浙江大學(xué)生物化學(xué)丙實(shí)驗(yàn)報告5

1、專業(yè)： 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境 姓名： 李佳怡 學(xué)號： 3130100246 日期： 2015.6.2 地點(diǎn)： 生物實(shí)驗(yàn)中心310 裝 訂 線實(shí)驗(yàn)報告課程名稱： 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（丙） 指導(dǎo)老師： 方祥年 成績：_實(shí)驗(yàn)名稱：蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的SDSPAGE檢測分析及蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定 同組學(xué)生姓名： 金宇尊、鮑其琛 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?、?shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填） 四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填）五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填） 六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填） 八、討論、心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)的基本原理和操作方法2、

2、蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的SDSPAGE檢測分析3、學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量(Mr)的方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（1）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、SDSPAGE凝膠制作；2、蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的SDSPAGE電泳分離；3、洗脫測定并計算相對分子質(zhì)量。（2）實(shí)驗(yàn)原理1、電泳 是帶電顆粒在電場作用下，作定向運(yùn)動即向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。2、電泳法分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品 主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶凈電荷多少等因素所產(chǎn)生的電泳遷移率的差別。 3、區(qū)帶電泳 是樣品物質(zhì)在一惰性支持物上進(jìn)行電泳,因電泳后，樣品不同組分形成帶狀區(qū)間，故稱區(qū)帶電泳。4、聚丙烯酰胺凝膠（PAG) 由丙烯酰胺和交聯(lián)試劑N,

3、N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在有催化劑（如過硫酸銨或核黃素）和增速劑（如N,N,N,N-四甲基乙二胺，TEMED）的情況下聚合而成的。5、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 是在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中來分離蛋白質(zhì)，這主要是由蛋白質(zhì)樣品所帶的電荷和分子質(zhì)量的差異性進(jìn)行分離；在電泳過程中仍保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、亞基之間的相互作用及其生物活性。6、聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為 連續(xù)系統(tǒng) 凝膠緩沖液的pH值及凝膠濃度不變。該電泳系統(tǒng)具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)； 不連續(xù)系統(tǒng) 凝膠緩沖離子成分、pH值、凝膠濃度、電位梯度不連續(xù)，由濃縮膠和分離膠組成。由于濃縮膠的堆積（濃縮）作用，可使樣品（即使是稀釋樣品）在濃縮

4、膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度（或一定濃度梯度）的凝膠上進(jìn)行分離。該電泳系統(tǒng)具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。7、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 以PAG為支持物的電泳，由于各種蛋白質(zhì)所帶靜電荷、分子量大小和形狀不同而有不同的遷移率。為消除靜電荷對遷移率的影響，在整個電泳體系中加入一定量的陰離子去污劑“十二烷基硫酸鈉（簡稱SDS）”和“強(qiáng)還原劑（巰基乙醇）”后，蛋白質(zhì)樣品就會與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷復(fù)合物，而SDS作為一種變性劑和助溶劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的非共價鍵，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二級和三級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性

5、而改變原有的空間構(gòu)象。另外，SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑（巰基乙醇）存在下，可打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)或肽鏈間的二硫鍵，并能避免重新氧化，這樣分離出的譜帶即為蛋白質(zhì)亞基。蛋白質(zhì)亞基的電泳的遷移率主要取決于亞基的相對分子質(zhì)量大小，而電荷的因素可以忽略。 8、蛋白質(zhì)亞基相對分子質(zhì)量的測方法 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的SDS時，蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，約為1.8nm，而長軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比變化。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只主要取決于它的橢圓棒的長度即蛋白質(zhì)的

6、相對分子質(zhì)量的大小，而其他因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計。由于蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同，所形成復(fù)合物的相對分子質(zhì)量不同，在電泳中反映出不同的遷移率。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或亞基的相對分子質(zhì)量在15,000200,000之間時，電泳遷移率與相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈直線關(guān)系，符合下列方程式： lgMr=KbRf式中Mr代表相對分子質(zhì)量，K代表常數(shù)，b代表斜率，Rf代表遷移率。若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量的對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。3、 實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料 蔗糖酶樣品（樣品、）2、 實(shí)驗(yàn)試劑(1

