自組裝DNA納米材料在生物醫(yī)學的應(yīng)用

1、高等生物化學分析和生物物理學課程論文自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)材料在生物醫(yī)學中的應(yīng)用摘要 隨著DNA納米技術(shù)的發(fā)展成熟，DNA作為自然存在的聚合物大分子，不但是生物遺傳信息的載體，更可以作為有序可控的納米結(jié)構(gòu)單元。由于核酸分子具有很好的生物相容性、低毒性和易編程，目前可通過自組裝的方法構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)可以用于化學生物傳感、生物成像、載藥和基因治療。本文將從以上幾個方面綜述自組裝的DNA納米結(jié)構(gòu)材料在生物醫(yī)學中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)生物醫(yī)學基因沉默1. 自組裝DNA納米材料概述DNA作為自然存在的聚合物大分子，不但是生物遺傳信息的載體，更可以作為有序可控的納米結(jié)構(gòu)單元。DNA雙鏈雜交嚴格遵循沃

2、森-克里克定律堿基配對原則，因此，通過控制堿基的排列順序，我們既能夠決定DNA的鏈接方式又可以設(shè)計它的整體結(jié)構(gòu)。這種DNA的納米技術(shù)，不僅僅影響了大自然的生物進化，更為DNA的應(yīng)用拓展了空間。在DNA納米技術(shù)中，研究者們可以通過合理地設(shè)計堿基序列，使得單獨的DNA序列能夠按照設(shè)計組裝成我們想要的結(jié)構(gòu)。在納米尺寸上構(gòu)造DNA自組裝結(jié)構(gòu)有著獨特的優(yōu)勢1,2,3。首先，DNA納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建是按照自上而下的順序進行的，研究者可以使DNA鏈按照堿基互補配對原則雜交出預設(shè)的結(jié)果，從而設(shè)計出大量的核酸結(jié)構(gòu)，這種特性是其他納米材料（例如納米顆粒和蛋白質(zhì)等）所不具備的；其次，B型DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的直徑為2nm，

3、螺旋重復單元為3.4nm（約10.5個堿基對），這種明確的特征使模型構(gòu)建變得相對簡單；第三，使用市售的DNA合成儀可制備DNA，并且能夠修飾任意的DNA序列；第四，DNA的結(jié)構(gòu)兼具剛?cè)崽匦裕啾葐捂淒NA，雙鏈DNA的剛性較強。我們可以通過單鏈與雙鏈的鏈接組裝特定的幾何結(jié)構(gòu)。最后，利用DNA良好的生物相容性，DNA材料可與其他生物材料共同構(gòu)建多組分的納米結(jié)構(gòu)。此外，利用DNA堿基互補配對，研究人員采用鏈置換的策略，開發(fā)了一系列的動態(tài)DNA納米技術(shù)，例如Winfree等人用DNA邏輯門設(shè)計構(gòu)造了模擬人類大腦的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和一個復雜的DNA計算機37,38。2. 基于DNA納米材料組裝的應(yīng)用2.1 生

4、物傳感檢測DNA納米材料最早期的是核酸分子探針，它是近年來發(fā)展起來的具有廣泛應(yīng)用價值和發(fā)展?jié)摿Φ纳锓治龉ぞ摺：怂岱肿犹结樣珊怂嵝蛄袠?gòu)建而成，通過堿基互補配對及其他非共價作用實現(xiàn)對目標物的識別，并通過光、電等信號將探針與目標物的識別報告出來39。目前，核酸分子探針已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于物理參數(shù)以及化學和生物學組分物質(zhì)的傳感和檢測，如溫度、pH值、金屬離子、毒素、有機小分子、蛋白質(zhì)、核酸甚至整個細胞等40,41。以上這些被檢測的生物/化學組分及物理參數(shù)，在體外的環(huán)境檢測及工業(yè)質(zhì)量控制上，是重要的環(huán)境及質(zhì)量參數(shù)；在體內(nèi)，執(zhí)行了許多重要的生物學功能。例如，目前有眾多研究報道了鉀離子核酸分子探針，如：有研究

5、報道了一種基于核酸適體、納米金和一條一端標記熒光素的DNA鏈的鉀離子傳感器，利用ssDNA（單鏈DNA）和四面體結(jié)構(gòu)DNA在納米金表面吸附能力的不同和納米金的超猝滅效應(yīng)，可以實現(xiàn)對鉀離子熒光和比色的雙重檢測42。Takenaka等人2002年報道了一種在水相中基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的鉀離子核酸探針（PSO），該探針為富鳥嘌呤核苷酸（guanine nucleotide, G）序列，在一價離子存在的情況下，DNA在水溶液中可由無規(guī)則的卷曲狀形成G-四聚體結(jié)構(gòu)（G-Quadruplex，G4），尤其是K+對G4結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有很好的特異性，K+濃度很大程度上影響G4結(jié)構(gòu)，從而大大減少了生物體內(nèi)Na+的

