PCR技術(shù)基本原理及相關(guān)知識(shí)

1、PCR技術(shù)的根本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核甘酸引物.PCR由變性-退火-延伸三個(gè)根本反響步驟構(gòu)成：模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng) 加熱至93c左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA解離,使之成為 單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反響作準(zhǔn)備；模板 DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng) 加熱變性成單鏈后,溫度降至55 c左右,引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下,以 dNTP為反響原料,靶序列為模 板,按堿基配對(duì)與半保存復(fù)制原理,合成一條新的與模板 DNA

2、鏈互補(bǔ)的半保存復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程,就可獲得更多的半保存復(fù)制鏈,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板.每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘,23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍.到達(dá)平 臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝.PCR的反響動(dòng)力學(xué)PCR的三個(gè)反響步驟反復(fù)進(jìn)行,使 DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升.反響最終的DNA擴(kuò)增量可用 丫 = (1+X)n計(jì)算.丫代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù),X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率,n代表循環(huán)次數(shù).平均擴(kuò)增效率的理論值為100%,但在實(shí)際反響中平均效率達(dá)不到理論值.反響初期,靶序列 DNA片段的增加呈指數(shù)形式,隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積

3、累,被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加,而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期,即出現(xiàn)停滯效應(yīng),這種效應(yīng)稱(chēng)平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及 DNA聚合酶PCR的種類(lèi)和活性及非特異性產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素.大多 數(shù)情況下,平臺(tái)期的到來(lái)是不可預(yù)防的.PCR反響體系的根本成分：模板DNA、特異性引物、 DNA聚合酶、dNTP、 Mg2+的緩沖液.PCR反響體系與反響條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反響體系:10 X擴(kuò)增緩沖液4種dNTP混合物引物模板DNATaq DNA聚合酶Mg2+10ul各 200umol/L各 10100pmol0.1 2ug2.5u1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ulPCR反響五要素：參加PCR反響的物質(zhì)主要有五

4、種即引物、酶、 dNTP、模板和 Mg2+引物：引物是PCR特異性反響的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度.理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核甘酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增.設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原那么：引物長(zhǎng)度：15-30bp,常用為20bp左右.引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶.ATGC最好隨機(jī)分布,預(yù)防 5個(gè)以上的喋吟或喀咤核甘酸的成串排列.預(yù)防引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),預(yù)防兩條引物間互補(bǔ)

5、,特別是3'端的互補(bǔ),否那么會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶.引物3端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以預(yù)防因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗.引物中有或能加上適宜的酶切位點(diǎn),被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn),這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處.引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性.引物量：每條引物的濃度0.1lumol或10100Pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的時(shí)機(jī).酶及其濃度目前有兩種Taq DNA聚合酶供給,一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合

6、成的基因工程酶.催化一典型的PCR反響約需酶量2.5U指總反響體積為100ul時(shí),濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過(guò)低那么合成產(chǎn)物量減少.dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性.dNTP溶液呈酸性,使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后,以 1M NaOH或1M Tris o HCL的緩沖液將其 PH調(diào)節(jié)到7.07.5,小量分裝,-20C冰凍保存.屢次凍融會(huì)使dNTP降解.在 PCR反響中,dNTP應(yīng)為50200umol/L ,尤其是注意 4種dNTP的濃度要相 等等摩爾配制,如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)偏高或偏低,就會(huì)引起

7、錯(cuò)配.濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量.dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的 Mg2+濃度降低.模板靶基因核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用 SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本.SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白,SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸.提取的核酸即可作為模板用于 PCR反響.一般臨床檢測(cè)標(biāo)本,可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色 體的

8、蛋白質(zhì)使靶基因防字離,直接用于PCR擴(kuò)增.RNA模板提取一般采用異硫富酸服或蛋白酶K法,要預(yù)防 RNase降解RNA.Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一月的PCR反響中,各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜.Mg2+濃度過(guò)高,反響特異性降 低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性,使反響產(chǎn)物減少.PCR反響條件的選擇PCR反響條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù).溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性 -退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn).在標(biāo)準(zhǔn)反響中采用三溫度點(diǎn)法,雙鏈DNA在9095c變性,再迅速冷卻至 4

