EDU細胞增殖檢測

1、熒光顯微鏡檢測方法（以96孔板，A549貼壁細胞為例）細胞培養(yǎng)取對數(shù)生長期細胞，以每孔4><1031><105細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段。藥物處理（可選）客戶可以根據(jù)實驗需要進行各種藥物處理。EdU標(biāo)記1.1用細胞培養(yǎng)基按1000: 1的比例稀釋EdU溶液（試劑A）,制備適量50必EdU培養(yǎng)注：1）EdU濃度與孵育時間相關(guān)，短時間孵育（<2h）宜采用高濃度（1050皿），長時間孵育（>24h）宜采用低濃度（110刀）;2）如果需配置10 MM EdU培養(yǎng)基，需調(diào)整為5000 : 1稀釋比例；3）配置好的培養(yǎng)基的保存時間取決于培養(yǎng)基的性質(zhì)。表1

2、EdU培養(yǎng)基及染色反應(yīng)液的使用量參考96孔板*48孔板24孔板12孔板6孔板5.5 cm 小皿EdU培養(yǎng) 基100 M150 4200 pl300 4500 M2 mL染色反應(yīng)液100 M150 4200 pl300 4500 M2 mL注：1）*表示貼壁細胞通常采用的培養(yǎng)容器，EdU培養(yǎng)基與染色反應(yīng)液用量以覆蓋細胞為宜；2）懸浮細胞EdU用量依據(jù)培養(yǎng)體積而定。1.2 每孔加入100 L 50 M EdU培養(yǎng)基孵育2小時，棄培養(yǎng)基；注：1）最佳孵育時間與細胞周期相關(guān) （表2）,大多數(shù)細胞系均可采用 2小時孵育時間；2）EdU培養(yǎng)基用量以沒過細胞為宜，但需要保證EdU孵育時間內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)供給

3、俵1）；1.3 PBS清洗細胞12次，每次5分鐘。注：清洗目的是將未滲入DNA的EdU洗脫，清洗方式依據(jù)不同的細胞類型而定，貼壁不牢的細胞請降低清洗強度。表2 EdU孵育時間設(shè)定參考3T3HelaHEK293*細胞系人胚胎細胞酵母細胞人成纖維細 胞人宮頸癌細 胞人胚腎細胞系人神經(jīng)細胞細胞周期30min3h18h21h25h5d孵育時間5min20min2h2h2h1d注：1)EdU孵育時間取決于細胞周期，一般為細胞周期的1/10至1/5,但大多數(shù)細胞系均可采用2h孵育時間。孵育時間越長，細胞增殖數(shù)量就越多；2)*考慮到細胞培養(yǎng)基、溫度、濕度、光線等其他因素的影響，具體實驗的細胞 群體細胞周期會

4、有所變化。表3細胞實驗EdU孵育濃度及時間參考PubMedIDReferenceCell lineConcentrationTime18272492Salic A, et al. PNAS . 2008NIH3T3, Hela10 nM10 gM1 hr18521918Cappella P, et al. Cytometry A . 2008HL-60,A2780,U2OS110 gM30 min18996411Chehrehasa F, et al. J Neurosci Methods . 2009Neurospheres120 gM24 hr19179371Limsirichaikul

5、S, et al. Nucleic Acids Res. 2009Primary fibroblasts10 Wl1,2,4 hr19253396Warren M, et al. Dev Dyn . 2009Chick embryos10 Wl2 mM4 hr19647746Yu Y, et al. J Immunol Methods . 2009Spleen cells50 Wl24 hr19544417Momcilovi ? O, et al. Stem Cells . 2009Human ES cells10 Wl30 min20080700Cinquin O, et al. PNAS

6、. 2010emb-301川12 hr20025889Han W, et al. Life Sci . 2009VSMC50 Wl2 hr20659708Huang C, et al. J Genet Genomics . 2010ESC50 Wl2 hr21310713Hua H, et al. Nucleic Acids Res . 2011fissionyeaststrains10 Wl3 hr20824490Lv L, et al. Mol Cell Biochem . 2011EJ cells50 Wl4hr21248284Yang S, et al. Biol Reprod . 2

7、011GC cells50 Wl2 hr21227924Zhang YW, et al. Nucleic Acids Res . 2011U2OS, HT2930 Wl90 min21829621Guo T, et al. PloS One . 2011HIT-T1550 Wl4hr21980430Zeng T, et al. PloS One . 2011MCF-10A25 Wl2hr22012572Ding D, et al. Int Orthop . 2011C3H10T1/210Wl24hr22000787Zeng W, et al. Biomaterials . 2011EPC50W

