分子生物學(xué)許曉東NXPowerLite

1、5 分子生物學(xué)研究方法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)從20世紀(jì)中葉開(kāi)始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步?；虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。 基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。 基因工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過(guò)它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。 事實(shí)上，這種跨越物種屏障

2、、把來(lái)自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。5.1 重組DNA技術(shù)回顧 三大成就 40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題； 50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題； 50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō),成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。 重組DNA技術(shù)歷史上的主要事件 年份事 件 1869F Miescher首次從萊茵河鮭魚(yú)精子中分離DNA。1944O.T. Avery證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)。1

3、952A.D. Hershey和M.Chase再次證實(shí)和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1958M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。1959-1960S. Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一個(gè)遺傳密碼；F. Jacob和J. Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。1964 C.

4、 Yanofsky和S. Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測(cè)定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由質(zhì)粒DNA所決定。1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于

5、72年獲得第一個(gè)重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。1975-1977F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測(cè)定技術(shù)。1977年完成了全長(zhǎng)5387bp的噬菌體174基因組測(cè)定。1978 首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。1980美國(guó)聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。1981R. D. Palmiter和R. L. Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物-胰島素；Sanger等人完成了噬菌體48,502bp全序列測(cè)定

6、。1983 獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984 斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。1986 GMO(genetically modified organism)首次在環(huán)境中釋放。1988 J. D. Watson出任人類基因組計(jì)劃首席科學(xué)家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠-Oncomouse。1992 歐共體35個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測(cè)定。1994第一批基因工程西紅柿在美國(guó)上市。1996完成了酵母基因組(1.25107bp)全序列測(cè)定。1997英國(guó)愛(ài)丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個(gè)高等植物擬南芥的全序列測(cè)定。2001完成第一個(gè)人類基因組全序列測(cè)定。2004

7、中國(guó)科學(xué)家完成家蠶基因組全序列測(cè)定。2005中、美、日科學(xué)家聯(lián)合完成水稻基因組全序列測(cè)定。質(zhì)粒是真核細(xì)胞細(xì)胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體DNA以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體(Vector)。嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有12個(gè)質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞 內(nèi)一般有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理（如氯霉素）抑制寄主蛋白質(zhì)的合

8、成還 會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。 功能：進(jìn)行細(xì)胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。質(zhì)粒一個(gè)質(zhì)粒實(shí)例限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)DNA分子。 1972年Boyer實(shí)驗(yàn)室第一個(gè)發(fā)現(xiàn)了核酸內(nèi)切酶EcoRI的識(shí)別序列。命名：Escherichia coli RY13 中第一個(gè)內(nèi)切酶 EcoRIEcoRIEcoRVBsaISfiI同裂酶ApaIGGGCC/CPspOMIG/GGCCC同工同裂酶EcoRIG/AATTCFunIIG/AATTC同尾酶NcoIC/CATGGBspHIT/CATGA雙酶切單酶切去磷酸化防止自連N

9、coIBspHIPciIBsaI一個(gè)克隆實(shí)驗(yàn)實(shí)例NcoI載體質(zhì)粒上的多克隆位點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶探針標(biāo)記、補(bǔ)平3末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾吧堿性磷酸酶3切除末端磷酸基DNA外切酶3末端切除單核苷酸噬菌體DNA外切酶5末端切除單核苷酸重組DNADNA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的主要工具酶轉(zhuǎn)化外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化。早在1943年，Avery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺炎雙球菌的DNA與無(wú)毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺炎雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。由于天然狀態(tài)下DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在分子生物學(xué)和基因

10、工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理，就成為感受態(tài)細(xì)菌，當(dāng)加入重組質(zhì)粒并突然由4轉(zhuǎn)入42作短時(shí)間處理，質(zhì)粒DNA就能進(jìn)入細(xì)菌；用高電壓脈沖短暫作用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱為電穿孔（electroporation）轉(zhuǎn)化法。將連接有所需要的DNA的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的常用方法有四種：轉(zhuǎn)化，用質(zhì)粒作載體所常用的方法。轉(zhuǎn)染，用噬菌體DNA作載體所用的方法，這里所用的噬菌體DNA并沒(méi)有包上它的外殼。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。 轉(zhuǎn)導(dǎo)，用噬菌體作載體所用的方法，這里所用的噬菌體DN

11、A被包上了它的外殼，不過(guò)這外殼并不是在噬菌體感染過(guò)程中包上，而是在離體情況下包上的，所以稱為離體包裝。注射，如果宿主是比較大的動(dòng)植物細(xì)胞則可以用注射方法把重組DNA分子導(dǎo)入。 核酸凝膠電泳技術(shù) 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù) 實(shí)時(shí)定量PCR 基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建5.2 DNA基本操作技術(shù)5.2.1 5.2.1 核酸凝膠電泳技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈離子化狀態(tài)，DNA和RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰離子，把它們放置在電場(chǎng)當(dāng)中，會(huì)向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以