6、干擾1。2005年，Takenaka小組用芘做標記，同樣實現(xiàn)了基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機理檢測生物體系的鉀離子傳感43。2012年Takenaka等人改進了核酸探針，采用凝血酶的核酸適配體實現(xiàn)了細胞內(nèi)K+的成像44。近年來，DNA作為一種“智能”材料，被用于構(gòu)造具有周期性圖案的納米結(jié)構(gòu)。Yan4等報導了一種以自組裝DNA折紙結(jié)構(gòu)為基底的核酸適配體高密度納米陣列，用于檢測蛋白質(zhì)分子。當?shù)蜐舛鹊哪复嬖跁r，凝血酶與DNA納米陣列上的核酸適配體結(jié)合，誘導局部信號提高。通過共焦熒光顯微鏡成像，便能夠檢測到這一信號。另一個例子是DNA水凝膠。在結(jié)構(gòu)上，DNA組裝成的水凝膠與天然組織非常相似，隨著溫度、pH

7、值、鹽離子強度和代謝物濃度的改變，水凝膠的結(jié)構(gòu)相應(yīng)發(fā)生改變。因此在生物傳感領(lǐng)域，“刺激”響應(yīng)或者智能水凝膠愈發(fā)吸引了研究者們的關(guān)注。圖1.1 高密度DNA納米陣列檢測蛋白質(zhì)的示意圖4。2.2 生物成像高濃度的無機納米材料往往具有一定的細胞毒性，相比之下，核酸分子是人體的內(nèi)源物質(zhì)，因此具有生物相容性高、免疫源性小等優(yōu)點，并且，DNA可以通過商業(yè)的DNA合成儀快速制備。因此，近年來DNA材料正逐漸成為一種新型的生物成像納米載體。圖1.2 DNA四面體納米結(jié)構(gòu)細胞內(nèi)成像示意圖。5Fan等5利用核酸分子組裝了可重構(gòu)的DNA四面體的納米結(jié)構(gòu)，并利用這些DNA納米結(jié)構(gòu)構(gòu)造了一系列邏輯門體系（AND，XOR

8、，OR和INH），然后再采用這些DNA邏輯門結(jié)構(gòu)對細胞內(nèi)物質(zhì)，如DNA鏈序列、小分子（ATP）和金屬離子（Hg2+離子）等，進行實時的監(jiān)控（圖1.2）。2.3 藥物傳遞化療策略可能會對細胞產(chǎn)生毒副作用，使細胞產(chǎn)生耐藥性，這種耐藥性是使得腫瘤治療無效的原因之一。同時由于傳統(tǒng)的放療和化療缺乏靶向性，難以避免地給患者帶來了極大的生理及心理創(chuàng)傷。為了解決這一問題，靶向藥物運載體系應(yīng)運而生。Tan小組6報導了一種DNA交聯(lián)自組裝水凝膠的結(jié)構(gòu)（圖1.3），用于腫瘤治療中輸送靶向藥物。由于核酸適配體的作用，這種納米結(jié)構(gòu)會對白血病細胞產(chǎn)生特異的細胞毒性。此外，包含于自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)中的反義治療DNA鏈，抑

9、制了P-gp的表達，能夠有效誘導耐藥性細胞的毒性。Tan小組7還報導了一種DNA納米凝膠選擇性殺死腫瘤細胞，這種凝膠是由聚合物核酸適配體組裝的，此方法也能有效殺死耐藥性細胞。圖1.3 DNA納米自組裝凝膠結(jié)構(gòu)藥物治療示意圖6。2.4 基因沉默2.4.1 基因沉默簡介基因沉默是指由于某些原因使得生物體中的某種基因不表達或表達減少的現(xiàn)象，分為轉(zhuǎn)錄水平上和轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。由異染色體化、位置效應(yīng)或DNA甲基化引起的為轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默，轉(zhuǎn)錄后特異性降解靶標RNA（mRNA)使基因失活的為轉(zhuǎn)錄后的基因沉默?；虺聊钦{(diào)控基因表達的一種重要方式，更是在基因調(diào)控水平上生物體的一種自我保護機制。在病毒侵染

10、、外源DNA侵入和DNA重排、轉(zhuǎn)座中具有普遍性。深入研究基因沉默，可幫助我們進一步了解生物體內(nèi)基因遺傳、表達和調(diào)控的本質(zhì)，使外源基因能夠更好地按照人們的要求進行有效表達；在基因治療中，利用基因沉默可以有效地抑制有害基因的表達，從而達到治療疾病的目的，因此研究基因沉默具有非常重要的理論和實踐意義。2.4.2 siRNA介導的基因沉默siRNA即小干擾RNA，由2125個核苷酸組成的短的雙鏈RNA，是RNA水平上基因沉默的效應(yīng)因子。其沉默機制如下：首先，siRNA在細胞內(nèi)誘導系列酶促反應(yīng)，促進siRNA與Argonaute蛋白、其他的核酸內(nèi)外切酶及解旋酶等相互連接形成具有多個亞單位的核糖核酸蛋白復

