基因工程的基本操作程序

1、基因工程基本操作的四個步驟基因工程基本操作的四個步驟1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達載體的構(gòu)建、基因表達載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個以上的例子請舉出三個以上的例子2 2、獲取目的基因的方法、獲取目的基因的方法（1 1）從基因文庫中獲?。幕蛭膸熘蝎@?。? 2）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增（3 3）人工合成）人工合成從從基因文庫基因文庫中獲取目的基因

2、中獲取目的基因基因文庫基因文庫 基因組基因組文庫文庫cDNAcDNA文庫文庫基因文庫的構(gòu)建過程基因文庫的構(gòu)建過程限制酶限制酶拼接到載體上拼接到載體上導入受體細胞擴增導入受體細胞擴增 將含有某種生將含有某種生物不同基因的許物不同基因的許多多DNADNA片斷片斷, ,導入導入到到中中, ,各個受體菌各個受體菌分別含有這種生分別含有這種生物的不同基因物的不同基因, ,稱為稱為基因文庫基因文庫?；蚪M文庫基因組文庫 cDNA文庫的構(gòu)文庫的構(gòu)建建-反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄以目的基因轉(zhuǎn)錄成的成的信使信使RNARNA為模板，為模板，逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈成互補的單鏈DNADNA，然后在酶的作用

3、，然后在酶的作用下合成下合成雙鏈雙鏈DNADNA，從而，從而獲得所需的基因。獲得所需的基因。提取生物某發(fā)育時期的提取生物某發(fā)育時期的mRNAmRNA單單 鏈鏈DNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈CDNACDNA( (只含該生物部分基因只含該生物部分基因) )與載體連接導入到受體菌群儲存與載體連接導入到受體菌群儲存依據(jù)依據(jù)-目的基因的有關(guān)信息。目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因在染色體上的位置基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性?；蚍g產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。文庫類型文庫類型CDN

4、ACDNA文庫文庫基因組文庫基因組文庫文庫大小文庫大小小小大大基因中基因中啟動子啟動子（具有啟動作用的（具有啟動作用的DNADNA片段）片段）無無有有基因中基因中內(nèi)含子內(nèi)含子（位于編碼蛋白質(zhì)序列內(nèi)的（位于編碼蛋白質(zhì)序列內(nèi)的非編碼非編碼DNADNA片段）片段）無無有有基因多少基因多少某種生物的某種生物的部分基因部分基因某種生物的某種生物的全部基因全部基因物種間的基因交流物種間的基因交流可以可以部分基因可以部分基因可以基因組文庫和部分基因組文庫基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫文庫)比較比較補：原核細胞的基因結(jié)構(gòu)補：原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼

5、區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點聚合酶結(jié)合位點啟動子啟動子終止子終止子啟動子：啟動子：位于基因首端一段位于基因首端一段, ,能與能與RNARNA聚合酶結(jié)合并能起始聚合酶結(jié)合并能起始mRNAmRNA合合成的特殊成的特殊DNADNA序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片斷，它能阻礙片斷，它能阻礙RNARNA聚聚合酶的移動，并使其從合酶的移動，并使其從DNADNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能夠識別啟

6、動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì). .( (以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落) )補：真核細胞的基因結(jié)構(gòu)補：真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚酶聚酶結(jié)合位點結(jié)合位點內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子，內(nèi)含子不能轉(zhuǎn)錄為信使子，內(nèi)含子不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA RNA 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子：內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 目的基因的目的

7、基因的mRNAmRNA雜交雙鏈雜交雙鏈( (單鏈單鏈RNA/RNA/單鏈單鏈DNA)DNA)單鏈單鏈DNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNADNA( (目的基因目的基因) )cDNA文庫文庫為什么為什么cDNAcDNA文庫沒有內(nèi)含子和啟動子？文庫沒有內(nèi)含子和啟動子？(2)(2)利用利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復制復制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、 _、_ (_ (做啟動子做啟動子) )、 _原理：原理：_方式：方式：以以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增為擴增循循 環(huán)

8、的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復制復制已知基因的核苷酸序列（模板）已知基因的核苷酸序列（模板）四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）等酶）等模板模板原料原料引物引物酶酶控制溫度控制溫度能量能量利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù)擴增目的基因擴增目的基因目的基因目的基因DNADNA四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸如單鏈如單鏈DNADNA分子片段分子片段耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶聚合

9、酶PCRPCR儀自動調(diào)控儀自動調(diào)控PCRPCR的條件：的條件：循環(huán)循環(huán)變性變性退火退火延伸延伸(2)(2)利用利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增（3 3）人工合成：若基因）人工合成：若基因_，核苷酸序列又，核苷酸序列又 _ _ ，則可用此法。，則可用此法。較小較小已知已知用切目的基因相用切目的基因相同的限制性內(nèi)切同的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒酶切割質(zhì)粒目的基因目的基因用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出口，露出_。用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。2 2、基因表達載體的構(gòu)建、基因表達載體的構(gòu)建 核心核心將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒

10、的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）用同種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，使之用同種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，使之暴露出相同的黏性末端，再加入暴露出相同的黏性末端，再加入DN

11、ADNA連接酶連接酶2 2、基因表達載體的構(gòu)建、基因表達載體的構(gòu)建 核心核心同一種同一種目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在， 并且可以遺傳給下一代，同時使目的 基因能夠表達和發(fā)揮作用?；虮磉_載體的組成基因表達載體的組成目的基因目的基因啟動子啟動子終止子終止子標記基因標記基因啟動子：啟動子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識別和結(jié)合的部聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊

