第九章吸光光度法

1、章序名稱第九章吸光光度法周次第15 周至第16 周授課時(shí)間2009年11月14日至2009年11月28日教 學(xué) 目 的 要 求1 .理解朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式及意義；2 .掌握摩爾吸光系數(shù)的意義和計(jì)算；3 .了解選擇顯色劑的原理及及影響顯色反應(yīng)的因素；4 .初步掌握分光光度法的基本原理應(yīng)用；5 .掌握光度法的基本原理，了解光度分析條件的控制，分光光度法的 應(yīng)用范圍。教 學(xué) 重 占 八、1、方法特點(diǎn)：光的性質(zhì)和選擇性的吸收。2、吸光光度法的基本原理：朗伯比爾分離定律；偏離比爾定律的原因。4、分光光度計(jì)的構(gòu)造及應(yīng)用。5、顯色反應(yīng)及影響因素。6、光度測(cè)量誤差及條件的選擇。7、吸光光度法的應(yīng)用。教

2、 學(xué) 難 占 八、1 .吸光光度法的基本原理：朗伯比爾分離定律；偏離比爾定律的原因。2 .光度測(cè)量誤差及條件的選擇。教學(xué)場(chǎng)所 環(huán)境教室授課 方式課堂講授（，）；實(shí)驗(yàn)（）；實(shí)踐（）；雙語(yǔ)（）課時(shí)分配8學(xué)時(shí)教學(xué) 方法講授、討論教學(xué) 手段網(wǎng)絡(luò)教學(xué)（）；多媒體（V ）教學(xué) 用具電子投影儀教學(xué)內(nèi)容提要備注§9-1光的性質(zhì)和物質(zhì)對(duì)光的吸收一、 光的性質(zhì)二、物質(zhì)對(duì)光的吸收§9-2光吸收的基本規(guī)律一、朗伯-比爾定律二、偏離朗伯-比爾定律的因素§9-3分光光度計(jì)的構(gòu)造一、分光光度計(jì)的主要部件二、分光光度計(jì)§9-4顯色反應(yīng)及其影響因素一、顯色反應(yīng)和顯色劑二、影響顯色反應(yīng)的因

3、素三、三元配合物顯色體系§9-5廣度測(cè)量誤差及其測(cè)量條件的選擇一、儀器測(cè)量誤差二、測(cè)量條件的選擇§9-6分光光度法的應(yīng)用一、多組分的同時(shí)測(cè)定二、差示分光光度計(jì)3、 酸和堿離解常數(shù)的測(cè)定4、 溶液中配合物組成的測(cè)定節(jié)序內(nèi)容學(xué)時(shí)第九章吸光光度分析法8學(xué)時(shí)弟干光的性質(zhì)和物質(zhì)對(duì)光的吸收1第二節(jié)光吸收的基本規(guī)律1日第二節(jié)分光光度計(jì)的構(gòu)造1程第四節(jié)顯色反應(yīng)及其影響因素1及第五節(jié)廣度測(cè)量誤差及其測(cè)量條件的選擇課用八P分光光度法的應(yīng)用2時(shí)第七節(jié)分第節(jié)習(xí)題課2配第節(jié)第節(jié)第節(jié)第節(jié)第節(jié)1.有50.0mL含Cd2+5.0四 的溶液，用10.0mL二苯硫腺-氯仿溶液萃 ?。ㄝ腿÷?100%）后，在波

4、長(zhǎng)為 518nm 處，用1cm 比色皿測(cè)量得T=44.5% 。求吸收系數(shù)a、摩爾吸收系數(shù)k和桑德爾靈敏度S各為多少？2.鋼樣0.500g溶解后在容量瓶中配成100mL溶液。分取20.00mL該試液于50mL容量瓶中，將其中的Mn 2+氧化成MnO 4-后，稀釋定容。然后在入=525nm 處，用b=2cm的比色皿測(cè)得A=0.60 。已k 525=2.3 X103L mol-1 cm-1 ,計(jì)算鋼樣中Mn的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（% ）。3.某一光度計(jì)的讀數(shù)誤差為 0.005,當(dāng)測(cè)量的透射比分別為9.5%及90%時(shí)，計(jì)算濃度測(cè)量的相對(duì)誤差各為多少？1 .與化學(xué)分析法相比，吸光光度法的主要特點(diǎn)是什么？討論練習(xí)2

