酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 鎖定本詞條由“科普中國(guó)”百科科學(xué)詞條編寫與應(yīng)用工作項(xiàng)目 審核 。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (以下簡(jiǎn)稱ELISA) ：是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 ) 表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測(cè)大分子抗原，后者用于測(cè)定特異抗體。中文名酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)外文名enzyme linked immunosorbent assay;ELISA又    稱酵素免疫分析法應(yīng)用學(xué)

2、科醫(yī)學(xué)-免疫學(xué)應(yīng)    用多種細(xì)菌和病毒等疾病的診斷方法1三明治法（sandwich）方法2間接法（indirect）方法3競(jìng)爭(zhēng)法（Competitive）目錄1. 1 吸附試驗(yàn)2.  簡(jiǎn)介3.  基本原理4.  特性5.  辣根過(guò)氧化物酶1.  堿性磷酸酶2.  標(biāo)記方法3.  效果測(cè)定4.  間接ELISA5.  雙抗體夾心6.  雙夾心ELISA1.  競(jìng)爭(zhēng)ELISA2.  阻斷ELISA3.  抗體捕捉ELI

3、SA4.  斑點(diǎn)ELISA5.  布ELISA6. 2 影響因素1.  素質(zhì)因素2.  標(biāo)本處理因素3. 3 注意事項(xiàng)吸附試驗(yàn)簡(jiǎn)介自從Engvall和Perlman(1971）首次報(bào)道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以來(lái)，由于ELISA具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。盡管早期的ELISA由于特異性不夠高而妨礙了其在實(shí)際中應(yīng)用的步伐，但酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)專用儀器隨著方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新，尤其是采用基因工程方法制備包被抗原，

4、采用針對(duì)某一抗原表位的單克隆抗體進(jìn)行阻斷ELISA試驗(yàn)，都大大提高了ELISA的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA檢測(cè)儀的使用，使ELISA更為簡(jiǎn)便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法之一。如今ELISA方法已被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和病毒等疾病的診斷。在動(dòng)物檢疫方面，ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結(jié)核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍(lán)舌病等的診斷中已為廣泛采用的標(biāo)準(zhǔn)方法?；驹鞥LISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可

5、在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。特性用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。如今應(yīng)用較多的有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用最廣。辣根過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從

6、辣根中提取的稱辣根過(guò)氧化物酶（HRP），是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為pH 3-9，催化反應(yīng)的最適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過(guò)氧化氫，催化反應(yīng)時(shí)的供氫體有幾種：鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)

7、物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時(shí)內(nèi)不改變,是目前國(guó)內(nèi)ELISA中最常用的一種；聯(lián)大茴香胺（OD），產(chǎn)物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；5氨基水楊酸(5AS）：產(chǎn)物為深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍(lán)色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應(yīng)快，顏色明顯。堿性磷酸酶系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價(jià)無(wú)毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應(yīng)系統(tǒng)中，3

8、71分鐘水解1g磷酸苯二鈉為一個(gè)單位。標(biāo)記方法良好的酶結(jié)合物取決于兩個(gè)條件：即高效價(jià)的抗體和高活性的酶?？贵w的活性和純度對(duì)制備標(biāo)記抗體至關(guān)重要，因?yàn)樘禺愋悦庖叻磻?yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強(qiáng)。在酶標(biāo)記過(guò)程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價(jià)高及抗原親和力強(qiáng)的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過(guò)碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標(biāo)記抗體的改良過(guò)碘酸鈉法簡(jiǎn)單易行，標(biāo)記效果好，特別適用于實(shí)驗(yàn)室的小批量制備。其標(biāo)記程序?yàn)椋簩?g HRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L的過(guò)碘酸鈉（NaIO4）

9、水溶液0.5ml，混勻置4冰箱30分鐘 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4冰箱中慢慢攪拌透析6小時(shí)（或過(guò)夜）使之結(jié)合，然后吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4冰箱2小時(shí)，將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對(duì)之透析過(guò)夜（4），次日離心除去不溶物，即得到酶標(biāo)抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進(jìn)行測(cè)定后，冷凍干燥或低

10、溫保存。效果測(cè)定測(cè)定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。 酶與抗體的活性常用瓊脂擴(kuò)散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時(shí)，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng)，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個(gè)測(cè)定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA方法進(jìn)行方陣滴定，此法不僅可以測(cè)定標(biāo)記效果，還可以確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。 結(jié)合物的定量測(cè)定一般是對(duì)結(jié)合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測(cè)定。常用紫外分光光度計(jì)于403nm和

11、280nm進(jìn)行測(cè)定，然后按下列公式計(jì)算：酶量（mg/ml）=OD403×0.42IgG量（mg/ml）=（OD280OD403×0.4）×0.94×0.62對(duì)于過(guò)碘酸鈉氧化法制備的標(biāo)記抗體量，按下列公式計(jì)算：IgG量（mg/ml）=（OD280OD403×0.34）×0.62已知酶量和IgG量后，即可計(jì)算出標(biāo)記抗體的摩爾（mol）比值。HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4結(jié)合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結(jié)合物溶液量結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標(biāo)記時(shí)加入的酶量×100