12、同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。準(zhǔn)備膠板配制瓊脂糖凝膠倒膠上樣溴化乙錠由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。DNA的遷移速度與構(gòu)型有關(guān)聚丙烯酰胺凝膠電泳DNA雙脫氧法測(cè)序原理普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進(jìn)行超大分子研究，要用到脈沖電場(chǎng)凝膠電泳脈沖電場(chǎng)凝膠電泳原理脈沖電場(chǎng)凝膠電泳效果5.2.2 5.2.2 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNADNA分子的增殖分子的增殖準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化態(tài)細(xì)胞42熱沖擊

13、電轉(zhuǎn)化加入外源DNA細(xì)胞復(fù)蘇平板篩選CaCl210%甘油藍(lán)白斑篩選+ 抗生素 + IPTG + X-gal 要靈活運(yùn)用，根據(jù)不同情況設(shè)計(jì)篩選策略！電轉(zhuǎn)化儀利用噬菌體顆粒能夠有效將DNA注入到宿主細(xì)胞這一特點(diǎn)，科學(xué)家又發(fā)明了DNA分子的體外包裝法延伸：其他基因?qū)敕椒ㄋ{(lán)白斑篩選5.2.3 5.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)模板引物DNA聚合酶dNTPMg2+Polymerase Chain Reaction，PCR 變性退火延伸PCR引物設(shè)計(jì)：引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp。引物在模板內(nèi)最好具有單一性，特別是3端。引物序列的GC 含量最好在40一60，且上下游引物序列GC含量的差異不

14、要太大。避免形成穩(wěn)定的引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu) 。 引物二聚體引物不專一聚合酶（Taq酶）Taq酶是從水生棲熱菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分離出的具有熱穩(wěn)定性的DNA 聚合酶。與一般酶不同,用Taq酶擴(kuò)增DNA時(shí)常使3端凸出一個(gè)A，可用于TA Cloning. RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄PCR)5.2.4 5.2.4 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCRPCRTaqMan熒光探針熒光探針SYBR Green熒光染料熒光染料5.2.5 5.2.5 基因組基因組DNADNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建 從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA將其切成預(yù)期大小的片段，分別與載體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，形成克隆

15、。這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含有一個(gè)基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫(kù)。如果這個(gè)文庫(kù)足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫(kù)。用噬菌體建立DNADNA文庫(kù)示意圖其他載體：bacterial artificial chromosome (BAC) p1 artificial chromosome (PAC)yeast artificial chromosome (PAC)5.3 RNA基本操作技術(shù) 總RNA的提取 mRNA的純化 cDNA的合成 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 基

16、因文庫(kù)的篩選5.3.1 5.3.1 總總RNARNA的提取的提取 RNA易遭降解，實(shí)驗(yàn)要求較嚴(yán)格?？俁NA提取的方法有多種，主要有LiCl法、CTAB法、異硫氰酸胍法（TriZol）。 異硫氰酸胍法（TriZol）原理： TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層（無(wú)色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。5.3.2 mRNA5.3.2

17、 mRNA的純化的純化5.3.3 cDNA5.3.3 cDNA的合成的合成cDNA (complementary DNA) 5.3.4 cDNA5.3.4 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與 某 種 載 體 連 接 而 形 成 的 克 隆 的 集 合 。 經(jīng) 典 c D N A 文 庫(kù) 構(gòu) 建 的 基 本 原 理 是 用 Oligo(dT) 作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的 cDNA 加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫(kù)。 步驟：在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成接頭的加

18、入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴(kuò)增 cDNA 文庫(kù)、對(duì)建立的 cDNA 文庫(kù)進(jìn)行鑒定。這里強(qiáng)調(diào)的是對(duì)載體的選擇，常規(guī)用的是 噬菌體，這是因?yàn)?DNA 兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來(lái)構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。5.3.4 5.3.4 基因文庫(kù)的篩選基因文庫(kù)的篩選 基因文庫(kù)的篩選是指通過(guò)某種特殊方法從基因文庫(kù)中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過(guò)程。篩選方法有很多種，常用的有： 核酸雜交法 PCR篩選法 免疫篩選法核酸雜交法PCR篩選后稀釋PCR篩選后稀釋PCR篩選后稀釋PCR篩選法免疫篩選法5.4 SNP的理論與應(yīng)用人類基因組