5、.簡(jiǎn)述朗伯-比爾定律成立的前提條件及物理意義，寫出其數(shù)學(xué)表達(dá)式。3 .吸收光譜曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)際意義是什么？如何繪制這兩種曲線？4 .為了提高測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確度，應(yīng)該從哪些方面選擇或控制光度測(cè)量的條件 ？5 .簡(jiǎn)述用摩爾比法測(cè)定絡(luò)合物絡(luò)合比的原理。拓展學(xué)習(xí)吸光光度法的應(yīng)用中學(xué)習(xí)絡(luò)合物組成和酸堿解離常數(shù)的測(cè)定（1）絡(luò)合物組成：摩爾比法、等摩爾連續(xù)變化法。(2) 酸堿解離常數(shù)：PKa = PH + lg A -A b-/ A HB-A課 程 作 業(yè)P.301,15, 17,P.302,18 , 19, 21, 24, 25完成方式書面版（，）電子版（）P.303 ,28, 29.提交時(shí)間課程宓成必

6、 讀 書 目1 .武漢大學(xué)化學(xué)系編，儀器分析，北京：高等教育出版社，2 .朱明華編，儀器分析，北京：高等教育出版社，1994.2001.學(xué)生學(xué)習(xí)Mm監(jiān)控從完成作業(yè)情況看，本章內(nèi)容部分掌握較好，有少數(shù)學(xué)生對(duì)光度計(jì)算掌握的不夠好。評(píng)價(jià)教學(xué)后記本章內(nèi)容是儀器分析的基礎(chǔ)，打好基礎(chǔ)很重要，在講課中突出吸光光度 法的基本原理，朗伯比爾分離定律的學(xué)習(xí)；吸光光度條件的選擇，可配合實(shí) 驗(yàn)課加深學(xué)生的理解和掌握。第九章吸光光度法本章介紹的吸光光度法是一種儀器分析方法（其中目視比色法不必用儀器）。一種方法能用來(lái)進(jìn)行物質(zhì)的定量分析，測(cè)量的物理量與被測(cè)組分的濃度之間必須存在確定的定量的關(guān)系。這是定量測(cè)量方法的理論基礎(chǔ)。

7、另一方面，還需要考慮儀器設(shè)備的設(shè)計(jì)和測(cè)試條件的選擇，以保證方法符合定量基本關(guān)系式，并保證有較高的準(zhǔn)確度和可操作性。利用光信號(hào)測(cè)定物質(zhì)含量的方法很多， 基于物質(zhì)對(duì)光具有選擇吸收的特性而建立起來(lái)的分析方法，稱為吸光光度法。根據(jù)產(chǎn)生光吸收的質(zhì)點(diǎn)不同，又可分為分子吸收光譜法和原子吸收光譜法。本章中討論的紫外-可見吸光光度法是分子吸收光譜法的一種。9.1概述9.1.1 光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，按照波長(zhǎng)（或頻率）排列，可得到電磁波譜圖：IV nm lUnm lU'nm lu nm U. J cm IU citiLuZm!府線71射線紅外先光具有波粒二象性，一定波長(zhǎng)的光具有一定的能量，波長(zhǎng)越長(zhǎng)（

8、頻率越低），光量子的能量越低。具有相同能量（相同波長(zhǎng)）的光為單色光，由不同能量 （不同波長(zhǎng)）的光組合在一起的稱為復(fù)合光。若兩種不同 顏色的單色光按一定的強(qiáng)度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補(bǔ)光，這種現(xiàn)象稱為光的互補(bǔ)。白光是復(fù)合光，讓一束白光通過(guò)分光元件，它將分解成紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等各種顏色的光。即可見光譜。不同顏色的可見光波長(zhǎng)及其互補(bǔ)光luni400-450案450-4SQ爆筌490-500steMQ-5I0黃維0ft£10-650與501Go紅9.1.2 光與物質(zhì)的作用電子能級(jí) A =1-20 e35Q 44（1 有。5腳 554 0H）審51 ?（ *Jun不

