內(nèi)皮抑素在肺癌患者外周血清及支氣管肺泡灌洗液中的表達(dá)研究

1、內(nèi)皮抑素在肺癌患者外周血清及支氣管肺泡灌洗液中的表達(dá)研究 作者：左志通,凌春華,劉皓,季成，王旭,潘順全,張素娟 【摘要】 目的 探討內(nèi)皮抑素(Endostatin)在肺癌患者外周血清及支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的表達(dá)以及與肺癌臨床病理生理特征的關(guān)系。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)初診肺癌47例及肺良性病變18例患者外周血清及BALF中Endostatin的表達(dá)水平。結(jié)果 肺癌患者外周血清及BALF中Endostatin分別為（131.71±5

2、0.32) ng/ml和(502.56±302.00) ng/ml,顯著高于肺良性病變者（P0.01）；肺癌晚期、有淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、肺腺癌患者外周血清及BALF中Endostatin高表達(dá)；肺癌患者Endostatin在外周血清及灌洗液中的表達(dá)呈線性正相關(guān)(P0.000)。結(jié)論 檢測(cè)外周血清及支氣管肺泡灌洗液中Endostatin均有助于肺癌的診斷及較好提示其生物學(xué)行為。 【關(guān)鍵詞】 肺腫瘤;內(nèi)皮抑素;血清;支氣管肺泡灌洗液;酶聯(lián)免疫吸附法Expression of Endostatin in Serum and in Bronchoalveolar Lavage Fluid in

3、 Patients with Lung CancerAbstract：Objective To evaluate the expression of endostatin in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and serum in patients with lung cancer. And to analysis the relationship between the levels of it and clinical features as well as pathophysiological characteristics.Methods T

4、he samples of serum and BALF were obtained from 47 patients with untreated primary lung cancer and 18 patients with benign pulmonary diseases. The levels of endostatin were analyzed by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).Results The expression of endostatin in serum was （131.71±50.32) ng/ml

5、 and in BALF was （502.56±302.00) ng/ml in patients with lung cancer.And the expression of endostatin in patients with benign pulmonary diseases was (85.86±36.86) ng/ml and (279.49±135.17) ng/ml,respectively (P<0.01),there was significantly difference between them.The levels of

6、endostatin in serum and BALF in advanced stage lung cancer patients were higher than those of early stage patients. In adenocarcinoma patients was significantly higher than that in patients with squamous cell carcinoma and SCLC in serum and BALF. Endostatin concentrations in BALF and in serum were s

7、ignificantly higher in patients with lymph node and distant metastasis than those patients with no metastasis. The expression of endostatin in serum was closely related to that in BALF in patients with lung cancer (P0.000).Conclusion The detection of endostatin in serum and in BALF may be helpful to

8、 distinguish the lung cancer from benign pulmonary diseases and to reveal the biological behaviors of lung cancer well.Key words：Lung neoplasms; Endostatin; Serum; Bronchoalveolar lavage fluid; Enzymelinked immunosorbent assay0 引言 肺癌是目前世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。腫瘤血管形成過(guò)程是血管形成促進(jìn)因子和抑制因子相互作用、共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。研究表明：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(v

9、ascular endothelial growth factor,VEGF)是作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成促進(jìn)因子 1；內(nèi)皮抑素(Endostatin)則被認(rèn)為是迄今為止最有效的內(nèi)源性血管生長(zhǎng)抑制因子 2。本文就Endostatin在肺癌患者支氣管肺泡灌洗液及血清中的表達(dá)作一研究。1 對(duì)象與方法1.1 研究對(duì)象2003年10月2004年9月期間住院的肺癌患者47例，男33例，女14例。年齡3287歲，平均60.65歲，中位年齡62歲。全部病例均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，其中鱗癌19例，腺癌15例，小細(xì)胞癌13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者13例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者11例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者36例；期8例