11、合物，即RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex,RISC）。然后，RISC中的解旋酶在ATP酶輔助下解開siRNA雙鏈，使其中的反義鏈互補結(jié)合靶基因mRNA上與之相對應(yīng)的特異性序列（即同源互補序列）。RISC利用其中的核酸酶，以siRNA為模版，在特定位點特定間隔將靶mRNA降解。最后，結(jié)合于mRNA上的siRNA反義鏈能作為引物，以mRNA為模版，在RNA聚合酶的作用下，合成新的siRNA。如此往復循環(huán)，瀑布式放大8。研究發(fā)現(xiàn)，siRNA相對分子質(zhì)量較大(約1.3×104 D)，且?guī)в懈哓撾姾?，難以在沒有載體和助劑的情況下穿過細胞膜實現(xiàn)特

12、定的基因沉默。另一方面，siRNA進入細胞后，易被胞內(nèi)酶降解9，降低基因沉默功能。為介導siRNA進入細胞質(zhì)，Hagstrom等 10 在小鼠肢體遠端靜脈注射大量裸siRNA，瞬間用止血帶捆綁此肢體，使siRNA 擴散到組織中，發(fā)現(xiàn)有特異基因沉默性能。然而，這種方法需要大量 siRNA，且會對肢體造成傷害。Golzio等11-12 使用電介導siRNA進入小鼠腫瘤，發(fā)現(xiàn)也有基因沉默效果，并且沒有對組織造成傷害，但是siRNA的介導量低、沉默效率低。不借助載體介導siRNA的胞內(nèi)傳遞，存在siRNA用量大、沉默效率低、肢體傷害大等缺陷，因此，載體介導siRNA技術(shù)是目前研究的主要方向。為了發(fā)揮s

13、iRNA干擾的功能，需保持siRNA在到達靶細胞附近時的活性和完整性。而經(jīng)過化學修飾的siRNA能大大提高其在細胞和活體的穩(wěn)定性，所以開發(fā)一種高效的siRNA載體十分有必要。最先開發(fā)的siRNA遞送載體是病毒載體系統(tǒng)，它主要是改良某種病毒以去除病原性，并保留其轉(zhuǎn)染細胞和將外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入宿主細胞的能力。病毒型載體具有高轉(zhuǎn)染效率，但存在嚴重的機體免疫反應(yīng)、潛在的體內(nèi)病毒復制、生產(chǎn)成本高、不能反復應(yīng)用以及不能攜帶多重基因或大片段基因等缺陷，所以目前已不再是最優(yōu)的載體工具。相對于病毒載體，非病毒載體因高負載率、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、低細胞毒性、無免疫原性、便于保存等優(yōu)勢，近幾年受到廣泛的關(guān)注。非病毒載體的種類有

14、很多，大致可分為陽離子脂質(zhì)體13-15、陽離子細胞穿膜肽16-18、樹枝狀大分子(樹枝狀環(huán)糊精19、碳硅烷樹枝狀大分子20等)、陽離子聚合物(PEI 21、水凝膠22、殼聚糖23等)和無機納米材料(磷酸鈣24、石墨烯25、碳納米管26、納米金27、碳酸鈣28等)。近幾年，國內(nèi)外眾多研究小組報道了多種載體結(jié)構(gòu)，如2012年Anderson29小組報道了一種用自組裝的方法構(gòu)建一種DNA四面體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)外部修飾了siRNA用于活體內(nèi)siRNA的遞送。2015年，Brunner30等人報道了一種以有機小分子為骨架，外部修飾了靶向識別基團和siRNA的樹枝狀結(jié)構(gòu)，以此實現(xiàn)對應(yīng)基因的沉默。然而，這些非病

15、毒載體通常存在尺寸不均一、成分復雜、生物毒性高以及制備復雜等問題。更重要的是，目前所報道的非病毒載體都涉及到某個特定領(lǐng)域的復雜合成和技能，難以作為一個簡易有效的方式廣泛推行。除此之外，siRNA體內(nèi)的靶向性一直是制約RNAi技術(shù)廣泛用于臨床治療的主要障礙，未來的焦點將集中于開發(fā)安全有效的體內(nèi)遞送載體，這是將RNAi技術(shù)成功用于臨床的保證。因此，亟待開發(fā)一種既有靶向性又簡單易行可靠的載體。3. 結(jié)論近十年來，功能化的納米材料發(fā)展十分迅速，在物理、生物31、醫(yī)學32、化學33和材料34等多學科都有廣泛的應(yīng)用，同時也在前沿的交叉學科中備受關(guān)注。納米材料在一些環(huán)境的有毒分子、離子的檢測35，疾病的標志

16、物的檢測36中有著舉足輕重的作用。許多科研小組正致力于將納米材料運用到疾病的治療當中，其中抗藥性腫瘤的治療研究成為一個重點。該類載藥體系在抗藥性腫瘤細胞中的作用涉及多種耐藥性機制。在眾多的納米材料中，DNA以其獨特的性質(zhì)，如DNA的序列可編程性，可自動可控合成，很好的生物相容性和高的穩(wěn)定性等優(yōu)良特性獲得了許多科研小組的關(guān)注。參考文獻1 Seeman, N C. Nanomaterials based on DNAJ. Annual Review of Biochemistry, 2010, 79: 65-87. 2 Aldaye F A, Palmer A L, Sleiman H F. As

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