9、同染料在已辱磨港中的啜收無(wú)酒后:丸整g中酸3球相當(dāng)光照射到物質(zhì)上時(shí)，會(huì)產(chǎn)生反射、散射、吸收或透射現(xiàn)象，若被照射的物質(zhì)為溶液，光的散射可以忽略。當(dāng)一束白光照射某一有色溶液時(shí)， 一些波長(zhǎng)的光被溶液吸收，另一些波長(zhǎng)的光則透過(guò)，溶液的顏色由透射光的波 長(zhǎng)所決定。吸收光與透射光互為補(bǔ)色光。 如硫酸銅溶液吸收白光中的黃色光而呈現(xiàn)藍(lán)色；高鎰酸鉀溶液吸收黃綠色的光而呈紫紅色。分子、原子和離子，都具有不連續(xù)的量子化能級(jí)，在一般情況下 r 分子處于最低能態(tài)（基態(tài)）。當(dāng)入射光照射物質(zhì)時(shí)，分子會(huì)選擇性地吸收了某些波長(zhǎng)的光，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），其能級(jí)差E激發(fā) 態(tài)一E基態(tài)與選擇性吸收的光子能量 h的關(guān)系為：一

10、h = E激發(fā)態(tài)E基態(tài)分子運(yùn)動(dòng)包括分子的轉(zhuǎn)動(dòng)、分子的振動(dòng)和電子的運(yùn)動(dòng)。分子轉(zhuǎn)動(dòng)、 振動(dòng)能級(jí)間隔一般小于lev,其光譜處于紅外和遠(yuǎn)紅外區(qū)。電子能級(jí)間的能量差一般為 120ev,由電子能級(jí)躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜位于 紫外及可見光區(qū)，其實(shí)驗(yàn)方法為比色法和可見、紫外吸光光度法。9.1.3 定性分析及定量分析的基礎(chǔ)1,定性分析基礎(chǔ)吸收光譜取決于分子的結(jié)構(gòu)，以及分子軌道上電子的性質(zhì)， 不同的物質(zhì)具有不同的吸收光譜，因此，吸收光譜可提供定性分 析的信息。2,定量分析基礎(chǔ)對(duì)同一物質(zhì)而言，濃度不同，對(duì)特定波長(zhǎng)光的吸收強(qiáng)度不同, 因此，吸收強(qiáng)度可提供定量分析的信息。從不同濃度的高鎰酸鉀溶液的吸收光譜圖可知，在波長(zhǎng)

11、535nm處的吸光強(qiáng)度與濃度間存在定量的關(guān)系，可由此進(jìn)行定量 分析。不同濃度時(shí)的吸收曲線對(duì)比9.1.4 吸收定律1,朗伯一比爾定律一束平行單色光通過(guò)任何均勻、非散射的固體、液體或氣體介質(zhì)時(shí)，一部分被吸收，一部分透過(guò)介質(zhì)，一部分被器皿的表面反射。設(shè)入射光強(qiáng)度為Io',吸收光強(qiáng)度為Ia ,透過(guò)光強(qiáng)度為It ,反射光強(qiáng)度為Ir。則1 01 a 111 r在吸光光度法中，通常將試液和空白溶液分別置于同樣材質(zhì)及同樣厚度的吸收皿中，因此反射光的強(qiáng)度基本相同，其影響可以相互抵消，故可以忽略反射光的影響，可得到下式：Io Ia It。即光強(qiáng)為I0的入射光通過(guò)試液皿后，一部分光被吸收，一部分光被透射。I

12、t與I。之比稱為透光率或透光度 T, T = It/Io吸光物質(zhì)對(duì)光的吸收程度，還常用吸光度A表示：A= - lgT =lg (Io/It)A與溶液濃度C實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)一束平行單色光垂直照射某一均勻的非散射吸光物質(zhì)溶液時(shí)，溶液的吸光度 和液層厚度b的乘積成正比，此即朗伯比爾(Lambert Beer)定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為:A lg I-0- KbcIt2 .摩爾吸收系數(shù)和桑德爾靈敏度當(dāng)溶液濃度以 mol/L為單位時(shí)，液層厚度以 cm為單位時(shí)，K常用 代替， 稱為摩爾吸收系數(shù)，其單位為 L .mol-1.cm-1。此時(shí)朗伯-比爾定律可寫為：A= bc摩爾吸收系數(shù) 是吸光物質(zhì)在給定波長(zhǎng)和溶劑下的特征