7、) 30.8%凝膠貯液：丙烯酰胺(Acr) 30g，甲叉雙丙烯酰胺(Bis) 0.8g，加水溶解，并加水定容到100ml，貯于棕色瓶，4保存。(2)分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCl pH8.9(3)濃縮膠緩沖液：0.5mol/L Tris-HCl pH6.7(4) 10% SDS(5) TEMED(N,N,N,N四甲基乙二胺） (增速劑）(6) 10%過硫酸銨（引發(fā)劑） (7) 電泳緩沖液（pH8.3）： Tris 6g，甘氨酸 28.8g，SDS 2g，用蒸餾水溶解并定至1000ml，使用時稀釋1倍。(8) 蛋白質(zhì)樣品溶解液：內(nèi)含1%SDS，1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘

8、油，0.02%溴酚藍(lán)，0.01mol/L Tris-HCl pH8.0緩沖液。(9)染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250，加90.8mL 50%甲醇，加9.2mL乙酸，溶解混勻后使用。(10)脫色液：75ml乙酸，50ml甲醇，加蒸餾水875ml，混勻使用。(11)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液： -半乳糖苷酶（MW 116,000）， 牛血清白蛋白(MW66,200)， 卵清蛋白（MW 45,000）， 乳酸脫氫酶（MW 35,000）， 限制性內(nèi)切酶Bsp981（MW 25，000）， -乳球蛋白（MW 18,400）， 雞蛋清溶菌酶（MW14,400）。4、 實(shí)驗(yàn)器材與儀器1、電泳儀、垂直電泳槽

9、及制膠配件；2、微量移液器（槍）：1000l、200l、20l及相應(yīng)的槍頭（1套/2組）；3、燒杯50ml×2、100ml×2,長滴管×2支（一套/組）；4、微量注射器50l（每組一把）；5、恒溫水浴或干式恒溫加熱器(100)（12臺）；6、高速臺式離心機(jī)（1.5ml）（12臺）；7、離心管（1.5ml×5個）及離心管架×1（一套/組）；8、15cm培養(yǎng)皿（染色、脫色用）（一套/組）；9、脫色搖床（染色、脫色用）。五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟1、準(zhǔn)備電泳裝置：電泳儀、電泳槽和制膠模具。2、配膠及凝膠的制備 配制凝膠：不連續(xù)體系SDS聚丙烯酰胺凝膠配制

10、12%分離膠所需試劑量(ml)5%濃縮膠所需試劑量(ml)30.8%凝膠貯液6.001.703mol/LTris-HCL pH8.9分離膠緩沖液3.800.5mol/L Tris-HCL pH6.7濃縮膠緩沖液1.2610% SDS0.150.10TEMED0.010.01蒸餾水4.946.9010% Ap0.100.05總體積(ml)15.0010.00 凝膠制備 分離膠的制備： 按上表配制15ml分離膠，混合均勻后用細(xì)長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內(nèi)用少許蒸餾水（或水飽和的異丙醇或正丁醇）沿長玻璃板板壁緩慢注入，約5mm高（封住膠面，以促使聚合并使膠面平直)約30min后，凝膠與

11、水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合，傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余的水分。 濃縮膠的制備： 按上表配制10ml濃縮膠，混勻后用細(xì)長頭滴管將濃縮液加到已聚合的分離膠上方，直至離短玻璃板上得約0.5cm處輕輕將樣品槽模板（梳子）插入濃縮膠內(nèi)，約30min后凝膠聚合，并使凝膠“老化”小心拔去樣品槽的槽板（梳子），用濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將電泳緩沖液倒入上、下貯槽中，電泳緩沖液應(yīng)沒過短板約0.5cm以上，即可準(zhǔn)備加樣。3、 樣品處理與加樣 樣品制備取蔗糖酶樣品（樣品、）10000r/min離心30s，取上清液各50ul（樣品濃度調(diào)整至25mg/ml)，分別放入1.5ml離