9、060C,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至7075C,在Taq DNA聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對(duì)于較短靶基因長(zhǎng)度為100300bp時(shí)可采用二溫度點(diǎn)法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用 94c變性,65c左右退火與延伸此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性 .變性溫度與時(shí)間：變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR失敗的最主要原因.一般情況下,93c94Clmin足以使模板 DNA變性,假設(shè)低于93c那么需延長(zhǎng)時(shí)間, 但溫度不能過(guò)高, 由于高溫 環(huán)境對(duì)酶的活性有影響.此步假設(shè)不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會(huì)導(dǎo)致 PCR失敗.退火復(fù)性溫度與時(shí)間：退火溫度

10、是影響PCR特異性的較重要因素.變性后溫度快速冷卻至40c60C,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合.由于模板DNA比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合時(shí)機(jī)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞.退火溫度與時(shí)間,取決于引物的長(zhǎng)度 、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長(zhǎng)度.對(duì)于20個(gè)核音酸,G+C含量約50%的引物,55 c為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想.引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇適宜的溫度：Tm值解鏈溫度尸4G+C +2A+T復(fù)性溫度=Tm 值-(510C)在Tm值允許范圍內(nèi),選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,提高PCR反響的特異性.復(fù)性時(shí)間一般為3060sec,足以使引物與模板

11、之間完全結(jié)合.延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080 c 150核音酸/S/酶分子70 c 60核音酸/S/酶分子55 C 24核音酸/S/酶分子高于90c時(shí),DNA合成幾乎不能進(jìn)行.PCR反響的延伸溫度一般選擇在7075c之間,常用溫度為72C,過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合.PCR延伸反響的時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,一月1Kb以?xún)?nèi)的DNA片段,延伸時(shí)間1min是足夠 的.34kb的靶序列需 34min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min.延 伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn).對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增,延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些.循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定 PCR擴(kuò)增程度.PCR

12、循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度.一般的循環(huán)次數(shù)選在 3040次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多.PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以?xún)?nèi),有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè),大于 48h后帶型不規(guī)那么甚致消失.假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反響的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備,引物的質(zhì)量與特異性,酶的質(zhì)量及,PCR循環(huán)條件.尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究.模板：模板中含有雜蛋白質(zhì),模板中含有Taq酶抑制劑,模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,在提取制備模板時(shí)喪失過(guò)多,或吸入酚.模板核酸變性不徹底.在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過(guò)程出了

13、毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改.酶失活：需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性.需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溟乙錠.引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng),是 PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌 散的常見(jiàn)原因.有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增,對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位.引物的濃度不僅要看 OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物 無(wú)條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物

14、合成單位協(xié)商解決.如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋 引物時(shí)要平衡其濃度. 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,預(yù)防屢次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏局部,導(dǎo)致引物變 質(zhì)降解失效.引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長(zhǎng)度不夠,引物之間形成二聚體等.Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性,濃度過(guò)低那么影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶.反響體積的改變：通常進(jìn)行 PCR擴(kuò)增采用的體積為 20ul、30ul、50ulo或100ul ,應(yīng)用多 大體積進(jìn) 行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul后,再做大體積時(shí),一定要模索條件,否那么容

15、易失敗.物理原因：變性對(duì) PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率.有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一.靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其 PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的.假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整潔,亮度更高.引物設(shè)計(jì)不適宜：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行 PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)

16、增出的 PCR產(chǎn)物為非目的性的序列.靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性.需重新設(shè)計(jì)引物.靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假 陽(yáng)性.這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,預(yù)防將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外. 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒.所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用. 必要時(shí),在加標(biāo)本前,反響管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸.二是空氣中的小片段核酸污染, 這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性.可互相拼接,與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,可用巢式 PCR方法來(lái)減輕或消除

17、. 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶.非特異性條帶的出現(xiàn),其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體.二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低,及 PCR循環(huán)次數(shù) 過(guò)多有關(guān).其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來(lái)源的酶易出 現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶那么不出現(xiàn),酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增.其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物.減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶.降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù).適當(dāng)提升退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93 C變性,65 c左右退火與延伸). 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片