13、常數(shù)，數(shù)值上等于1mol/L吸光物質(zhì)溶液和液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度，它表示吸光物質(zhì)對(duì)指定頻率的光子的吸收本領(lǐng)。越大，表示該物質(zhì)對(duì)某波長(zhǎng)光的吸收能力越強(qiáng)，該測(cè)定方法的靈敏度也就越高。一般認(rèn)為，<104,則方法的靈敏度較低；在1045 104時(shí)，方法的靈敏度為中等； 在5 104105時(shí)，靈敏度高；>105,屬超高靈敏度。還可用桑德爾靈敏度(靈敏度指數(shù))S表示方法的靈敏度，Sandell對(duì)S的定義是：在一定的波長(zhǎng)下，測(cè)得的吸光度A=0.001時(shí)，1 cm2截面積內(nèi)所含的吸光物質(zhì)的量，其單位為g/cm2。S與的關(guān)系的推導(dǎo)：A= 0.001 = bc, bc= 0.001/b為吸收池

14、的厚度，單位為cm, c的單位為mol/L , bc乘以待測(cè)物的摩爾質(zhì)量 M (g/mol),就是單位截面積內(nèi)待測(cè)物的質(zhì)量，即0.001 M 103M(g/cm2)。S=b(cm) c(mol/dm 3) M (g/mol)106 g/g =例1.某試液用2cm比色皿測(cè)量時(shí)，T=60%若改用1cm或3cm比色皿，T及A分別等于多少？解：設(shè)某試液用 2cm比色皿測(cè)量時(shí)的吸光度為 A,用1cm和3cm比色皿測(cè)得的吸光度為 A和A2。因?yàn)锳與T 之間的關(guān)系是 A= -lgT,所以Ao=0.22。根據(jù)朗伯-比爾定律可知：A = e bc,所以A =A)b1/bo =0.11,=10=0.78.A3A2

15、=Ab2/b。=0.33, T3=10=0.47.2cm,在波長(zhǎng)508nm處測(cè)例2.已知含F(xiàn)e2+濃度為500g/L的溶液，用鄰二氮菲比色測(cè)定鐵，比色皿厚度為得吸光度A=0.19,計(jì)算摩爾吸收系數(shù)。解:cFe500 10 66-18.9 10 mol /L55.850.19bc 2 8.9 10 641.1 10 (L mol1cm1)例3.雙硫腺顯色法測(cè)定鉛的=6.8 104L解：S= M/ =207/6.8 104=0.0030( g/cm2) 1 mol1cm ,求桑德爾靈敏度So9.2目視比色法與分光光度法朗伯比爾定律是光度法定量分析的基礎(chǔ)?？梢酝ㄟ^(guò)儀器測(cè)吸光度，然后通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)的比較法

16、或標(biāo)準(zhǔn)曲線法 得到被測(cè)組分的濃度。也可通過(guò)肉眼直接觀測(cè)顏色的深淺判斷組分含量。9.2.1 目視比色法目視比色法是用眼睛觀察、比較溶液顏色深度以確定物質(zhì)含量的方法。一般采用標(biāo)準(zhǔn)系列法。即在一套等體積的比色管中配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按同樣的方法配置待測(cè)溶液，待顯色反應(yīng)達(dá)平衡后， 從管口垂直向下觀察(對(duì)于高含量的試樣，也可從管側(cè)面觀察)，比較待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)系列中哪一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色相同，便表明二者濃度相等。 如果待測(cè)試液的顏色介于某相鄰兩標(biāo)準(zhǔn)溶液之間，則待測(cè)試樣的含量可取兩標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的中間值。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，適宜于野外或現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定，可在復(fù)合光-白光下進(jìn)行測(cè)定，某些不符合朗伯 -比爾定律的

