質(zhì)粒DNA的提取與酶切

1、質(zhì)粒DN可勺提取與酶切生物化學(xué)實驗報告質(zhì)粒DNA的提取與酶切質(zhì)粒dnA勺提取與酶切質(zhì)粒DNA的提取與酶切一實驗原理堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒 DNA的方法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋 白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒 DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時 留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體 DNA不變性而呈 絮狀，離心時可沉淀下來。堿裂解法從大腸桿菌制備質(zhì)粒是分子生物 學(xué)研究的常規(guī)技術(shù)，堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶 液：廣溶液I :50 mM葡萄糖、25 mM寸ris-Cl、10 mM EDTA , pH 8.0;溶液II:0.2 N NaOH、1% S

2、DS;（臨用前混合）溶液III : 3 M醋酸鉀、2 M醋酸。1、溶液I的作用：對于任何生物化學(xué)反 應(yīng)，首先要控制好溶液的pH,因此選用適 當(dāng)濃度和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液。加入的 葡萄糖可以使懸浮后的大腸桿菌不會快速質(zhì)粒dnA勺提取與酶切沉積到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等 二價金屬離子的螯合劑，可以抑制DNase的活性和微生物生長。此步驟菌體一定要懸 浮均勻，不能有結(jié)塊，否則會降低抽提得率。2、溶液II的作用：NaOH是最佳的溶解 細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物 細(xì)胞，碰到了堿后幾乎在瞬間就會溶解， 這 是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer （雙層膜）結(jié) 構(gòu)向mice

3、lle （微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。 SDS也呈堿性，彳！如果只用SDS,達(dá)不到徹 底溶解細(xì)胞的作用，加入SDS主要為下一步 做鋪墊。這一步操作要注意兩點(diǎn)：第一，時 間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因 組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混 合，不然基因組DNA也會斷裂。3、溶液III的作用：SDS在高鹽濃度下 發(fā)生沉淀，同時SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均 兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，所以沉淀 也將溶液中的大部分蛋白質(zhì)沉淀下來。 溶液 中的K+置換了 SDS中的Na+而形成了不溶 性的PDS,高濃度的鹽使沉淀更完全。同時， 由于基因組DNA很長，容易被PDS共沉淀。質(zhì)粒dnA勺提取與酶切

4、2 M的醋酸可以中和NaOH ,因為長時間的 堿性條件會打斷DNA?；蚪MDNA一旦發(fā) 生斷裂，小于100 kb的片斷，就不容易與 PDS共沉淀。所以堿處理的時間要短，而且 不得激烈振蕩，否則最后得到的質(zhì)粒上會有 大量的基因組DNA污染。這一步操作混合均 勻后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。4、酚/氯仿/異戊醇的作用：PDS的沉淀 并不能將所有的蛋白質(zhì)沉淀，酚可以使蛋白 質(zhì)變性，作用大于氯仿，但水飽和酚的比重 略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚 相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回 收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚 / 氯仿始終在下層，方便水相的回收。還有， 酚與水有很大的互溶性，

5、如果單獨(dú)用酚抽提 后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制 很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此 如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一 次將水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液 進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量 的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必?fù)?dān) 心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。異戊醇的添質(zhì)粒dnA勺提取與酶切加，主要可以使離心后上下層的界面更加清 晰，方便水相的回收。試劑準(zhǔn)備1 Solution I : (100ml)50mM 葡萄糖25mM Tris-HCl(PH8.0)10mM EDTA 10mg/100ml RNaseA2 Solution II : (100ml)0.2N NaOH1

6、% SDS3 Solution III:(100ml) (PH5.5)3M KAc2M HAc4酚-氯仿-異戊醇（ 25:24:1） 6 LB/amp培養(yǎng)基 200ml（前一次實驗5 70%乙醇100ml）實驗步驟1接種（實驗前一晚進(jìn)行）挑取單克隆，接種到LB （Ampr或Kan ）質(zhì)粒dnA勺提取與酶切液體培養(yǎng)基中，37° C, 220r/min , O/N ;2質(zhì)粒提取吸取1ml菌液于Eppendorf管中） 8000 r/min 離心3min）棄盡上清。加入150 l冰預(yù)冷的solutionI ,渦旋振蕩30s后置 于冰上3min ;加入300 11 solution II）快

7、速上下顛倒 試管4-5次，置于冰上3-5 min ;再加入225 l冰預(yù)冷的solution”, 上下小心顛倒5-6次）置于冰上3-5 min;12000 r/min 離心5 min。取上清（約 600從l）,加入等體積的酚 -氯仿-異戊醇 （25:24:1）,混勻；12000 r/min 離心5 min。取上清（約 500“ D,加入2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇， -20° C 靜置 2h 或 O/N;12000 r/min 離心5min）去上清）沉淀 用40011 l冰預(yù)冷70%乙醇洗2-3次，吹干 沉淀；力口入 15 n l 含 0.5U RNAase 的 ddH2O質(zhì)粒dnA勺提

8、取與酶切溶解沉淀，37° C靜置30min, -20° C保 存。質(zhì)粒酶切：向提含有質(zhì)粒的小管中加入 20ul酶切體系：質(zhì)粒8ulECOR11ulH2O8ulKPN11ul10X Buffer2ul輕輕混勻，置于37度水浴1h,終止反應(yīng)。電泳：酶切產(chǎn)物電泳，直接取 5ul加入點(diǎn)樣孔（是否加入loading buffer與反應(yīng)加 入試劑有關(guān)）；質(zhì)粒電泳需要加入 loading buffer混勻后加入點(diǎn)樣孔。3電泳檢測質(zhì)粒提取結(jié)果瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時，多數(shù)情 況下你能看到三條帶，但不要認(rèn)為你看到的是超 螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒 樣品中不含線性DNA ,用EcoRI來線性化質(zhì)粒 后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會看到線性質(zhì)粒 DNA 的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶質(zhì)粒dnA勺提取與酶切以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán) 和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個質(zhì)粒連在 了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振 蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠(yuǎn)離這 三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組 DNA的 片斷。非常偶然的是，有時候抽提到的質(zhì)粒會 有710條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致 了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。電泳處理結(jié)果如下：四結(jié)果分析：電泳圖中左數(shù)5