12、%用于ELISA的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時(shí)效果一般，為500(g/ml時(shí)效果較好，達(dá) 1000(g/ml時(shí)效果最好。mol.比值由于結(jié)合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作為主要參數(shù)。一般認(rèn)為mol.比值為0.7時(shí)效果一般，1.0時(shí)效果較好，1.5-2.0時(shí)最好。酶結(jié)合率為 7%時(shí)效果一般，為9%10%較好，達(dá)30%以上時(shí)最好。ELISA方法的基本類型、用途及操作程序根據(jù)ELISA所用的固相載體而區(qū)分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA，稱為斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）；再

13、一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（CELISA）。在微量板ELISA中，又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。間接ELISA本法主要用于檢測(cè)抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下。 材料 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液； DVH包被抗原、酶標(biāo)抗抗體、陰性及陽(yáng)性DVH參考血清；待檢鴨血清； ELISA檢測(cè)儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。 方法步驟 加抗原包被 4過(guò)夜，洗滌三次、拋干 加待檢血清 37 2小時(shí)，洗滌三次、拋干 加酶標(biāo)抗體

14、 37 2小時(shí)，洗滌三次、拋干 加底物液 37 30分鐘，加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值，并計(jì)算出P/N比值。 結(jié)果判定已知陽(yáng)性血清與已知陰性血清的比值（P/N）2.1，而且已知陽(yáng)性血清的OD值0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）2.1，而且待檢血清的OD值0.4，則判為陽(yáng)性，否則判為陰性。雙抗體夾心本法主要用于檢測(cè)大分子抗原。現(xiàn)以檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。 加抗體包被 4過(guò)夜，洗滌三次、拋干 加待檢抗原 37 30分鐘，洗滌三次、拋干 加酶標(biāo)抗體 37 30分鐘，洗滌三次、拋干 加底物液 3

15、7 15分鐘，加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。雙夾心ELISA此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于：它是采用酶標(biāo)抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標(biāo)記每一種抗體，還可提高試驗(yàn)的敏感性。此法的基本程序?yàn)椋?加抗體（Ab-1）包被 4過(guò)夜，洗滌三次、拋干 加待檢抗原（Ag） 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加用非同種動(dòng)物生產(chǎn)的特異性抗體（Ab-2) 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加入酶標(biāo)抗Ab-2抗體（AB-3） 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加底物液 37 20分鐘，加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。競(jìng)爭(zhēng)ELISA此法主要用于測(cè)定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射免疫測(cè)

16、定。其基本程序?yàn)椋?抗體包被 4過(guò)夜，洗滌三次、拋干 加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原（對(duì)照孔僅加酶標(biāo)抗原） 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加底物液 37 20分鐘，加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測(cè)；其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記，而且因?yàn)榭乖慕Y(jié)構(gòu)不同，還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外，試驗(yàn)中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。阻斷ELISA本法主要用于檢測(cè)型特異性

17、抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬病（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測(cè)方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測(cè)法為例介紹其操作程序： 100l AP2型工作量抗原包被 4過(guò)夜，洗滌三次、拋干 用200l阻斷緩沖液進(jìn)行封閉 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100l 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加100l工作量兔抗AP2型血清 37 30分鐘，洗滌三次、拋干 加100l工作量豬抗兔IgG-HRP 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加100l OPD底物液 37 20分鐘，加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。本試驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清對(duì)

18、照、兔抗AP2型陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照?？贵w捕捉ELISA本法主要用于檢測(cè)IgM抗體。由于IgM抗體出現(xiàn)于感染早期，所以檢測(cè)出IgM，則可作為某種疾病的早期診斷?？贵w捕捉ELISA根據(jù)所用標(biāo)記方式不同可分為標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體、標(biāo)記抗抗體捕捉ELISA等幾種，其中以標(biāo)記抗原捕捉ELISA比較有代表性，該方法的主要程序?yàn)椋?用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被37 60分鐘后置4過(guò)夜，洗滌三次、拋干 加待檢血清 37 2小時(shí)，洗滌三次、拋干 加酶標(biāo)抗原 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加底物液 37 20分鐘，加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。斑點(diǎn)ELISA與常規(guī)的微量板ELISA比較，Dot-EL

19、ISA具有簡(jiǎn)便、節(jié)省抗原等優(yōu)點(diǎn)，而且結(jié)果可長(zhǎng)期保存；但其也有不足，主要是在結(jié)果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序?yàn)椋狠d體膜的預(yù)處理及抗原包被取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后，稍加干燥進(jìn)行壓圈。將陰性、陽(yáng)性抗原及被檢測(cè)抗原適度稀釋后加入圈中，置37使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點(diǎn)加4053個(gè)樣品，每個(gè)壓圈可加抗原液120l。 封閉將硝酸纖維素膜置于封閉液中，37感作1530分鐘。封閉液多采用含有正常動(dòng)物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。 加被檢血清可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢血清，37反應(yīng)一定