8、l4hr21913215Xue Z, et al. J Cell Biochem . 2011SGC790125Wl24hr22016038Peng F, et al. Lasers Med Sci . 2011MSC50Wl2hr21878637Li D, et al. J Biol Chem . 2011HCC50Wl2hr注：如果您有采用 BrdU進行實驗的經(jīng)驗，可以參照 BrdU實驗的相關(guān)參數(shù)進行 EdU實驗。 細胞固定化2.1 每孔加入50山細胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS）室溫孵育30分鐘，棄固定液；注：1）低濃度的多聚甲醛有利于細胞結(jié)構(gòu)的保持，當(dāng)需要抗體染色時，需采用Trit

9、on X-100透化細胞以利于抗體進入細胞內(nèi)。2）可采用其他方式進行細胞固定。2.2 每孔加入50山2 mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育 5分鐘后，棄甘氨酸溶液；注：目的是中和多聚甲醛，保證染色反應(yīng)體系，當(dāng)采用其他方式進行細胞固定時可酌情省略此步驟；2.3 每孔加入100 L PBS ,脫色搖床清洗5分鐘，棄PBS;2.4 （加強）每孔加入100 L-滲透劑（0.5% TritonX-100的PBS）脫色搖床孵育10分鐘；PBS清 洗1次，5分鐘。注：當(dāng)實驗需要進行其他抗體染色時，或由于某些細胞類型對染料的吸附性較高，可能需要增強細胞膜通透性。普通細胞可以省略。Apollo染色3.1 每孔加入1

10、00 -的1X Apollo ?染色反應(yīng)液（表3）,避光、室溫、脫色搖床孵育30分鐘后，棄染色反應(yīng)液；注：1）染色液用量與細胞量相關(guān)，以覆蓋細胞為宜（表1）;2）孵育時間可以進行適當(dāng)調(diào)整，調(diào)整范圍為1030分鐘。表4 Apollo ?染色反應(yīng)液的配置參考 （現(xiàn)用現(xiàn)配）配制順序Apollo ?染色反應(yīng)液500 pL*1 mL5 mL10 mL1去離子水469仄938仄4.69 mL9.38 mL2Apollo?反應(yīng)緩沖液（試劑B）25 L50 n250 L500仄3Apollo?催化劑溶液（試劑C）5 L10 n50 L100仄4Apollo ?熒光染料溶液 （試劑D）1.5仄3 L15 L30

11、人5Apollo ?緩沖添加劑（試劑E）5 mg9 mg44 mg88 mg注：1）*表示通常配制的 Apollo ?反應(yīng)液的體積足以進行 510個孔（96孔板）染色；2）按順序配制適量1X Apollo ?染色反應(yīng)液，以免破壞正常的反應(yīng)體系（現(xiàn)用現(xiàn)配，30分鐘用完）；3）試劑E為白色粉末，較易氧化，使用后請旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需 更換；粉末較難準(zhǔn)確稱量，稱量誤差范圍可稍微放寬，但不應(yīng)超過及0%。3.2 加入100山滲透劑（0.5% TritonX-100的PBS）脫色搖床清洗23次，每次10分鐘， 棄滲透劑；3.3 （加強）每孔每次加入100山甲醇清洗12次，每次5分鐘；PBS清洗

12、1次，每次5分鐘。注：由于某些細胞對染料的吸附性較高，需采用加強方式洗脫以降低染料背景。普通實驗可以省略。DNA染色4.1 用去離子水按100: 1的比例稀釋試劑 F,制備適量1X Hoechst33342反應(yīng)液，避光保 存；4.2 每孔加入100 L 1X Hoechst 33342 反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30分鐘后，棄染色反應(yīng)液；4.3 每孔每次加入100山PBS清洗13次；4.4 客戶可選擇進行其他染色步驟，否則每孔加入100山PBS保存待用。其他染色（自備）（可選）客戶可以根據(jù)實驗需要進行細胞表面或細胞內(nèi)抗原的抗體染色（注：染料兼容性請參照表4）。 圖像獲取及分析建議染色完成后立即進行觀測；如果條件限制，請避光4C濕潤保存待測，但不應(yīng)超過3天。注：調(diào)試儀器時，請將曝光時間調(diào)整為30ms左右，盡量不要1s。表5配套染料的相關(guān)波長信息C00