蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

1、蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定一紫外吸收法1. 近紫外吸收光譜法( 280 nm)原理：蛋白質(zhì)中含有色氨酸與酪氨酸殘基， 這兩種氨基酸殘基具有吸收紫外光的 性質(zhì)，它們的紫外光吸收譜峰值在 280 nm 附近。某些蛋白質(zhì)含有二硫鍵，也會(huì) 在 280 nm 附近吸收紫外光。近紫外吸收法就是根據(jù)這個(gè)性質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定 量。因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)中所含有的色氨酸與酪氨酸的數(shù)量存在很大的差異， 所以 蛋白質(zhì)在280 nm處的吸光度A280也存在非常大的差異。比如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為 1 mg/ml時(shí)，吸光度A280可為0-4之間的任何值。但是，大部分的蛋白質(zhì)的吸光 度A280時(shí)0.5-1.5之間的某個(gè)值。該方法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃

2、度具有明顯的優(yōu)缺點(diǎn)。這種方法操作簡(jiǎn)單，測(cè)定完成后， 樣品可以被回收， 對(duì) buffer 沒(méi)有特殊要求， 這是該方法的優(yōu)點(diǎn)。 該方法的缺點(diǎn)是： 其他的生色基團(tuán)會(huì)影響蛋白質(zhì)吸收光譜的測(cè)定， 比如核酸在該波長(zhǎng)的紫外吸收能 力非常強(qiáng)， 少量的核酸就會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)吸光值的測(cè)定造成很大的干擾。 同時(shí)，不同 的蛋白質(zhì)的消光系數(shù)需要在實(shí)驗(yàn)前確定。蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算：朗伯比爾定律：A(absorbanee) =£,因此：c (mg/ml) = A/ £ l (cm)消光系數(shù)：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為1 mg/ml,光徑為1 cm時(shí)，所測(cè)得的吸收值為該蛋白 質(zhì)的消光系數(shù)。蛋白質(zhì)的消光系數(shù)計(jì)算公式：A280 (

3、1 mg/mL) = (5690n w + 128Ony + 120nc)/M。其 中 M 為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量， 5690、1280與 120分別是色氨酸、酪氨酸與半胱氨酸 的消光系數(shù)， n 是該氨基酸殘基的數(shù)目。2. 遠(yuǎn)紫外吸收光譜法在 190-210 nm 范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)中的肽鍵具有非常強(qiáng)的吸收紫外光的能力。此波 長(zhǎng)范圍內(nèi)，肽鍵在 190 nm 處的吸收值是其在 205 nm 的 2 倍，而且在 190 nm， 氧氣對(duì)紫外光的吸收非常強(qiáng)，因此，通常取 205 nm 處的吸收值對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定 量。對(duì)于 1 mg/ml 的蛋白質(zhì)溶液，它們的消光系數(shù)通常在 30-35 之間。對(duì)于不同 的蛋白質(zhì)，其

4、消光系數(shù)差別很小。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，樣品可以回收。缺點(diǎn)：在使用前，必須對(duì) 分光光度計(jì)進(jìn)行準(zhǔn)確校正，多種 buffer，heme or pyridoxal groups 在該波長(zhǎng)具有 很強(qiáng)的吸收紫外光的能力。測(cè)定：1. 用生理鹽水溶解蛋白質(zhì)樣品，確保其在 215 nm 處的吸收值小于 1.5。2. 磷酸鉀 buffer 不影響吸收值的測(cè)定。3. 計(jì)算公式：A2051 mg/mL = 27 + 120 (A280/A205)或 Protein concentration ( g/mL)=144 (A215 A225)。Notes:1. 使用這兩個(gè)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量時(shí)，最佳的吸收值范

5、圍為0.05-1，當(dāng)吸收值為 0.3時(shí)，測(cè)定的結(jié)果最精確。2. 如果樣品渾濁，可以扣除310 nm處的吸收值。3. 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度很低時(shí)，蛋白質(zhì)可能會(huì)吸附在石英杯內(nèi)壁，從而影響蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定，在溶液中提高離子強(qiáng)度或者添加非離子型去垢劑可以防止這種現(xiàn) 象的發(fā)生。4. 1 mg/ml的BSA的吸收值為0.06，通常作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。5. 當(dāng)溶液中存在核酸時(shí)，可以用下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度：Protein (mg/mL) = (A235 A280)/2.51Protein (mg/mL) = (A235 -A280)/2.51Protein (mg/mL) = 0.183 A230 -0.0758 A2

6、606. 當(dāng)吸收值小于2時(shí)，在215 nm處測(cè)定的吸收值符合朗伯比爾定律。7. 在 215 nm處進(jìn)行測(cè)定時(shí)，sodium chloride, ammonium sulfate, borate, phosphate,and Tris 不會(huì)影響吸收值的測(cè)定，但是0.1 M acetate, succinate, citrate,phthalate, and barbiturate 具有很強(qiáng)的吸收值。8. 在pH 4-8的范圍內(nèi)，2154225 nm的吸收值沒(méi)有變化。9. 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中存在核酸時(shí)，也可以這樣計(jì)算：protein concentration (in mg/ml) =Fx A!80 (a