18、狀帶或地毯樣帶.其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過(guò)高,Mg2+濃度過(guò)高,退火溫度過(guò)低,循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起.其對(duì)策有：減少酶量,或調(diào)換另一來(lái)源的酶. 減少dNTP的濃度.適當(dāng)降低 Mg2+濃度.增加模板量,減少循環(huán)次數(shù).逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反響 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR) 的原理：提取 組織或細(xì)月中的總 RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆車(chē)t錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA. 再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá) .RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性

19、提升了 幾個(gè)數(shù)量級(jí),使一些極為微量 RNA樣品分析成為可能.該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,獲取目的基因, 合成cDNA探針,構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng).Trizol法RNA提取步驟 標(biāo)記EP管,分3組 U第一組EP管參加氯仿0.2ml ,二組參加異丙醇 0.5ml ,三組參加75%乙醇1ml 01ml Trizol、心或肺50100mg、液氮依次參加到研缽中,研碎 口收集組織液1.5ml至EP管,離心：15000rmp、4C、15min u取上清,轉(zhuǎn)移至氯仿組,搖晃 15s ,冰上放置10min -L 離心：15000rmp、4C、15min取上清,轉(zhuǎn)移到異丙醇組的 EP中,冰上放置 20m

20、in -L 離心：15000rmp、4C、15min棄上清,力口 75%乙醇1油0.1%DEPC 水配制離心：15000rmp、4C、5min處理的水棄上清,枯燥15min ,力口 100ul DEPCRT-PCR引物的選擇隨機(jī)引物適用于長(zhǎng)的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAo適用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反響.主要用于單一模板的RT-PCR反響.Oligo dT適用于具有 PolyA尾巴的RNA.原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和tRNA不具有PolyA尾巴.由于Oligo dT要結(jié)合到PolyA尾巴上,所以對(duì) RNA樣品的質(zhì)量要求較高,即使有 少量降

21、解也會(huì)使全長(zhǎng)cDNA合成量大大減少.基因特異性引物與模板序列互補(bǔ)的引物,適用于目的序列的情況.天為時(shí) 性引物代公司的SuperScript One-Step System特別適合于與基因特異性引物連用.PCFT增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異 性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶.引物原因引物特異性差建議重新設(shè)計(jì)引物,改變引物的位置和長(zhǎng)度,增強(qiáng)其特異性或使用巢式 PCR引物濃度過(guò)高適當(dāng)減少引物濃度Mg2+濃度2+ .、.、Mg濃度過(guò)圖適當(dāng)降低 Mj濃度,從1mMiiJ 3mM間隔0.5mM 進(jìn)一系列反響,確定對(duì)于每個(gè)模板和引物對(duì) 的最正確鎂離子濃度.耐熱聚合酶酶量過(guò)多以0.5U

22、為間隔適當(dāng)減少酶量退火溫度退火溫度過(guò)低適當(dāng)提升退火溫度或采用二階段溫度法PCR1環(huán)次數(shù)PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多減少PCR循環(huán)次數(shù)4 .操作多份樣品時(shí),制備反響混合液,先將 dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減 少操作,預(yù)防污染,又可以增加反響的精確度；5 .最后參加反響模板,參加后蓋緊反響管電泳法定義：是指帶電荷的供試品蛋白質(zhì)、核甘酸等在惰性支持介質(zhì)如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖 凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等中,于電場(chǎng)的作用下,向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng), 使組分別離成狹窄的區(qū)帶,用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法. 電泳技術(shù)的根本原理和分類(lèi)在電場(chǎng)中,推動(dòng)帶

23、電質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)的力F等于質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量 Q與電場(chǎng)強(qiáng)度E的乘積.F=QE質(zhì)點(diǎn)的前移同樣要受到阻力F的影響,對(duì)于一個(gè)球形質(zhì)點(diǎn),服從 Stoke定律,即：F = 6 Tt r y v式中r為質(zhì)點(diǎn)半徑,刀為介質(zhì)粘度,v為質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)速度,當(dāng)質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中作穩(wěn)定 運(yùn)動(dòng)時(shí)：F = F 即QE = 6 Tt r刀丫可見(jiàn),球形質(zhì)點(diǎn)的遷移率,首先取決于自身狀態(tài),即與所帶電量成正比,與其半徑及介質(zhì)粘度 成反比.除了自身狀態(tài)的因素外,電泳體系中其它因素也影響質(zhì)點(diǎn)的電泳遷移率.電泳法可分為自由電泳無(wú)支持體及區(qū)帶電泳有支持體兩大類(lèi).前者包括Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳.區(qū)帶電泳那