17、顯色反應(yīng)，仍可用該法進(jìn)行測(cè)定。主要缺點(diǎn)是準(zhǔn)確度不高，標(biāo)準(zhǔn)系列不能久存，需要在測(cè)定時(shí)臨時(shí)配制。目視出色法試樣 標(biāo)準(zhǔn)系列：分別取0、L0. 2.0. 3 0. 4 0.5,。011.的標(biāo)準(zhǔn)溶液(5,卬君0£ >9.2.2 分光光度法1 .分光光度計(jì)分光光度計(jì)按工作波長(zhǎng)范圍分類，可分為紫外-可見分光光度計(jì)和可見光分光光度計(jì)。按照光路的設(shè)計(jì)方式可分為單光束、雙光束和單波長(zhǎng)、雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)等。盡管分光光度計(jì)的種類和型號(hào)繁多，但它們都是以下基 本部件組成的。(1)分光光度計(jì)的主要組成部件：光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和顯示裝置。光源 L |單色gg |一|吸帔也|一 檢測(cè)第 L 顯示系統(tǒng)

18、 紫外-可見第t光度計(jì)基核s構(gòu)光源：(Light source)：光源的作用是提供所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，光源要有足夠的光強(qiáng)度，能量分布均 勻，穩(wěn)定。電源電壓的微小波動(dòng)會(huì)引起燈光強(qiáng)度的很大變化，因此需要用穩(wěn)壓電源。可見分光光度計(jì)的光源多屬 熱光源，如鴇燈、碘鴇燈等，鴇燈發(fā)射光譜波長(zhǎng)范圍為4001000nm,在可見和近紅外區(qū)。碘鴇燈發(fā)射光譜波長(zhǎng)范圍3202500 nm。紫外區(qū)使用氫燈或笊燈 (180375 nm)。單色器：(monochromator):將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。比色計(jì)的單色器一般是濾光片，分光光度計(jì)的單色器通常由棱鏡或光柵等色散元件及狹縫和透鏡等組成?？梢姺止夤?/p>

19、度計(jì)常用玻璃棱鏡，玻璃棱鏡適合的波長(zhǎng)為3503200 nm；紫外-可見分光光度計(jì)常用石英棱鏡，這是由于玻璃對(duì)紫外光有較強(qiáng)吸收的緣故，石英棱鏡適合的波長(zhǎng)為 1854000 nm。光柵是利用光的衍射與干涉作用制成的色散元件，它具有適用波長(zhǎng)范 圍寬、分辨性能好和色散均勻等優(yōu)點(diǎn)。吸收池也稱比色皿 (coloritrough):吸收池用來(lái)盛放試液。按制作材料可分為石英和玻璃吸收池，前者用于 紫外和可見區(qū)，后者僅用于可見區(qū)。檢測(cè)器(detector)：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)成電流訊號(hào)。常用的有光電池，光電管，光電倍增管、光電二極 管、光導(dǎo)攝象管等。顯示裝置：檢流計(jì)、微安表、數(shù)字顯示記錄儀等。(2)幾種不同

20、類型分光光度計(jì)單光束分光光度計(jì) (single beam spectrophotometer),如721型分光光度計(jì)為可見光單光束分光光度計(jì)的類型。 儀器光路示意圖如下。57 rt1313721型分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)示意圖源；2方一聚光透3-色散透鏡：1-在直原；3, 12-保護(hù)藪碗;&宗雁；7-反射鏡；8-光橘；1Q-0R收池；】"光匚k 13-光電亙雙波長(zhǎng)分光光度計(jì) (double wavelength spectrophotometer)、雙光束分光光度計(jì) (double beam spectrophotometer) 或雙波長(zhǎng)一雙光束分光光度計(jì)：雙光束分光光度計(jì)是將單色

21、光分成兩束，一束通過(guò)參比池，另一束通過(guò)樣品池，經(jīng)一次測(cè)量，檢測(cè)器直接得到的是樣品池與參比池吸光度的差，即AA樣 A空白。雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)是將同一光源發(fā)出的光分成兩束，以一定的頻率交替照射同一吸收池，經(jīng)光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，由指示器顯示出兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度之差，即。利用雙波長(zhǎng)光度計(jì)可消除干擾組分或混濁試樣背景對(duì)測(cè)定的影響，往往可提高方法的靈敏度和選擇性。該類型儀器與單光束儀器的比較如下圖。分光光度計(jì)的類型QT單色寄L呈£器發(fā)L欠叁勺"-午-幽L 單光束雙汽束T 任 需 9曼收囂雙波長(zhǎng)光學(xué)多通道分光光度計(jì) (optical multichannel spectrophoto