7、ssuming the cuvette is 1 cm wide).frpflrfjon atnudeic占岡崗t 75 1帕1.521 4013*1 30)251和1 WTO30 9790 9390 G7J0的血0即20 80J0 78J0.76 7 0 7520 7300.705 06H 0 6440 6150則加舄.50.75.OO.2B.50.DO.M.00.M.0O.0D5O0O5D0O5D.0D0O0D0G.0D0D0D0O.O.O1 22334 556.6.F<7.8.9.o.2.i.7.>0._i -1 1 11 1161.0611.054 1023 0 W4 0.

8、970 <1944 (1葫g 0 852 OB14 0 776 0 743OM52 0 6Sf) 0 63； 0 6070.5*5 0b45 0.506 0.473 0 422 0.377 0.322 0218Lowry法與BCA法Lowry法與BCA法測(cè)定蛋白的濃度的原理包括兩個(gè)步驟。第一步，基于雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中，肽鍵中的N原子結(jié)合二價(jià)銅離子,將Cu2+還原成Cu+，并形成一種銅離子絡(luò)合物，反應(yīng)后的溶液呈紫色，溶液在540nm處有明顯的吸收峰，根據(jù)朗伯比爾定律，可以測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。HComplex fwmed雙縮脲反應(yīng)但是，直接測(cè)定肽鍵與銅離子絡(luò)合物的吸收值靈敏度低， 所以通

9、常繼續(xù)進(jìn)行第二 步反應(yīng)增加靈敏度。在Lowry法中，Cu+在第二步反應(yīng)中會(huì)與Folin -酚試劑反應(yīng) 該試劑是一種鉬磷酸鹽與磷鎢酸鹽的混合物。反應(yīng)的本質(zhì)是 Mo6+還原成鉬藍(lán)(Mo4+)，此反應(yīng)依賴于Cu+催化的芳香族氨基酸(酪氨酸與色氨酸)的氧化。 因此，與近紫外吸收光譜法一樣，Lowry法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度也只是一個(gè)近似值， 不同的蛋白質(zhì)所含有的色氨酸與酪氨酸數(shù)目的差異會(huì)導(dǎo)致所測(cè)濃度值存在誤差。實(shí)驗(yàn)材料:1. 絡(luò)合物生成試劑：在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，以100:1:1的體積比混合下列溶液溶液 A: 2% (w/v) NqCO3；溶液 B: 1% (w/v) CuSQ 52O;溶液C: 2% (w/v)H

10、石酸鉀。2. 2 M NaQH。3. Folin試劑。使用時(shí)為1當(dāng)量濃度（N）4.標(biāo)準(zhǔn)：將2 mg/ml的BSA按照下表進(jìn)行稀釋。Stock solulion (pj_)02,5512.52550125250500Waler (pL)50()4984954林4754503752500Protein cone.伽 mL)010205010020050010002000方法：1. 取0.1 ml樣品溶液或者標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入 0.1 ml 1 M氫氧化鈉，在100 C水解 反應(yīng)10分鐘。2. 冷卻水解產(chǎn)物至室溫，加入1 ml新鮮混合的絡(luò)合物生成試劑，混勻后室溫靜 置10分鐘。3. 加入0.1 ml F

11、olin酚試劑，迅速震蕩混勻，室溫靜置 30-60分鐘，不要超過(guò) 60分鐘。4. 當(dāng)?shù)鞍诐舛刃∮?.5 mg/ml時(shí)，讀取750 nm處吸收值。當(dāng)?shù)鞍诐舛?0.1-2.0 mg/ml時(shí)，讀取550 nm處吸收值。5. 繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度曲線，根據(jù)比對(duì)此曲線吸收值對(duì)應(yīng)的濃度，確定位置蛋白 質(zhì)的濃度。Notes:1. 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品以沉淀存在時(shí)，用 2 M氫氧化鈉溶液溶解樣品，然后按照步驟一進(jìn)行水解。然后取0.2 ml水解產(chǎn)物進(jìn)入步驟二2. 全細(xì)胞 或復(fù)合物樣品需要 預(yù)處 理。 處理 方法見(jiàn) The Protein ProtocolsHandbook, second edition, Page 29.