19、由30億個(gè)核苷酸組成，它們攜帶著人類的遺傳信息并決定人體的生理特性。人類基因組序列的0.1%-0.2%在人種、人群和個(gè)體之間存在DNA 序列的差異，即單核苷酸多態(tài)性（SNP, single nucleotide polymorphism）。許多的這些單核苷酸多態(tài)性可引起不同的遺傳性狀，即遺傳的多態(tài)性（polymorphism），如ABO血型位點(diǎn)標(biāo)記，白細(xì) 胞HLA位點(diǎn)標(biāo)記和個(gè)體藥物代謝差異等。了解這些DNA序列的差異和單核苷酸多態(tài)性以及這些差異所表現(xiàn)的意義將對(duì)疾病的預(yù)測(cè)、診斷、預(yù)后和預(yù)防帶來(lái)革命性 的變化。 5.5 基因克隆技術(shù) 在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上，人們用克隆（clone）表示由具有

20、相同基因型的同一物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體。從同一受精卵分裂而來(lái)的單卵雙生子（monozygotic twins）便是屬于同一克隆。 在細(xì)胞水平上，克隆一詞是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitor cell）分裂而來(lái)的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。 在分子生物學(xué)上，人們把將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復(fù)制這種過(guò)程稱為克隆。5.5.1 RACE5.5.1 RACE技術(shù)技術(shù) RACE（rapid amplification of cDNA ends, cDNA末端快速擴(kuò)增）是一種獲得轉(zhuǎn)錄本5或3未知序列的方法。它根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)基因片段內(nèi)部特異引物， 用cDNA進(jìn)

21、行PCR擴(kuò)增得到目的序列。用于擴(kuò)增5端的方法稱為5RACE，用于擴(kuò)增3端的稱為3RACE。 已知cDNA序列可來(lái)自序列表達(dá)標(biāo)簽、減法cDNA庫(kù)、差法顯示和基因文庫(kù)篩選。5.5.2 5.5.2 應(yīng)用應(yīng)用cDNAcDNA差示法分析克隆基因差示法分析克隆基因 cDNA差示分析法（representational difference analysis, RAD）充分發(fā)揮了PCR能以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板，僅以線形形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過(guò)降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片斷。加去磷酸化的接頭混合、變性、復(fù)性填平粘性末端指數(shù)擴(kuò)增線性擴(kuò)增無(wú)擴(kuò)增以 為引物的PC

22、R試驗(yàn)材料Tester探針材料Driver加去磷酸化的接頭混合、變性、復(fù)性填平粘性末端指數(shù)擴(kuò)增線性擴(kuò)增無(wú)擴(kuò)增以 為引物的PCR試驗(yàn)材料Tester探針材料Driver5.5.3 Gateway5.5.3 Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)大規(guī)模克隆技術(shù)5.5.4 5.5.4 基因的位圖克隆法基因的位圖克隆法l 所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可通過(guò)該法克隆得到。首先，通過(guò)構(gòu)建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。l 通過(guò)對(duì)許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記，通過(guò)染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)標(biāo)記

23、之間的基因片段克隆并分離出來(lái)。5.6 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）一詞，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組學(xué)（genomics）兩個(gè)詞的組合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)組本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。 5.6.1 5.6.1 雙向電泳技術(shù)雙向電泳技術(shù) 雙向電泳（ 2-DE ）由OFarrells于1975年首次建立并成功地分離約1 000個(gè)E.coli蛋白

24、，并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的，而是隨環(huán)境而變化。 雙向電泳原理簡(jiǎn)明，第一向進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離，至各自的等電點(diǎn)；隨后，再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。pH3pH10IEFSDS Biochem. J. (2004) 378 (929937)5.6.2 5.6.2 蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法 分子生物學(xué)中最常用的蛋白質(zhì)技術(shù)可能是蛋白質(zhì)印跡法（Western bloting），又稱免疫印跡法（immunobloting）。 原理：經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體

25、上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。延伸：Southern印跡法（Southern blot）由英國(guó)人Edwin Mellor Southern創(chuàng)建。 DNA-DNA雜交。Northern 印跡法（Northern blot）：將RNA固定在硝酸纖維素膜上后,用互補(bǔ)的,具有放射性標(biāo)記的RNA或DNA探針與其雜交。Western印跡法（Western blot）：將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上后，用特異性抗體進(jìn)行雜交。5.6.3 5.6.3 蛋白質(zhì)的質(zhì)

26、譜分析技術(shù)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù) 質(zhì)譜由于很高的靈敏度、準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學(xué)家的廣泛注意。在質(zhì)譜測(cè)序中，靈敏度及準(zhǔn)確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對(duì)象進(jìn)行的。近年來(lái)隨著電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionisation，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測(cè)限下降到fmol級(jí)別，可測(cè)定分子量范圍則高達(dá)100000Da，目前基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI TOF MS)已成為測(cè)定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級(jí)結(jié)構(gòu)的有效工具，也是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中重大課題蛋白質(zhì)組研究所必不可缺的關(guān)鍵技術(shù)之一 。 雙酶切雙酶切普通的瓊脂糖凝膠電泳