土壤過氧化氫酶、過氧化物酶、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶測定方法(共9頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上土壤酶活性測定方法土壤脲酶的測定方法（苯酚鈉次氯酸鈉比色法）一、原理 脲酶存在于大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水解的最終產(chǎn)物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效磷含量呈正相關(guān)。根際土壤脲酶活性較高，中性土壤脲酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。土壤中脲酶活性的測定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測定生成的氨量，也可以通過測定未水解的尿素量來求得。本方法以尿素為基質(zhì)，根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚-次氯酸鈉作用生成藍(lán)色的靛酚，來分析脲酶活性。二、試劑1）甲苯2）10%尿素：稱

2、取10g尿素，用水溶至100ml。3）PH6.7檸檬酸鹽緩沖液：184g檸檬酸和147.5g氫氧化鉀（KOH）溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7，用水稀釋定容至1000ml。4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀釋至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將A液、B液各20ml混合，用蒸餾水稀釋至100ml。5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液： 精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋

3、至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，再將此溶液稀釋10倍供用。三、操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別吸取稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)液0、1、3、5、7、9、11、13ml，移于50ml容量瓶中，然后補(bǔ)加蒸餾水至20ml。再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內(nèi)在分光光度計(jì)上于578nm波長處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取5g土樣于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。 15min后加10ml 10%尿素溶液和20ml PH 6.7檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在37恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后過濾，過濾后取3m

4、l濾液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內(nèi)在分光光度計(jì)與578nm波長處比色。注意事項(xiàng):1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無基質(zhì)對(duì)照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無土對(duì)照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計(jì)算： 脲酶活性以24小時(shí)后5g土壤中NH3N的毫克數(shù)表示土壤脲酶活性（Ure）。NH3N=（a樣品a無土a無基質(zhì)）×V×nm

5、式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N毫克數(shù)； a無土為無土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N毫克數(shù)； a無基質(zhì)為無基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N毫克數(shù)； V為顯色液體積；n為分取倍數(shù)，浸出液體積吸取濾液體積；m表示烘干土重土壤磷酸酶活性測定（磷酸苯二鈉比色法）一、原理測定磷酸酶主要根據(jù)酶促生成的有機(jī)基團(tuán)量或無機(jī)磷量計(jì)算磷酸酶活性。前一種通常稱為有有機(jī)基團(tuán)含量法，是目前較為常用的測定磷酸酶的方法，后一種稱為無機(jī)磷含量法。研究證明：磷酸酶有三種最適PH值：45、67、810。因此，測定酸性、中性和堿性土壤的磷酸酶，要提供相應(yīng)的PH緩沖液才能測出該土壤的磷酸酶最大活性。測定磷酸酶

6、常用的PH緩沖體系有乙酸鹽緩沖液（PH5.05.4）、檸檬酸鹽緩沖液（PH7.0）、三羥甲基氨基甲烷緩沖液（PH7.08.5）、和硼酸緩沖液（PH910）。磷酸酶測定時(shí)常用基質(zhì)有磷酸苯二鈉、酚酞磷酸鈉、甘油磷酸鈉等?，F(xiàn)介紹磷酸苯二鈉比色法。二、試劑1）緩沖液：a. 醋酸鹽緩沖液 PH 5.00.2mol/L 醋酸溶液: 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸鈉溶液 : 16.4g C2H3O2Na或27g C2H3O2Na.3H2O溶至1L?；蛘呷?4.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液稀釋至1L.b. 檸檬酸鹽緩沖液 PH

7、7.00.1mol/L 檸檬酸溶液： 19.2g C6H7O8溶至1L.0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液 ： 53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.取6.4ml 0.1mol/L 檸檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液稀釋至100ml.c. 硼酸鹽緩沖液 PH 9.60.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至1L.0.2mol/L NaOH溶液 8g NaOH溶至1L.取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀釋至200ml.2）0.5% 磷酸苯二鈉（用緩沖液配制）3）氯