12、3. 確保水解反應(yīng)在 pH 10-10.5 。4. 反應(yīng)孵育時(shí)間可以從 10 分鐘到幾個(gè)小時(shí)，影響不大。5. 渦旋振蕩步驟是該方法可重復(fù)的關(guān)鍵。 因?yàn)?Folin 酚試劑很容易失效， 因此加 入后要迅速充分的震蕩混勻。6. 高濃度時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線可能不是線性的， 因此最佳測(cè)定范圍： 0.01-1 mg/ml 。7. 因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)所含有的色氨酸與酪氨酸的數(shù)目不同， 為了濃度的準(zhǔn)確性， 可以采用多種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液繪制曲線，求得多個(gè)濃度值，最后取平均濃度 值。8. Buffer，藥物，還原糖，核酸等物質(zhì)都會(huì)干擾蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。9. 分兩次加入 Folin 酚試劑，每次加入后充分混勻，可以提高 2

13、0%的靈敏度。加 入 Folin 酚試劑后 3 分鐘時(shí)加入二硫蘇糖醇，可以將反應(yīng)靈敏度提高 50%。10. 升高溫度可以加快反應(yīng)的進(jìn)行，對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響不大。與 Lowry 法一致， BCA 法基于二價(jià)銅離子還原成一價(jià)銅離子的反應(yīng)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。第二步，每?jī)煞肿拥腂CA螯合一分子一價(jià)銅離子，形成在562 nm具有 強(qiáng)吸收峰的紫色復(fù)合物。 此反應(yīng)依賴于半胱氨酸、 胱氨酸、酪氨酸與色氨酸側(cè)鏈， 高溫下肽鍵可以參與銅離子的還原， 因此高溫反應(yīng)可以降低不同蛋白質(zhì)之間因氨 基酸組成差異而造成的結(jié)果差異。與 Folin試劑相比較，BCA在堿性條件下很穩(wěn) 定，也沒(méi)有那么容易受到其他物質(zhì)的干擾，因此，BCA法

14、目前基本上取代了 Lowry實(shí)驗(yàn)材料標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)：試劑 A: sodium bicinchoninate (0.1 g), Na2CO3 H2O (2.0 g), sodium tartrate (dihydrate) (0.16 g), NaOH (0.4 g), NaHCO3 (0.95 g), made up to 100 mL. If necessary, adjust the pH to 11.25 with NaHCO3 or NaOH 。試劑 B： Reage nt B: CuSO4 5H2O (0.4 g) in 10 mL of waterSta ndard worki ng r

15、eage nt (SWR):混合 100 體積 rege nt A 與 2 體積 reage nt B.溶液呈蘋(píng)果綠色，室溫下可以穩(wěn)定保存 1 周。微量測(cè)定：Reage nt A: Na2CO3 H2O (0.8 g), NaOH (1.6 g), sodium tartrate (dihydrate) (1.6 g), made up to 100 mL with water, and adjusted to pH 11.25 with 10 M NaOH. Reagent B: BCA (4.0 g) in 100 mL of water.Reage nt C: CuSO4 5H2O (0

16、.4 g) in 10 mL of water.Standard working reagent (SWR): Mix 1 vol of reagent C with 25 vol of reagent B, then add 26 vol of reagent A.方法：見(jiàn) The Protein Protocols Handbook, Page 31 。Notes:Table 1Effect of Selected Potential Interfering Compounds3Sample (50 USA) in Ihc R>lingBCA(憾 USA found)Lowry(pg

17、 BSA found)Water blank corrsrctcdInierfcrcncc blank correctedWutcr blank correctedImcrfbrencc blank torrccicd50 陛 HSA m wulcr trcikrcnco50.0050.000,1 VHC150,7050. KO44,2043, SOQJ VNaOH49.0049.4050.6050.600.2% Sodium azide5L1050.9049.2049.000.02" u Sodium azide51.)051.0049.5049.601,( A/ Sodium c

18、hloride5L3O5U050,2050,10100 mWEDTA (4 Na)No color138.505J050 mM EOT A (4 Na)28.0029.4096.7010LDTA (4 Na)4KH049.1033.60J2.7O50 mW EDTA (4 Na). pH 11.253L5O32.8072.305.004.0 M Guanidint; HCL4K3046.90Precipitated3,0 5/Urea513050053.2045 00L0%Triton X-10050.2049.80Precipitatedl,O%SDSaHuryl)49,2048.90Prc

19、cipitaied1.0% Brij 355 LOU50.90Preci pilaledLQ% Lubml50.7050,70卩 recipitated1,0% Chaps4Q904 50PrecipitatodL0% Chapsu5LS051.00Precipitated1.0% Oclyl gLueusidc50.905D.M0Precipitated40.0% Sucrose55,404S.7O4.9028.9010.(1% Sucrose52.5050.5<l42 Q041 io1.0% Sucrose513051.204S.4048.10100Glucose245.0057.106H.1061.7050 m1 Glucose144.0047,70b2.7O5K.4010 mV CilucGse70,0049 1052.6051.200,2 W Sorbitol42.9037.8063.703,000.2 M Sorbitol. pH 11,2540.7036 206K6026.601.0 M GlycineNo color7307,70I.OjW Glycine. pH H50.704S9032.5027.900*5 M Tris36.20迄9010 20$,800.25 A/ Tris46.6014 0027 9028J00J Af Tris50.R049.