24、么包括濾紙電泳常壓及高壓、薄層電泳薄膜及薄板、凝膠電泳瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠 等.自由電泳法的開(kāi)展并不迅速,由于其電泳儀構(gòu)造復(fù)雜、體積龐大,操作要求嚴(yán)格,價(jià)格昂貴等.而區(qū)帶電泳可用各種類(lèi)型的物質(zhì)作支持體,其應(yīng)用比擬廣泛. 本節(jié)僅對(duì)常用的幾種區(qū)帶電泳分別加以表達(dá). 影響電泳遷移率的因素1 .電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度是指單位長(zhǎng)度 cm的電位降,也稱(chēng)電勢(shì)梯度.如以濾紙作支持物,其兩端浸入到電極液中,電極液與濾紙交界面的紙長(zhǎng)為20cm,測(cè)得的電位降為 200V,那么電場(chǎng)強(qiáng)度為200V/20cm =10V/cm.當(dāng)電壓在 500V以下,電場(chǎng)強(qiáng)度在 2-10v/cm時(shí)為常壓電泳.電壓 在500V以上

25、,電場(chǎng)強(qiáng)度在 20-200V/cm時(shí)為高壓電泳.電場(chǎng)強(qiáng)度大,帶電質(zhì)點(diǎn)的遷移率加速, 因此省時(shí),但因產(chǎn)生大量熱量,應(yīng)配備冷卻裝置以維持恒溫.2 .溶液的pH值 溶液的pH決定被別離物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點(diǎn)的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷 量.例如蛋白質(zhì)分子,它是既有酸性基團(tuán) -COOH,又有堿性基團(tuán)-NH2的兩性電解質(zhì), 在某一溶液中所帶正負(fù)電荷相等,即分子的凈電荷等于零,此時(shí),蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中不再移動(dòng),溶液的這一 pH值為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)isoelctric point, pI.假設(shè)溶液pH處于等電點(diǎn)酸側(cè),即 p H< pl,那么蛋白質(zhì)帶正電荷,在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng).假設(shè)溶液 pH處于等電點(diǎn)堿側(cè),即 pH

26、 > pl,那么 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,向正極移動(dòng).溶液的 pH離pl越遠(yuǎn),質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多,電泳遷移率越大. 因此在電泳時(shí),應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì),選擇適宜的pH值緩沖液.3 .溶液的離子強(qiáng)度電泳液中的離子濃度增加時(shí)會(huì)引起質(zhì)點(diǎn)遷移率的降低.其原因是帶電質(zhì)點(diǎn)吸引相反符合的離子聚集其周?chē)?形成一個(gè)與運(yùn)動(dòng)質(zhì)點(diǎn)符合相反的離子氛ionic atmosphere,離子氛不僅降低質(zhì)點(diǎn)的帶電量,同時(shí)增加質(zhì)點(diǎn)前移的阻力,甚至使其不能泳動(dòng).然而離子 濃度過(guò)低,會(huì)降低緩沖液的總濃度及緩沖容量,不易維持溶液的pH值,影響質(zhì)點(diǎn)的帶電量,改變泳動(dòng)速度.離子的這種障礙效應(yīng)與其濃度和價(jià)數(shù)相關(guān).可用離子強(qiáng)度I表示.4 .電滲 在電

27、場(chǎng)作用下液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱(chēng)為電滲 electro-osmosis.其產(chǎn)生 的原因是固體支持物多孔,且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團(tuán),因此常吸附溶液中的正離子或負(fù)離子,使溶液相對(duì)帶負(fù)電或正電.如以濾紙作支持物時(shí),紙上纖維素吸附 OH-帶負(fù)電荷,與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+,帶正電荷移向負(fù)極,假設(shè)質(zhì)點(diǎn)原來(lái)在電場(chǎng)中移向負(fù)極,結(jié)果質(zhì)點(diǎn)的表現(xiàn)速度比其 固有速度要快,假設(shè)質(zhì)點(diǎn)原來(lái)移向正極,表現(xiàn)速度比其固有速度要慢,可見(jiàn)應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響.電泳分析常用方法二凝膠電泳以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱(chēng)為凝膠電泳. 其中聚丙烯酰胺凝膠電泳pol

