質(zhì)粒DNA的提取試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)六 質(zhì)粒DNA勺提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒二、實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒（Plasmid）是獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。它是一種環(huán)狀的雙鏈DNA子，存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。本實(shí)驗(yàn)利用SDS堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA將細(xì)菌懸浮?暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會使細(xì)胞壁破裂，染色體DN用口蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒 DNA釋放到上清中。在裂解過程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被 SDS（十二烷基硫酸鈉）包蓋。當(dāng)用K+取彳弋Na+時(shí)，這些復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來。離心除去變性劑

2、后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌（含有攜帶插入片段的質(zhì)粒PMD-18T2、實(shí)驗(yàn)試劑（1） 溶液 I: Tris HCl（pH8.0）25mmol/L,EDTA（pH8.0）10mmol/L,葡萄糖 50mmol/L;（2） 溶液 n （新鮮配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%（W/V）;（3） 溶液出（100ml） : 5mol/L 乙酸鉀 60ml,冰乙酸 11.5ml（pH4.8）, 水 28.5ml ;（4）氯仿一異戊醇（24: 1）;（5）異丙醇、70%醇；四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）提取質(zhì)粒1 .挑轉(zhuǎn)化后的單菌落（含PMD-18T質(zhì)粒），

3、接種到20ml含有適當(dāng)抗生素（Amp）的豐富培養(yǎng)基中（LB培養(yǎng)液），于37c劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。（由老師完成）2 .將1.5ml的培養(yǎng)物倒入 1.5ml的EP管中，于 4 C以12000rpm離心1min。3 .離心結(jié)束，棄去上層培養(yǎng)液，再向離心管中加入 1.5ml的培養(yǎng)物，于4 c以12000rpm離心1min。4 .棄去上層培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。5 .將細(xì)菌沉淀重懸于100“冰預(yù)冷的溶液I中，用Tip吸頭吹打沉淀至完全混勻（無塊狀懸 浮）。6 .加200 6新配制的溶液n于每管細(xì)菌懸液中，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物，注意動作一定要輕柔緩和，切勿振蕩 ！將離心管放置于

4、冰上（2min）。7 .加1506用冰預(yù)冷的溶液III,蓋緊管口，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液出在粘稠的細(xì)菌裂解物 中分散均勻，之后將管置于冰上 35min。8 . 4 C以12000rpm離心5 min,將上清液（ 400 6）轉(zhuǎn)移到另一離心管中。9 .加等體積的氯仿：異戊醇（24： 1）振蕩混勻。4 C以12000rpm離心5min,將上清液 （300 6）轉(zhuǎn)移到另一離心管中。10 .加2/3體積的異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA振蕩?！勻，于冰上放置15min。11 .4 C以12000rpm離心5min。小心吸去上清液，將離心管倒置于紙巾上，以使所有液體 流出。再將附于管壁的液滴除盡。12 .加1ml 7

5、0 %乙醇溶液洗滌沉淀，振蕩混勻,4 C 12000rpm離心5min。棄去上清液，在空氣中使DNAM淀干燥（約5-10分鐘）。13 .用206 滅菌的蒸儲水溶解 DNA力口 1 口胰RNAB 37 C消化RNA 30min。14 .用1%勺瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的提取狀況。我組為第7組，由電泳圖譜可以看出，電泳得到3個(gè)條帶，條帶較為清晰。最前面的一條帶為超螺旋的質(zhì)粒 DNA（分子量2000bp）,中間的條帶為兩條鏈均發(fā)生斷裂而形成的線形DNA最慢的條帶為一條鏈發(fā)生斷裂的開環(huán)質(zhì)粒DNA六、思考題1 .試述在提取質(zhì)粒過程中溶液I、II、III的作用是什么？(1)溶液 I: Tris HCl(pH

6、8.0 )25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L, 葡萄糖 50mmol/L;主要作用是使細(xì)菌懸浮，此外EDTA可抑制DNase的活性。2 2) 溶液 n (新鮮配制)：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V);堿會使細(xì)胞壁破裂，染色體DN用口蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNME放到上清中；在裂解過程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，可被 SDS(3)溶液出(100ml) : 5mol/L 乙酸鉀 60ml,冰乙酸 11.5ml(pH4.8), 水 28.5ml ;K+置換了 SDS中的Na,得到PDS(十二烷基磺酸鉀)，這些復(fù)合物可以從溶液中有效地 沉淀下來，經(jīng)離心除去。3 .描述質(zhì)粒DNA的電泳圖譜，并解釋產(chǎn)生的現(xiàn)象及可能的原因？實(shí)驗(yàn)中得到的質(zhì)粒 DNA電泳圖譜顯示共有三條帶，其中：最快的一條帶是超螺旋的質(zhì)粒DN