。2 樣品的制備(1) 抽取全血 0.5ml，注入盛有 0.5ml的0.1mol/L EDTA 溶液中；(2) 用

23、微量取液器及取 50卩l(xiāng)EDTA抗凝血，置于另一離心管中，加入Good1s緩沖液5.0ml, 離沉淀 1000prm,5min ，連續(xù)洗 3 次；(3) 將沉淀細(xì)胞加入 1.0ml 枸椽酸鈉緩沖液，輕輕振蕩懸??；(4) 將懸浮液緩慢注入盛有 4ml 0.1%戊二醛緩沖液中固定 15min；(5) 上 FCM 之前，用 PBS 洗去固定劑， 加入 0.5ml 0.01%的派若寧工作液； 染色 30min 離 心沉淀去染液， 1500prm,5 min ；(6) 用PBS洗一次，離心1500prm, 5min，去上清，再用 PBS將細(xì)胞懸浮，上機(jī)檢測。八、血小板檢測樣品的制備循環(huán)性血小板在血管受傷

24、部位迅速形成止血栓子， 這些細(xì)胞也參與因血管壁的改變激發(fā) 的血栓形成而引起的血流阻塞。 另外， 血小板還能吸引和結(jié)集白細(xì)胞而參于組織損傷、 炎癥 反應(yīng)和創(chuàng)傷愈合。血小板膜蛋白(粘附分子)它存在于血小板表面或嵌入a -顆粒中，在正常血小板粘附或凝聚過程式中起關(guān)鍵作用。血小板膜糖蛋白主要包括：富亮氨酸糖蛋白( CD42b/CD42a )、整合素( VLA-2 )( CD42b/CD29 )、整合素( VLA-5 )( CD49e/CD29 )、 整合素 -6(VLA-6 ) ( CD49f/CD29 )、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子 -1 (PECAM-1 )(CD31 ) 、CD36 、 整合素( C

25、D41/CD61 )和 P 選擇素( CD62p )。1 血小板標(biāo)記方法 全血法單標(biāo)測血小板 CD62p、 CD63、CD42b、CD41 、CD61 等指標(biāo)。 染色方法步驟：( 1 ) 采血枸櫞酸鹽或 EDTA 抗凝；(2) 10卩I熒光標(biāo)記抗體，加 100卩I PBS，再加5卩I全血(樣品管)；10卩I抗體同型對照，加100卩I PBS，再加5卩I全血(對照管); 輕輕混勻，室溫孵育 15min ；(3) 加2-3ml PBS (1% PFA)終止反應(yīng)，上機(jī)檢測分析。2 全血法雙標(biāo)記檢測活化血小板(如 CD62p-FITC/CD42b-PE ) 染色方法步驟：( 1 ) 采血枸櫞酸鹽或水蛭

26、素抗凝；(2) 10 卩 I CD62p-FITC 力口 10 卩 I CD42b-PE,再加 5 卩 I 全血；(樣本管)10卩I IgG 1-FITC加10卩I IgG 1-PE,再加5卩I全血；(對照管) 輕輕混勻，室溫孵育 15min;(3) 力口 2-3 ml PBS (1.0 PFA)終止反應(yīng)，上機(jī)以 SS-LOG/CD42b-PE圈定血小板檢測分 析。3 流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板方法學(xué)的注意事項(xiàng)( 1 ) 抗體的選擇：選擇 CD workshop 中的單克隆抗體。因?yàn)閱慰寺】贵w反應(yīng)特異性高，非特異性結(jié)合少。但由于血小板富含 Fc RH (CD32,Fc H受體)，而Fc受體對不同抗體 亞類具有不同親合力，所以在亞類選擇上， 對于人的抗體以選擇 IgG1 為好 。(2) 抗凝劑的選擇：肝素盡量避免用；EDTA在室溫20-25 C時(shí)其抗凝效果與枸椽酸鹽無差 另但在37C時(shí)，EDTA就會(huì)影響蛋白結(jié)構(gòu)及剌激血小板活化。(3) 標(biāo)本的采集： 一般采少量外周血