22、meter )是20世紀(jì)80年代問世的產(chǎn)品，是一種具有全新光路系統(tǒng)的儀器。由鴇燈或笊燈發(fā)射的復(fù)合光先通過(guò)樣品池后再經(jīng)全息光柵色散，色散后的單色光由光二極管陣列中的光二極管接收，一個(gè)光二極管陣列一般能容納數(shù)百個(gè)光二極管，可覆蓋190900nm波長(zhǎng)范圍。全部光纖光琴計(jì)卡)歷一浦小牙 42(k9INhiin選時(shí)光存波長(zhǎng)同時(shí)被檢測(cè)，所以響應(yīng)非常快。這種類型光度計(jì)特別適合進(jìn)行快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究及多組分混合物的分析在環(huán)境及過(guò)程分析中也非常重要，并可用作高效液相色譜儀和毛細(xì)管電泳儀的檢測(cè)囂。光導(dǎo)纖維探頭式分光光度計(jì)（optical fiber probe-type spectrophotometer）:探頭

23、是由兩根相互隔離的光導(dǎo)纖維組成，鴇燈發(fā)射的光由其中一根光纖傳導(dǎo)至試樣溶液，再經(jīng)鍍鋁反射鏡反射后，由另一根光纖傳導(dǎo)，通過(guò)干涉濾 光片后，由光敏器件接收為電信號(hào)。此類儀器不需吸收池，直接將探頭插入試樣溶液中，在原位進(jìn)行測(cè)定。這種 類型光度計(jì)常用于環(huán)境和過(guò)程監(jiān)測(cè)。2 .分光光度法根據(jù)朗伯-比耳定律，當(dāng)吸光物質(zhì)光程一定時(shí)，吸光度與吸光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系，因此可以根據(jù)直接比 較法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定試樣溶液中待測(cè)物質(zhì)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線法是先用純?cè)噭┗蚺c被測(cè)試樣有相似組分的物質(zhì)配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不含試樣的空白溶液作參比，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制吸光度一濃度曲線，如下圖所示，此曲線稱標(biāo)準(zhǔn)曲線或工作曲線

24、。然后在 同樣條件下測(cè)定試樣溶液的吸光度，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出被測(cè)元素的含量。需要注意的是：在某些情況下，Ac并不嚴(yán)格遵守比爾定律，這種現(xiàn)象稱為偏離朗伯-比耳定律。引起偏離朗 伯-比耳定律的主要原因在后面的章節(jié)中討論。一般說(shuō)來(lái)，朗伯-比耳定律只適用于稀溶液。9.3 分光光度法的設(shè)計(jì)9.3.1 顯色反應(yīng)和顯色劑理論上講，所有對(duì)紫外光、可見光有吸收的有機(jī)物、無(wú)機(jī)物都可以用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測(cè)定。但在 實(shí)際工作中，通常使弱吸收物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成具有強(qiáng)吸收性質(zhì)的吸光物質(zhì)，以提高光度測(cè)量的準(zhǔn)確性和分析方法的靈敏度。此反應(yīng)稱為顯色反應(yīng)，所用的試劑稱為顯色劑。1 .顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)一般應(yīng)滿足以下要求：

25、（1）形成的吸光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)大，方法靈敏。（2）選擇性好，干擾少或干擾容易消除；顯色劑在測(cè)量波長(zhǎng)處的無(wú)吸收或光吸收小，即測(cè)量的吸光物質(zhì)與顯色劑的顏色差別要大。一般MR R要求吸光物質(zhì)與顯色劑的最大吸收波長(zhǎng)相關(guān)較遠(yuǎn)。max max 60nm，式中R為顯色劑，MR為待測(cè)物質(zhì)與顯色劑形成的產(chǎn)物。通常將稱作顯色反應(yīng)的對(duì)比度。（3）顯色反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，在測(cè)量過(guò)程中吸光度基本保持恒定。（4）顯色反應(yīng)的條件便于控制。2 .顯色劑顯色劑的種類很多，但無(wú)機(jī)顯色劑在光度分析中應(yīng)用不多，主要因?yàn)殪`敏度和選擇性不高。例如鋁酸俊可作為測(cè)硅、磷和鋰的顯色劑，雙氧水可作為鈦的顯色劑。應(yīng)用較多的是有機(jī)顯色劑。有機(jī)顯色劑及