12、心管中，10000r/min離心1min,收集上清為樣品溶液。 樣品處理將樣品溶液分別按等體積加入“2×蛋白質(zhì)樣品溶解液”，100保溫3分鐘，取出冷卻后，10000r/min離心1min,取上清直接加樣。 加樣 樣品、 ：用微量注射器吸取1020l樣品，注入對應(yīng)的凝膠加樣孔內(nèi)(每孔蔗糖酶樣品上樣量在2040g）。如樣品濃度較低，可適當(dāng)增加上樣量。 蛋白質(zhì)Marker:用微量注射器吸取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量溶液10l加入/孔。4、電泳 在電泳槽中加入電泳緩沖液，上槽（加樣孔端）接負(fù)極、下槽接正極，接電泳儀電源，電流控制在23mA/樣品孔，一般樣品進(jìn)濃縮膠前，電流控制在1020mA，待樣品進(jìn)分

13、離膠后，將電流調(diào)到2030mA，保持電流強(qiáng)度不變（恒流），待指示染料遷移至下沿約0.51cm處停止電泳。5、剝膠、固定和染色 電泳結(jié)束后，取下凝膠膜用專用鏟子撬開短玻璃板將凝膠一角切下做一加樣標(biāo)記將凝膠板放在15cm培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，固定、染色15min左右，6、脫色 棄去染色液，加入蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止。6、 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：制膠過程：將分離膠和水注入后，30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線；樣品制備：離心后溶液淡黃色，下層有部分沉淀凝膠板圖：如圖所示：左1為Marker，右1、3、4、5分別為樣品1、2、3、4，右2為樣品1

14、溢出導(dǎo)致，由于加樣較少，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)所得蛋白質(zhì)區(qū)帶顏色較淺。所有樣品帶均清晰明顯，則取樣品值。2、 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄計算蛋白質(zhì)樣品相對分子質(zhì)量 遷移率計算： 相對遷移率Rf蛋白樣品距加樣端距離(cm)/溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm) 列出電泳后各種蛋白質(zhì)的遷移率和分子量。作圖法求相對分子質(zhì)量：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量lgM為縱坐標(biāo)在半對數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率可直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相對分子質(zhì)量（lgMr=KbRf），求蛋白質(zhì)樣品相對分子質(zhì)量（Mr)3、 作標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子量的對數(shù)與電泳相對遷移率標(biāo)準(zhǔn)曲線圖選取加樣端為起點(diǎn)，計算標(biāo)

15、準(zhǔn)樣的各個條帶的比移值如下：標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量KDa1801309572554334261710遷移距離 cm2.702.803.053.303.754.204.705.306.557.75染料遷移距離cm 8.80遷移率Rf0.3070.3180.3470.3750.4260.4770.5340.6020.7440.881蔗糖酶樣品4遷距離 4.58cm標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量(KDa)lgMr相對遷移率1805.260.3071305.110.318954.950.347724.860.375554.740.426434.630.477344.530.534264.410.602174.

16、230.744104.000.881得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子量的對數(shù)與電泳相對遷移率標(biāo)準(zhǔn)曲線圖因電泳遷移率與相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈直線關(guān)系，符合下列方程式： lgMr=KbRf 由有圖表可得：K=5.6673；b=1.9862，R2 = 0.9397。 y=-1.9862x+5.66737、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、 SDS-PAGE圖譜：2、 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子量的對數(shù)與電泳相對遷移率標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3、計算蛋白質(zhì)樣品相對分子質(zhì)量由樣品中蔗糖酶Rf=（4.58/8.80)=0.52，代入線性方程知lgMr=4.63，所以Mr=42658。分析：在凝膠電泳圖中，樣品、和標(biāo)準(zhǔn)樣依次在由右向左的第1、3、4 、5、10加樣孔中，第2個孔為污染。由于加樣量較少，顏色較淺。但每個樣品都存在許多雜帶，表明樣品中仍有許多雜蛋白。這是由于在離子交換柱層析分離的時候，雜質(zhì)蛋白分子量較小，且可能帶電與蔗糖酶相近，所以在洗脫的時候有一部分隨蔗糖酶一起被洗脫。 八、討論、心得1、在進(jìn)行凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量時，前期最主要的就是制膠。制膠可以在準(zhǔn)備倒膠的時候再加AP，防止膠液過早凝固，可以有較多的時間處理突發(fā)狀況。2、在倒膠時可以先倒一部分的膠，一方面可以檢測有無漏膠，另一方面可以想辦法讓膠液迅速凝固，堵住細(xì)微的縫隙，防止進(jìn)一步漏膠。3、在進(jìn)行加樣前需要先讓緩沖液沒過加樣孔，防止后面添加緩沖液的時候?qū)?/p>