20、時(shí)間，用洗滌液洗三次，每次13分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。 加酶標(biāo)抗體，37反應(yīng)一定時(shí)間后，用洗滌液洗三次。顯色加入新鮮配制的底物液，37反應(yīng)一定時(shí)間后，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。 結(jié)果判定以陽(yáng)性、陰險(xiǎn)血清作為對(duì)照，膜片中央出現(xiàn)深棕紅色斑點(diǎn)者為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。布ELISA（CELISA）CELISA（Cloth-ELISA）是加拿大學(xué)者Blais,B. W.等于1989年建立的一種新型免疫檢測(cè)技術(shù)。該方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即滌綸布為固相載體，這種大孔徑的的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應(yīng)提供較

21、大的表面積，提高反應(yīng)的敏感性，且容易洗滌，不需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。其基本原理與Dot-ELISA類似，只是載體不同。以對(duì)布氏桿菌抗原的檢測(cè)為例，CELISA的主要程序?yàn)椋?首先把抗布氏桿菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并經(jīng)洗滌及封閉； 加被檢樣品并于室溫下感作30分鐘，然后洗5次； 加酶標(biāo)記的抗布氏桿菌抗體，于室溫下感作30分鐘，然后洗滌5次； 加入底物液顯色； 測(cè)定OD值。影響因素酶聯(lián)免疫(ELISA)是如今檢驗(yàn)科常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法之一，其操作簡(jiǎn)單，無(wú)須特殊設(shè)備，使其在各級(jí)醫(yī)院都有應(yīng)用。但是，如果忽視了影響其結(jié)果的因素，難免會(huì)造成假陰性或假陽(yáng)性，因此，了解影響實(shí)驗(yàn)的因素，減少差錯(cuò)事故的發(fā)生是極

22、其必要的。素質(zhì)因素實(shí)驗(yàn)室人員的素質(zhì)主要包括五個(gè)方面：思想素質(zhì)、文化素質(zhì)、技術(shù)素質(zhì)、心理素質(zhì)、身體素質(zhì)。首先應(yīng)具備一個(gè)良好的思想素質(zhì)，因?yàn)槲覀兊姆?wù)對(duì)象是人，我們的道德水平直接關(guān)系到人們的健康和生命安危，如果馬馬虎虎。三心二意，難免會(huì)有差錯(cuò)事故發(fā)生，我們應(yīng)該熱愛專業(yè)，耐心細(xì)致。在工作中如標(biāo)本混淆、張冠李戴、報(bào)告單發(fā)錯(cuò)等都有可能造成嚴(yán)重后果；其次文化素質(zhì)和技術(shù)素質(zhì)，我們要熟練掌握本專業(yè)的基本理論和基本技術(shù)，認(rèn)真學(xué)習(xí)新理論新知識(shí)，努力提高自己的業(yè)務(wù)水平，創(chuàng)造一個(gè)能夠勝任本職工作的技術(shù)平臺(tái)。良好的心理素質(zhì)就是要勇于面對(duì)工作生活中的挫折，在繁忙工作中，有條不紊，冷靜沉著的處理有關(guān)事務(wù)。人員素質(zhì)問(wèn)題是影響

23、檢驗(yàn)結(jié)果的首要因素。標(biāo)本處理因素實(shí)驗(yàn)室人員收到標(biāo)本后應(yīng)認(rèn)真查對(duì)，對(duì)不符合要求的標(biāo)本和申請(qǐng)單要拘收，合格標(biāo)本要及時(shí)分離血清，避免溶血，提取血清時(shí)不應(yīng)混有大量纖維蛋白或細(xì)胞成分。對(duì)不能及時(shí)檢測(cè)的標(biāo)本要妥善保存于4冰箱，做好原始記錄，標(biāo)本管上最好標(biāo)上待檢者姓名、日期。從冰箱取出的標(biāo)本要預(yù)溫至室溫，對(duì)冰凍的樣品要融化好，并充分混勻再用。注意事項(xiàng)1、操作前應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)的物理參數(shù)有充分的了解，如環(huán)境溫度(保持在18 C25)、反應(yīng)孵育溫度和孵育時(shí)間、洗滌的次數(shù)等，要先查看水育箱溫度，是否符合要求。2、正確使用加樣器加樣器應(yīng)垂直加入標(biāo)本或試劑，避免刮擦包被板底部。加樣過(guò)程中避免液體外濺，血清殘留在反應(yīng)孔壁上，加樣器吸頭要清洗干凈，避免污染，加樣次序要與說(shuō)明書一致，否則可導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。3、手工洗板加洗液時(shí)沖擊力不要太大，洗滌次數(shù)不要超過(guò)說(shuō)明書推薦的洗滌次數(shù)，洗液在反應(yīng)孔內(nèi)滯留的時(shí)間不宜太長(zhǎng)。不要使洗