28、yacrylamide gel electrophoresis , PAGE普遍用于別離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸.瓊脂糖凝膠孔徑較大,對(duì)一般蛋白質(zhì)不起分子篩作用,但適用于別離同工酶及其亞型,大分子核酸等應(yīng)用較廣,介紹如下：1 .瓊脂糖凝膠電泳的原理概述瓊脂糖是由瓊脂別離制備的鏈狀多糖.其結(jié)構(gòu)單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖.許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤(pán)繞形成繩狀瓊脂 糖束,構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠.因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的別離、鑒定及純化. 在臨床生化檢馬中常用于LDH、CK等同工酶的檢測(cè).2 .瓊脂糖凝膠電泳別離核酸的根本技術(shù)在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中,DN

29、A分子的電泳遷移率與其分子量的常用對(duì)數(shù)成反比；分子構(gòu)型也對(duì)遷移率有影響,如共價(jià)閉環(huán)DNA 直線DNA 開(kāi)環(huán)雙鏈 DNA o當(dāng)凝膠濃度太高時(shí),凝膠孔徑變小,環(huán)狀 DNA 球形不能進(jìn)入膠中, 相對(duì)遷移率為0,而同等大小的直線 DNA 剛性棒狀可以按長(zhǎng)軸方向前移,相對(duì)遷移率大于 0.設(shè)備與試劑：瓊脂糖凝膠電泳分為垂直及水平型兩種.其中水平型可制備低濃度瓊脂糖凝膠,而且制膠與加樣都比擬方便,故應(yīng)用比擬廣泛.核酸別離一般用連續(xù)緩沖體系,常用的有TBE 0.08mol/L Tris - HCl , pH8.5 , 0.08mol/L 硼酸,0.0024mol/L EDTA 和 THE 0.04mol/L

30、Tris - HCl o pH7.8, 0.2mol/L 醋酸鈉,0.0018mol/L EDTA.凝膠制備：用上述緩沖液配制0.5%-0.8 %瓊脂糖凝膠溶液,沸水浴或微波爐加熱使之融化,7至55c時(shí)參加澳化乙錠EB至終濃度為0.5ag/ml,然后將其注入玻璃板或有機(jī)玻璃板 組裝好的模子中,厚度依樣品濃度而定.注膠時(shí),梳齒下端距玻璃板0.5-1.0mm ,待脫凝固后,取出梳子,參加適量電極緩沖液使板膠浸沒(méi)在緩沖液下1mm處.樣品制備與加樣： 溶解于TBE或THE內(nèi)的樣品應(yīng)含指示染料0.025 %澳酚藍(lán)或桔黃橙、蔗糖10%-15%或甘油5%-10%,也可使用2.5%Fico n增加比重,使樣品

31、集中,每齒孔 可加樣5-10 11 go電泳：一般電壓為 5-15V/cm.對(duì)大分子的別離可用電壓5V/cm.電泳過(guò)程最好在低溫條件下進(jìn)行.樣品回收：電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察樣品的別離情況,對(duì)需要的DNA分子或特殊片段可從電泳后的凝膠中以不同的方法進(jìn)行回收,如電泳洗脫法：在紫外燈下切取含核酸區(qū)帶的凝膠,將其裝入透析袋內(nèi)含適量新鮮電泳緩沖液,扎緊透析袋后,平放在水平型電泳槽兩電極之間的淺層緩沖液中,100V電泳2-3小時(shí),然后正負(fù)電極交換,反向電泳2分鐘,使透析袋上的DNA釋放出來(lái).吸出含 DNA的溶液,進(jìn)行酚抽提、乙醇沉淀等步驟即可完成樣品的回收.廢棄澳化乙錠EB凈化和處理方法1嚴(yán)禁隨便丟棄.