10、，期12例，期16例，期11例。肺癌受試者均為未經(jīng)放化療及手術(shù)等治療的初診者。對(duì)照組為同期住院的肺良性病變患者18例，男11例，女7例。年齡2884歲，平均57.6歲，中位年齡58.5歲。其中支氣管擴(kuò)張癥7例，支氣管異物3例，肺間質(zhì)纖維化3例，肺炎性假瘤2例，肺結(jié)核3例。1.2 標(biāo)本的采集與處理結(jié)合胸片、CT等確定灌洗部位。常規(guī)氣管鏡檢查，進(jìn)鏡后在病變處段支氣管開(kāi)口處經(jīng)活檢孔快速注入滅菌生理鹽水（常溫）20ml，通過(guò)回吸收裝置回收灌洗液，通?；厥?ml即可，必要時(shí)增加灌洗量。對(duì)氣管鏡未見(jiàn)病變者，則于右肺中葉或左上葉肺段進(jìn)行灌洗。灌洗液回收后常規(guī)經(jīng)支氣管鏡行活檢和（或）刷檢，以便病理證實(shí)，部分病

11、例通過(guò)日后手術(shù)病理證實(shí)。外周血清標(biāo)本在氣管鏡檢查結(jié)束后立即留取。灌洗液回收后用雙層紗布濾去黏液，灌洗液及血清標(biāo)本高速離心（3 000r/min）10min，上清液各分二份。一份送檢鉀離子，另一份-80冷凍待檢Endostatin。1.3 標(biāo)本檢測(cè)采用奧地利SLT 型酶標(biāo)儀ELISA法集中檢測(cè)Endostatin。Human Endostatin試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。具體操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。由于灌洗液灌洗及回收量不同，參照文獻(xiàn) 3對(duì)之進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以Endostatin表達(dá)的相對(duì)量作為每位患者灌洗液中的表達(dá)指標(biāo)。具體公式為：Endostatin標(biāo)準(zhǔn)值Endos

12、tatin實(shí)測(cè)值×血清鉀濃度/灌洗液鉀濃度。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理測(cè)定結(jié)果以±s表示，兩組比較行組內(nèi)及組間t檢驗(yàn)，多組比較行單因素方差分析，方差不齊或非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，同時(shí)，血清與灌洗液等的相關(guān)關(guān)系予直線回歸分析及相關(guān)t檢驗(yàn)。均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。2 結(jié)果2.1 肺癌與肺良性病變患者灌洗液及外周血清Endostatin表達(dá)的比較 肺癌與肺良性病變者灌洗液Endostatin表達(dá)均明顯高于血清；肺癌患者灌洗液及血清Endostatin表達(dá)明顯高于肺良性病變者，差異均具有顯著性，見(jiàn)表1。表1 肺癌與肺良性病變者灌洗液及外周血清Endostatin表達(dá)的比較(

13、略)注：與支氣管肺泡灌洗比較, t-5.662，P0.000； t-8.256，P0.0002.2 外周血清及灌洗液中Endostatin水平與肺癌患者臨床特征的關(guān)系 肺癌患者灌洗液及血清Endostatin表達(dá)與患者性別、年齡、受累肺、肺葉等均無(wú)明顯相關(guān)性。而吸煙指數(shù)300者血清Endostatin表達(dá)明顯高于300者，見(jiàn)表2。表2 外周血清及灌洗液中Endostatin水平與肺癌患者臨床特征的關(guān)系（略）2.3 外周血清及灌洗液中Endostatin水平與肺癌患者病理組織學(xué)特征的關(guān)系 有淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者灌洗液及血清中Endostatin濃度明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移者；晚期肺癌灌洗液及血清中Endos

14、tatin表達(dá)高于早期患者；經(jīng)兩兩比較，腺癌患者灌洗液及血清Endostatin表達(dá)均高于小細(xì)胞肺癌（P分別為0.044和0.038）和鱗癌，而小細(xì)胞肺癌與鱗癌比較差異均無(wú)顯著性，見(jiàn)表3。表3 外周血清及灌洗液中Endostatin水平與肺癌患者病理組織學(xué)特征的關(guān)系（略）2.4 肺癌患者外周血清及灌洗液中Endostatin表達(dá)的相關(guān)關(guān)系 回歸方程為85.9270.0911x，r0.547。對(duì)回歸系數(shù)行t檢驗(yàn)，t4.380，P0.000，說(shuō)明肺血清及灌洗液中表達(dá)的散點(diǎn)圖癌患者外周血清及灌洗液中Endostatin的表達(dá)成直線正相關(guān)關(guān)系，見(jiàn)圖1。3 討論 Endostatin是O'Rei