12、的DNADNA片斷，片斷，能終能終止止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標記基因標記基因的作用是的作用是為了為了鑒別鑒別受體細胞中是否含有目的基受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細因，從而將有目的基因的細胞篩選出來胞篩選出來載體載體與與表達載體表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分和復制原點兩部分DNADNA片段。表達載體在載體片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體和目既用到限制酶切割載體和目的基因，又用到的基因，又用到DNADNA連

13、接酶將目的基因和載體連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表必需以表達載體的方式攜帶進去。達載體的方式攜帶進去。注意注意3 3、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 方法方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛毎参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麆游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注

14、射法顯微注射法目的基因進入目的基因進入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持受體細胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達CaCa+ +處理細胞處理細胞1 1、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ?、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ海? 1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點：農(nóng)桿菌特點：易感染易感染雙子葉植物和裸子植物雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力子葉植物沒有感染能力原理：原理：TiTi質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNAT-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細可以轉(zhuǎn)移到受體細 胞，并整合到受體細胞染色體的胞，并整合到受體細胞染色體的DNADNA上。上。過程：過程：T

15、i質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因構(gòu)建構(gòu)建表表達達載載體體導入導入植植物物細細胞胞插入插入植物細胞植物細胞染色染色DNA表達表達新新性性狀狀轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)農(nóng)桿桿菌菌（2 2）基因槍法：單子葉植物常用）基因槍法：單子葉植物常用（3 3）花粉管通道法：抗蟲棉）花粉管通道法：抗蟲棉2 2、將目的基因?qū)雱游锛毎⒛康幕驅(qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?、將目的基因?qū)胛⑸锛毎松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少原核生物特點：繁

16、殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法： 用用CaCa2+2+處理細胞處理細胞 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 表達載體與感受態(tài)細胞混合表達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細感受態(tài)細胞吸收胞吸收DNADNA分子分子4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功檢查是否成功分子水平分子水平檢測檢測個體水平個體水平鑒定鑒定檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方

17、法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交抗原抗體雜交抗原抗體雜交 兩種生物的互補的兩種生物的互補的DNADNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈。單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈。即能夠進行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴格按照堿基互即能夠進行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴格按照堿基互補配對進行。因此，當用探針與轉(zhuǎn)基因生物的目的基因雜補配對進行。因此，當用探針與轉(zhuǎn)基因生物的目的基因雜交時，如果出現(xiàn)雜交帶（用特殊的顯影裝置能看到），則交時，如果出現(xiàn)雜交帶（用特殊的顯影裝置能看到），則說明目的基因已經(jīng)插入受體細胞的染色體說明目的基因已經(jīng)插入受體細胞的染色體DNADNA中。中。DNAD

18、NA分子雜交原理：分子雜交原理：基因探針：基因探針：是一小段單鏈的是一小段單鏈的DNADNA或或RNA,RNA,帶有放射性同位素標記，帶有放射性同位素標記，并能與目的基因的一條鏈堿基互補配對并能與目的基因的一條鏈堿基互補配對歸納步驟檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因DNADNA與與DNA雜交雜交檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNADNADNA與與RNA雜交雜交檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原抗體雜交抗原抗體雜交檢測抗蟲棉是否翻譯出毒蛋白：從蘇云金芽孢桿菌中提取毒蛋白，檢測抗

19、蟲棉是否翻譯出毒蛋白：從蘇云金芽孢桿菌中提取毒蛋白，注入某種動物體內(nèi)，從動物的血清中分離出相應的抗體，并用熒注入某種動物體內(nèi)，從動物的血清中分離出相應的抗體，并用熒光標記該抗體，然后用標記的抗體與抗蟲棉的細胞提取液混合，光標記該抗體，然后用標記的抗體與抗蟲棉的細胞提取液混合，如出現(xiàn)雜交帶，則表明抗蟲基因已經(jīng)在棉花細胞中表達。如出現(xiàn)雜交帶，則表明抗蟲基因已經(jīng)在棉花細胞中表達。個體水平個體水平鑒定鑒定 抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等 抗蟲棉的接種實驗抗蟲棉的接種實驗（左為抗蟲轉(zhuǎn)基因棉，使蟲體發(fā)育不正常）（左為抗蟲轉(zhuǎn)基因棉，使蟲體發(fā)育不正常）基基因因工工程程的的基基本本

20、操操作作程程序序目的基因的獲取目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定1、從基因文庫中獲取目的基因、從基因文庫中獲取目的基因2、利用、利用PCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因3、化學方法人工合成、化學方法人工合成目的基因目的基因 + + 啟動子啟動子 + + 終止子終止子 + + 標記基因標記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、CaCa2+2+處理法處理法DNADNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原抗

21、體雜交技術(shù)抗體雜交技術(shù)分子檢測外的個體水平鑒定分子檢測外的個體水平鑒定3.3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體存在和高爾基復合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存

22、在這兩種細胞器，因此，在大于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。4.-4.-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，應如何進行設計？想一想，應如何進行設計？思考與探究思考與探究（1 1）從小鼠中克隆出）從小鼠中克隆出-珠蛋白基因的編碼序列（珠蛋白基

23、因的編碼序列（cDNAcDNA）。）。（2 2）將）將cDNAcDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上 抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達載體?？顾沫h(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達載體。（3 3）將表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有）將表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有 四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大 腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如 果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明-珠蛋白基因已珠蛋白基因已 進入其中。進入其中。（4 4）培養(yǎng)進入了）培養(yǎng)進入了-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎 后從中提取后從中提取-珠蛋白。珠蛋白。練習練習1 1：(2008(2