32、由于EB是強(qiáng)致癌性,而且易揮發(fā),揮發(fā)至空氣中,危害很大.2 廢EB溶液的處理方法（1） 對(duì)于EB含量大于0.5mg/ml的溶液,可如下處理：a. 將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/ml ；b. 參加一倍體積的 0.5mol/L KMnO4 ,混勻,再參加等量的 25mol/L HCl,混勻,置室溫 數(shù)小時(shí)；c. 參加一倍體積的2.5mol/L NaOH混勻并廢棄.（2） EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下處理：a. 按1mg/ml的量參加活性炭,不時(shí)輕搖混勻,室溫放置1小時(shí)；b.用濾紙過(guò)濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄.3廢EB接觸物,如抹布,槍頭.一般回收至黑色的玻璃瓶中,定期進(jìn)行燃

33、燒處理.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析凝膠電泳分瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種一、瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常用的別離純化和鑒定核酸的方法.瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物.根據(jù)瓊脂糖的溶解溫度,把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖 .低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為 6265C,溶解后在37 c下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí),主要用于DNA片段的回收,質(zhì)粒與外源性 DNA的快速連接等.一凝膠濃度凝膠濃度的選擇依 DNA分子的大小而定.瓊脂糖凝膠的濃度與 DNA別離范圍瓊脂糖濃度線型DNA分子的別離范圍(Kb)0.35600.61-200.70.8 100.90.5 71.20.9 6

34、1.50.2 312.00.1 2二電泳緩沖液核酸電泳緩沖液有三種,即 Tris-硼酸TBE、Tris-乙酸TAE和Tris-磷酸TPE.TBE 與T PE緩沖容量高,DNA別離效果好,但 TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高,容易使 DNA沉淀. TAE緩沖容量低,但價(jià)格較廉價(jià),因而推薦選用TBE.緩沖液中的EDTA可螯合二價(jià)陽(yáng)離子,從而 抑制DNA酶的活性,預(yù)防 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解.10XTBE緩沖液的配制Tris 磴,108 克EDTA, 9.3 克硼酸,55克H2O 至,1000ul其PH應(yīng)為8.08.2臨用時(shí)用水稀至 0.5XTBE20倍稀釋.三核酸電泳的指示劑與染色劑1 .指示劑

35、：核酸電泳常用的指示劑有澳酚蘭和二甲苯青及銀染色.澳酚蘭在堿性液體中 呈紫蘭色,在0.6%、1% 1.4%和2湎脂糖凝膠電泳中,澳酚蘭的遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性 DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈蘭色, 它在1%和1.4%瓊脂糖中電 泳時(shí),其遷移速率分別與 2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似.指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液.載樣緩沖液的作用 有增加樣 品密 度,使其比重增加, 以保證DNA均勻沉入加樣孔內(nèi).在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的指 示帶,可預(yù)測(cè) 核酸電泳的速度和位置.使樣品呈色,使加樣操作更方便 .染色劑：核酸電泳后,需

36、經(jīng)染色后才能顯現(xiàn)出帶型,最常用的是 澳化乙錠染色法,其 次是銀染色.澳化乙錠ethidium bromide, EB是一種熒光染料,EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間,在紫外線激發(fā)下,發(fā)出紅色熒光.根據(jù)情況可在凝膠電泳液中參加終濃度為0.5ug/ml的EB,有時(shí)亦可在電泳后,將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min.瓊脂 糖凝膠EB染色,肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶,其 DNA量一般5ng,當(dāng)澳化乙錠太多,凝膠染色過(guò)深,核酸電泳帶看不清時(shí),可將凝膠放入蒸儲(chǔ)水浸泡 30min后再觀察.銀染色：銀染色液中的銀離子Ag+可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物,然后用復(fù)原劑如甲醛使Ag+復(fù)原成銀顆粒,可把核酸電泳帶染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰月凝膠電泳染色.也用于瓊脂糖凝膠染色.其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后,DNA宜回收.四電泳2 .電泳裝置：電泳裝置主要有電泳儀,電泳槽及灌膠模具等3 .電泳方法：1用蒸儲(chǔ)水將電泳槽和梳子沖洗干凈.放在水平桌面上,并架好梳子.2根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠,一般200400bp的DNA片段,可配制1.21.7%濃度的瓊脂糖用于電泳 .4 .配制0.5X