26、其產(chǎn)物的顏色與它們的分子結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。有機(jī)顯色劑分子中一般都含有生色團(tuán)（chromophore）和助色團(tuán)（auxochrome）。分子中能吸收紫外或可見光的基團(tuán)稱為生色團(tuán)，生色團(tuán)中含有不飽和鍵的基團(tuán)，如偶氮基、對(duì)醍基和談基等。這此基團(tuán)中的電子被激發(fā)時(shí)所需的能量較小，可以吸收可見光而表現(xiàn)出顏色。助色團(tuán)是含有非鍵電子對(duì)的基團(tuán)。如氨基、羥基和鹵代基等。它們本身并不吸收大于200nm的光，但它*們可與生色團(tuán)中電子相互作用，形成非鍵電子與電子的共軻，即 p-共軻，降低了躍遷的能量，引起吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，使吸收強(qiáng)度增加。3 .顯色條件的選擇顯色條件包括：溶液酸度，顯色劑用量，試劑加入順序，顯色時(shí)間，

27、顯色溫度，有機(jī)絡(luò)合物的穩(wěn)定性及共存 離子的干擾等。(1)酸度的選擇溶液的酸度會(huì)影響顯色劑的平衡濃度和顏色，也會(huì)影響被測(cè)金屬離子的存在狀態(tài)和影響絡(luò)合物的形成反應(yīng)， 是顯色反應(yīng)重要的條件之一。合適的酸度需通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。在實(shí)際工作中，通常是固定其他實(shí)驗(yàn)條件，變化反應(yīng)體系的pH值，測(cè)量體系的吸光度A,作ApH曲線，從實(shí)驗(yàn)曲線中選擇 A值大，且隨pH值變化平緩的pH值范圍作為酸度控制范圍。(2)顯色劑的用量試液吸光度與顯色劑濃度的關(guān)系為使顯色反應(yīng)進(jìn)行完全，需加入過(guò)量的顯色劑。但有些顯色反應(yīng)，顯色劑加入太多，反而會(huì)引起副反應(yīng)，對(duì)測(cè)定不利。顯色劑濃度與吸光度的關(guān)系有下列三種情況，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定顯色劑的

28、用量。(3)顯色反應(yīng)時(shí)間有些顯色反應(yīng)瞬間完成，溶液顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持不變；有些顯色反應(yīng)雖能迅速完成，但有色絡(luò)合物的顏色很快開始褪色；有些顯色反應(yīng)進(jìn)行緩慢，溶液顏色需經(jīng)一段時(shí)間后才穩(wěn)定。確定顯色反應(yīng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)方法，配制好顯色溶液，每隔一定時(shí)間測(cè)量一次吸光度，制作吸光度-時(shí)間曲線,以確定適宜的顯色時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間。(4)顯色反應(yīng)溫度顯色反應(yīng)大多在室溫下進(jìn)行。但是，有些顯色反應(yīng)必需加熱至一定溫度完成。但要注意一些有色化合物在高溫時(shí)分解。(5 )溶劑某些有機(jī)溶劑能降低有色化合物的解離度，提高顯色反應(yīng)的靈敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮，可使顏色加深。還可能提高顯色反應(yīng)的速

29、率，影響有色絡(luò)合物的溶解度和組成等。(6)干擾及其消除方法試樣中存在干擾物質(zhì)會(huì)影響被測(cè)組分的測(cè)定，可采取以下一些措施。a.控制溶液酸度b.加入掩蔽劑c.利用氧化還原反應(yīng)，改變干擾離子的價(jià)態(tài)d.利用校正系數(shù)e.用參比溶液消除顯色劑和某些共存有色離子的干擾。f.選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)g.當(dāng)溶液中存在有消耗顯色劑的干擾離子時(shí)，可通過(guò)增加顯色劑的用量來(lái)消除干擾。h.預(yù)先分離的方法。9.3.2 測(cè)量波長(zhǎng)的選擇為了使測(cè)定結(jié)果有較高的靈敏度，應(yīng)選擇被測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)的光作為入射光，這稱為最大吸收原則選用這種波長(zhǎng)的光進(jìn)行分析，不僅靈敏度高，且 非單色光引起的對(duì)朗伯-比爾定律的偏離。但是，在最大吸收波長(zhǎng)處有其他吸光