15、lly等 21997年從小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞(Murine hemangioendothelioma cell line,EOMA)的培養(yǎng)上清中分離的一種新的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子。并被證實(shí)是膠原經(jīng)蛋白酶降解的端部分片段，分子量20KD，含184個(gè)氨基酸,其中酸性氨基酸16個(gè)，堿性氨基酸29個(gè)，由11個(gè)精氨酸組成的堿性區(qū)可能與其和肝素有高度的親和力有關(guān)。 Endostatin抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用非常明顯?，F(xiàn)有研究表明，Endostatin抑制腫瘤血管形成的可能機(jī)制有：Endostatin可阻礙增生內(nèi)皮細(xì)胞與基質(zhì)蛋白的相互作用，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。同時(shí)還可減少bcl2、bclXL抗凋亡蛋白的

16、量 4；Endostatin可直接與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，引起內(nèi)皮細(xì)胞G1期停滯，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖 5；與VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等血管生成刺激因子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的硫酸肝素蛋白聚糖受體，從而抑制血管生成；與金屬蛋白酶2 (MMP2)的催化活性基團(tuán)區(qū)域結(jié)合而抑制其活性 6。文獻(xiàn)報(bào)道 7肺癌患者血清Endostatin水平明顯升高，并與腫瘤的侵襲性及預(yù)后有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 8證實(shí)Endostatin能明顯阻止NSCLC的生長(zhǎng)。由于它特異性地抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新血管生成，使腫瘤無(wú)法獲得充足的營(yíng)養(yǎng)而進(jìn)入休眠狀態(tài)。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)Endostatin在灌洗液

17、中表達(dá)研究的報(bào)道。 本研究結(jié)果顯示肺癌患者血清、灌洗液的Endostatin表達(dá)明顯高于肺良性病變者；肺癌與肺良性病變者灌洗液Endostatin表達(dá)均明顯高于血清，顯示通過(guò)灌洗液來(lái)反映的Endostatin氣道表達(dá)較血液表達(dá)更敏感。我們認(rèn)為灌洗液直接來(lái)源于氣道，而血清等的Endostatin為間接來(lái)源，因此檢測(cè)灌洗液中的Endostatin表達(dá)較其在血液中更優(yōu)越。Endostatin在外周血清及灌洗液中的表達(dá)呈明顯的線性正相關(guān)，說(shuō)明了在肺癌患者灌洗液及外周血清中表達(dá)的一致性。外周血清及支氣管肺泡灌洗液中Endostatin的表達(dá)與肺癌患者的性別、年齡、受累肺及肺葉等無(wú)關(guān)，但與肺癌病期、病理類(lèi)

18、型、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)，表明灌洗液、血清中Endostatin表達(dá)在肺癌的診斷、病理類(lèi)型的推斷、病情進(jìn)展的判斷等方面具有重要意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Stefanou D, Goussia AC, Arkoumani E, et al. Expression of vascular endothelial growth factor and the adhesion molecule Ecadherin in nonsmall cell lung cancer J.Anticancer Research, 2003,23(6C):47154720.2O'Reilly MS, Boehm

19、 T,Shing Y,et al.Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth J.Cell,1997,88(2):277285.3劉麗華,張安成,宋衛(wèi)東,等.應(yīng)用鉀離子作為支氣管肺泡灌洗液標(biāo)準(zhǔn)化參照物的多項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)肺癌診斷價(jià)值的探討 J.中華結(jié)核和呼吸雜志,1991,14(4):246247.4Dhanabal M,Ramchandran R,Waterman MJ,et al.Endostatin induces endothelial cell apoptosis J. Journal of Biological Chemistry,1999,274(17):1172111726.5Dhanabal M,Vol