《食品安全地方標準動物性食品中2-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》編制說明

1、.食品安全地方標準 動物性食品中a2-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（征求意見稿）編制說明一、標準起草的基本情況（包括簡要的起草過程、主要起草單位、起草人等）（一）任務(wù)來源、主要起草單位、起草人2014年4月, 北京市疾病預(yù)防控制中心受北京市衛(wèi)生計生委的委托，承擔食品安全地方標準動物性食品中a2-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的制定工作，委托項目編號為spaqdfbz-2014-13。為保證標準制訂的科學(xué)性、適用性，北京市疾病預(yù)防控制中心成立標準起草工作組，制定工作方案、明確職責分工、時間進度和有關(guān)工作要求。主要起草單位：北京市疾病預(yù)防控制中心。主要起草人：范賽、趙榕、吳國華、

2、張楠、劉平、劉偉、李麗萍、柳靜、趙海燕、趙旭東、陳忠輝等。（二）簡要的起草過程2014年5月，北京市疾病預(yù)防控制中心中心實驗室抽調(diào)技術(shù)人員組成標準起草小組，開始制定實驗方案，在前期大量文獻調(diào)查和實驗室研究工作的基礎(chǔ)上建立檢測方法。2014年11月開始開展方法回收率、精密度、測定低限以及線性范圍等一系列技術(shù)內(nèi)容的確定研究。2015年5月底形成標準檢測方法草案。2015年7月，組織衛(wèi)生部食品安全風險評估重點實驗室、公安部物證鑒定中心、北京市海淀區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所等3家單位進行了方法的協(xié)同性驗證試驗，驗證結(jié)果表明方法的各項技術(shù)指標滿足食品中a2-受體激動劑測定的要求。二、標準的重要內(nèi)容及主要修改情

3、況本標準在國內(nèi)為首次制定，對標準方法的范圍、原理、試劑材料、儀器設(shè)備、分析步驟、分析結(jié)果的表述、精密度以及定量限等重要內(nèi)容進行了規(guī)定和說明。（一）目標基質(zhì)的選擇a2-受體激動劑（a2-agonists），主要用于高血壓的治療。一系列的動物實驗表明，該類藥物如可樂定、賽庚啶等可以通過促進下丘腦GHRH神經(jīng)元合成和釋放GHRH，進而調(diào)節(jié)腺垂體細胞內(nèi)cAMP水平，從而調(diào)控GH分泌能顯著提高豬的瘦肉率和眼肌面積，降低脂肪比率和背膘厚，改善豬的胴體組成，起到促進動物生長，提高瘦肉率的作用。在大動物的生長過程中使用將導(dǎo)致a2-受體激動劑在動物體內(nèi)的蓄積，進一步引起食物中毒的情況發(fā)生。鑒于該類藥物可用于豬、

4、牛、羊的飼料中，本標準起草小組在前期研究中對北京市居民主要動物性食品（豬、牛、羊）（肉、肝、腎）中a2-受體激動劑的含量進行了初步監(jiān)測。監(jiān)測結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)a2-受體激動劑在北京市的動物性食品中的殘留。因此，對檢測步驟和條件進行確證和驗證時，研究參考歐盟96/257/EC中規(guī)定的相關(guān)方法學(xué)驗證方法，以空白基質(zhì)加標回收進行了方法學(xué)驗證。所包選擇的動物性食品基質(zhì)主要包含市面上常見的豬肉、豬肝、豬腎、牛肉、羊肉這5種食品基質(zhì)。本標準對上述5種動物性食品中a2-受體激動劑的檢測過程進行了規(guī)定。經(jīng)過多家單位的協(xié)同性驗證試驗，證明標準方法的各項技術(shù)指標能夠滿足上述食品中測定的要求。（二）檢測方法的選擇a2

5、-受體激動劑屬于獸藥殘留的一種，獸藥殘留多含量通常較低，主要集中在g/kg水平，屬于痕量有機污染物。為了保證檢測方法具備足夠低的檢出限，同時考慮到動物性食品基質(zhì)的復(fù)雜性，本標準采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測法（UPLC-ESI-MS/MS）對動物性食品中a2-受體激動劑進行測定。該方法綜合利用了超高效液相色譜的高分離度特性和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度特性，能夠較好的滿足食品中痕量a2-受體激動劑測定的需求。此外，為了補償超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測中可能存在的基質(zhì)效應(yīng)以及樣品前處理過程中目標物的損失，本標準采用同位素內(nèi)標稀釋法并結(jié)合基質(zhì)標準曲線對a2-受體激動劑的含量進行定量，保證

6、了方法回收率、精密度和線性等指標的良好。（三）試劑純度和級別的選擇本標準規(guī)定使用色譜級的水、甲醇及乙腈作為流動相和提取液，所選用的化學(xué)品為優(yōu)級純。（四）分析條件的優(yōu)化和選擇在對實驗條件反復(fù)優(yōu)化的基礎(chǔ)之上，本標準對豬肉、豬肝、豬腎、牛肉、羊肉基質(zhì)樣品的提取和凈化步驟進行詳細了規(guī)定，給出了樣品上機測定時液相色譜和質(zhì)譜的參考條件。標準方法中主要技術(shù)內(nèi)容的確定依據(jù)如下：在儀器分析條件的優(yōu)化過程中，通過流動注射50 g/L的以甲醇-0.1%甲酸水溶液（50：50，V/V）為溶劑的單標標準（包括氘代同位素內(nèi)標），采用ESI+和ESI-模式進行質(zhì)譜掃描，所有化合物均是在ESI+模式下有良好響應(yīng)。方法摸索了不

7、同流動相體系包括：乙酸水溶液-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、10 mM乙酸銨緩沖液-甲醇、0.1%磷酸鹽緩沖液-乙腈、0.1%甲酸-甲醇等a2-受體激動劑的分離情況?？紤]毒性、環(huán)境等因素，本試驗選擇0.1%甲酸-甲醇為流動相，經(jīng)過流動相梯度優(yōu)化后，得到較好的分離效果。并且，待測化合物多為正離子模式，0.1%甲酸-甲醇可以更加容易提供質(zhì)子，促進目標化合物帶電荷，有助于目標物響應(yīng)的提高，因此，最終選擇 0.1%甲酸-甲醇作為流動相。部分a2-受體激動劑類藥物在動物組織中以硫酸軛合物或葡萄糖醛酸軛合物等形式存在，因此樣品要先進行水解，使待測物游離或從組織中釋放以進行后續(xù)的提取和凈化。常用的水解方法主要有

8、酶水解、酸水解和堿水解。由于缺乏陽性樣本進行確證，本方法采用最保守的酶解的方式進行。同時，對動物組織中a2-受體激動劑的提取液進行了摸索，采用了包括5% 三氯乙酸、酸化甲醇、酸化乙腈、0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L HClO4等提取溶劑，最終確定提取液的組成為5 mL緩沖鹽酶解后，加入20 mL鹽酸酸化甲醇溶液進行提取。a2-受體激動劑類化合物多能與H+結(jié)合形成陽離子，被MCX柱的填料吸附，從而具有高的選擇性和靈敏度，起到較好的凈化效果。進行MCX凈化后的洗脫液濃縮至干后，先用甲醇渦旋復(fù)溶，復(fù)溶的溶液中有白色懸浮絮狀沉淀，此絮狀沉淀應(yīng)為蛋白等大分子物質(zhì)，經(jīng)高速冷凍離心后，將甲醇液濃