30、物質(zhì)干 據(jù)“吸收最大，干擾最小”的原則來(lái)選擇入射光 的光度法測(cè)鋼中饃，絡(luò)合物丁二酮的饃的最大吸 但試樣中大量的鐵用酒石酸鈉掩蔽后，在470 nm干擾饃的測(cè)定。為避免鐵的干擾，可以選擇波長(zhǎng) 雖然測(cè)饃的靈敏度有所降低，但酒石酸鐵不干擾從儀器測(cè)量誤差的角度來(lái)看，為使測(cè)量結(jié)果度，一般應(yīng)控制標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測(cè)試液的吸光度在or420 頌煙 540 5 削 <20 66U 7MX /fun能減少或消除由擾測(cè)定時(shí)，則應(yīng)根 波長(zhǎng)。例如丁二酮 收波長(zhǎng)為470 nm, 處也有一定吸收， 520 nm進(jìn)行測(cè)定， 饃的測(cè)定。得到較高的準(zhǔn)確 0.20.8范圍內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)控制溶液的濃度或選擇不同厚度的吸收池來(lái)達(dá)到此目的。

31、9.3.3 參比溶液的選擇扣除干擾的利用參比溶液來(lái)調(diào)節(jié)儀器的零點(diǎn)，可消除由吸收池壁及溶劑對(duì)入射光的反射和吸收帶來(lái)的誤差,影響。參比溶液選擇原則：a試液及顯色劑均無(wú)色，蒸儲(chǔ)水作參比溶液。b顯色劑為無(wú)色，被測(cè)試液中存在其他有色離子，用不加顯色劑的被測(cè)試液作參比溶液。c顯色劑有顏色，可選擇不加試樣溶液的試劑空白作參比溶液。d顯色劑和試液均有顏色，可將一份試液加入適當(dāng)掩蔽劑，將被測(cè)組分掩蔽起來(lái)，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑及其他試劑均按試液測(cè)定方法加入，以此作為參比溶液，這樣就可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。e改變加入試劑的順序，使被測(cè)組分不發(fā)生顯色反應(yīng)，可以此溶液作為參比溶液消除干擾。9.4

32、誤差吸光光度法的準(zhǔn)確度較高。一般相對(duì)誤差25%。影響準(zhǔn)確度的主要因素有儀器測(cè)量誤差、非單色光引起的吸光定律的偏離與化學(xué)反應(yīng)平衡移動(dòng)引起的對(duì)吸光定律的偏離等。9.4.1 儀器測(cè)量誤差任何儀器都有一定的測(cè)量誤差，對(duì)于分光光度計(jì)來(lái)說(shuō)，這是由于光源不穩(wěn)定、電源波動(dòng)、讀數(shù)誤差等原因造成，屬隨機(jī)誤差。根據(jù)Lambert-Beer定律可以推導(dǎo)出測(cè)量誤差的影響因素。dAEr若在測(cè)定吸光度 A時(shí)產(chǎn)生了一個(gè)微小的絕對(duì)誤差dA,則測(cè)量A的相對(duì)誤差為：A，根據(jù)Lambert-Beer定律可得，A 1g Tbc,微分后得dTdA 0.434 bdcErT,所以可得：dAA0.434dT dcTlgT c。從Er對(duì)T的關(guān)

33、系圖可知，當(dāng) A=0.434時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小，在 A為0.20.7范圍內(nèi)，相對(duì)誤差較小，所以實(shí)際 測(cè)量時(shí)吸光值最好在此范圍內(nèi)。噥先發(fā)稼募與相對(duì)在是X tR ：LW*T M *3 VL4UJ1111111曲俵#山?jīng)财鱆1" .啜IIUIII叩lll|ll叫HI |H l|l叫|HI|I叫 11川"叩 1叩叫I呻叫m III 1*I，；E*部修Ximx1JJX± JxJ.J+«入透光率r4c友鼎小的Tffi：（JT- 1 乂 ）-% - 36,«% J。川4 一標(biāo)仆4,73%宜宜潮度日醫(yī)： T= 20 65%J = U70-n2fi7%和準(zhǔn)確度。紫外分光光度計(jì)所使用的單色器是能透