8、代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑：稱取0.125g氯代二溴對(duì)苯醌亞胺，用10ml 95%乙醇溶解，貯于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。4）甲苯5）0.3%硫酸鋁溶液6）酚標(biāo)準(zhǔn)溶液 酚原液：取1g重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至1L，存于棕色瓶中。 酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液稀釋至1L。7）PH9.4硼酸緩沖液 0.2 mol/L硼酸：12.37g硼酸加水溶解稀釋至1000ml 0.05 mol/L硼砂：19.07g硼砂加水溶解稀釋至1000ml取800ml硼砂溶液加200ml硼酸溶液混合即為PH9.4硼酸緩沖液。三、操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取0、1、3、5、7、9

9、、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml PH9.4硼酸緩沖液和4滴氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度。30min后，在分光光度計(jì)上660nm處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱2g土樣置于200ml三角瓶中，加5滴甲苯，輕搖15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二鈉（酸性磷酸酶用乙酸鹽緩沖液；中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液；堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液），仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱，37下培養(yǎng)24h。然后在培養(yǎng)液加入40ml 0.3%硫酸鋁溶液并過濾。吸取3ml濾液于50ml容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色。用硼酸緩沖液時(shí)，呈現(xiàn)藍(lán)色，于分光

10、光度計(jì)上660nm處比色。注意事項(xiàng):1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無基質(zhì)對(duì)照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無土對(duì)照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計(jì)算 以24h后1g土壤中釋放出的酚的質(zhì)量（mg）表示磷酸酶活性。 磷酸酶活性=（a樣品a無土a無基質(zhì)）×V×nm式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)； a無土為無土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)； a無基質(zhì)為無基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)

11、曲線求得的酚毫克數(shù)； V為顯色液體積；n為分取倍數(shù)；m表示烘干土重土壤蔗糖酶活性測定（3,5- 二硝基水楊酸比色法）一、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性，如與土壤有機(jī)質(zhì)、氮、磷含量、微生物數(shù)量及土壤呼吸強(qiáng)度有關(guān)。一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。二、試劑1）8%蔗糖溶液2）PH5.5磷酸緩沖溶：1/15M磷酸氫二鈉（11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸餾水中）0.5ml加1/15M磷酸二氫鉀（9.0

12、78g KH2PO4溶于1L蒸餾水中）9.5ml即成。3）甲苯 4）3,5- 二硝基水楊酸試劑（DNS試劑） 稱0.5g二硝基水楊酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸鉀鈉，用水稀釋定容至100ml（保存期不過7天）。5）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：預(yù)先將分析純葡萄糖置80內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱取0.5g葡萄糖于中，用水溶解后，移至100mL中，定容，搖勻。即為5mg還原糖/mg的溶液。冰箱中4保存期約一星期，若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。三、操作步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別吸葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于試管中，再補(bǔ)加蒸

13、餾水至1mL，加DNS試劑3mL混勻，于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min（從試管放入重新沸騰時(shí)算起），取出立即泠水浴中冷卻至室溫。將溶液轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，定容。以空白管調(diào)零在波長508nm處比色，以吸光度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）土壤蔗糖酶測定稱取2 g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5ml pH 5.5磷酸緩沖液和5滴甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37下培養(yǎng)24h。到時(shí)取出，迅速過濾。從中吸取濾液1ml，注入小試管中，加3ml DNS試劑，在沸騰的水浴鍋中加熱5min，隨即將試管移至自來水流下冷卻3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊

14、酸而呈橙黃色，最后將試管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，并用蒸餾水定容稀釋至100ml。在分光光度計(jì)上于508nm處進(jìn)行比色。為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無基質(zhì)對(duì)照，整個(gè)試驗(yàn)需做無土壤對(duì)照；如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。四、結(jié)果計(jì)算：蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。蔗糖酶活性=（a樣品a無土a無基質(zhì)）*V*n/ma樣品、a無土、a無機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)；V為顯色體積；n為分取倍數(shù)；m為土重。過氧化氫酶活性測定（高錳酸鉀滴定法）一、原理過氧化氫廣泛存在于生物體和土壤中，是由生物呼吸過程和有機(jī)

15、物的生物化學(xué)氧化反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生的，這些過氧化氫對(duì)生物和土壤具有毒害作用。與此同時(shí)，在生物體和土壤中存有過氧化氫酶，能促進(jìn)過氧化氫分解為水和氧的反應(yīng)（H2O2 H2O+O2），從而降低了過氧化氫的毒害作用。土壤中過氧化氫酶的測定便是根據(jù)土壤（含有過氧化氫酶）和過氧化氫作用析出的氧氣體積或過氧化氫的消耗量，測定過氧化氫的分解速度，以此代表過氧化氫酶的活性。測定過氧化氫酶的具體方法比較多，如氣量法：根據(jù)析出的氧氣體積來計(jì)算過氧化氫酶的活性；比色法：根據(jù)過氧化氫與硫酸銅產(chǎn)生黃色或橙黃色絡(luò)合物的量來表征過氧化氫酶的活性；滴定法：用高錳酸鉀溶液滴定過氧化氫分解反應(yīng)剩余過氧化氫的量，表示出過氧化氫酶的活性。

16、本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)采用高錳酸鉀滴定法。二、試劑1.5mol/L H2SO4溶液:量取42ml濃硫酸稀釋至500ml；0.3%的H2O2：將30%雙氧水稀釋100倍，其濃度用高錳酸鉀滴定；飽和明礬溶液：鋁鉀礬即明礬在20的溶解度為10.84g，30的溶解度為15.41g；0.02mol/L高錳酸鉀：稱取3.16g高錳酸鉀溶解定容至1L，其準(zhǔn)確濃度用草酸鈉標(biāo)定；三、操作步驟分別取2g土壤樣品于三角瓶中，加入40ml蒸餾水，加5ml0.3%的H2O2溶液，立即將三角瓶瓶口密封起來。震蕩20分鐘后加入1ml飽和鋁鉀礬，立即過濾于盛有5ml1.5mol硫酸的三角瓶中，濾干后，吸取濾液25ml，用0.02mol/

17、L高錳酸鉀滴定至紫紅色，同時(shí)做無土對(duì)照。四、結(jié)果計(jì)算（如下面處理）：KMnO4標(biāo)定：準(zhǔn)確稱取0.13-0.16g草酸鈉置于250ml三角瓶中，加30ml誰和20ml1.5mol/L的H2SO4，加熱至75左右，用KMnO4 滴定至紫紅色。剛開始滴定溶液就會(huì)變成紫紅色，此時(shí)并不是滴定終點(diǎn)。等剛開始出現(xiàn)的紫紅色褪色之后，再繼續(xù)滴定至紫紅色，直到30 S 紫紅色不褪色為止。H2O2標(biāo)定： 吸取5ml H2O2 加入10ml1.5mol/L的H2SO4 ，用KMnO4滴定至紫紅色。過氧化氫酶活性以20min內(nèi)每克土壤分解的過氧化氫的毫克數(shù)表示過氧化氫酶活性= (V-VS)C*51/V0*17/WV：為

18、滴定空白所用的KMnO4 體積；VS ：為滴定樣品所用的KMnO4 體積；C：為KMnO4 濃度；V0 ：為滴定體積25ml；W：為土重；過氧化物酶活性測定（比色法）1、 試劑（1）1%鄰苯三酚溶液（2）0.5%H2O2 溶液（3）乙醚（4）0.5mol/L HCL(5) PH4.5檸檬酸-磷酸緩沖溶液: 0.1mol/L 檸檬酸溶液：19.2g C6H7O8溶至1L. 取0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶：53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.取10.65ml檸檬酸和9.35mlNa2HPO4混勻(用量較多可以乘以倍數(shù)配制),之后再用這兩種溶液調(diào)節(jié)PH即可.（6） 重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液以及標(biāo)準(zhǔn)曲線：0.75g重鉻酸鉀溶于1L0.5molHCL。此時(shí)的溶液相當(dāng)于50ml醚中含有5mg紫色沒食子素。（7） 標(biāo)準(zhǔn)曲線：取重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、4、6、8ml，用0.5mol的HCL稀釋至50ml。定容后，在分光光度計(jì)上于430nm處比色測定。以吸光度為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、 操作步驟取1g土壤置于150