微生物限檢驗(yàn)操作規(guī)程版

1、1目的規(guī)范微生物限度檢驗(yàn)操作，確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠2依據(jù) 中國藥典2015版。3范圍 本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物限度檢驗(yàn)。4責(zé)任 中心化驗(yàn)室負(fù)責(zé)人：對本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。中心化驗(yàn)室檢驗(yàn)人員：嚴(yán)格按照本規(guī)程執(zhí)行檢驗(yàn)操作5程序5.1執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn) ：中國藥典2015版。5.2抽樣 ：照取樣標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行6內(nèi)容6.1需氧菌總數(shù)、 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（MPN法）。檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。6.1.1設(shè)備、儀器及用具6.1.1.1設(shè)備微生物限度檢測室、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱（3035C）、生化培養(yǎng)箱（2025C）、 電熱恒溫

2、水浴鍋、烘箱、脈動真空滅菌柜、紫外燈等。6.1.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、移液槍及吸頭、薄 膜過濾器等。6.1.1.3用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.1.2試液6.1.2.1消毒液A0.1%新潔爾滅溶液B.75聽醇溶液6.1.2.2稀釋液、試劑及配制A.pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液：取磷酸二氫鉀3.56g、無水磷酸氫二鈉5.77g、 氯化鈉4.3g、蛋白胨1.0g，加純化水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，121C滅菌15分鐘。

3、B.聚山梨酯80C.無菌十四烷酸異丙酯D. pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液6.1.3培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基6.1.4操作方法6.1.4.1試驗(yàn)前準(zhǔn)備6.1.4.1.1將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、試管、移液槍吸頭（1ml、10ml）、 量筒、稀釋液、培養(yǎng)基等移至傳遞窗內(nèi)。 每次試驗(yàn)所用物品必須事先計(jì)劃， 準(zhǔn)備足夠用量， 避免操作中出入操作間。6.1.4.1.2開啟微生物檢測室紫外燈和空調(diào)凈化系統(tǒng)，并使其工作不低于30min。6.1.4.1.3操作人員進(jìn)入一更，用洗手液或肥皂洗手， 烘干。進(jìn)入二更， 用0.1%新潔爾 滅溶液洗手，穿戴潔凈無菌服、

4、口罩、手套。6.1.4.1.4操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處 周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或剪將供試品啟封。6.1.4.2供試液的制備根據(jù)供試品的理化特征與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需 加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45C。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立其他 適宜的方法。6.1.4.2.1水溶性供試試品取供試品，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋 制成1:10供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6&必要時(shí)，

5、用同一稀釋液將供試液進(jìn) 一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。6.1.4.2.2水不溶性非油脂類供試品取供試品，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋 制成1:10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至68。必要時(shí)，用同一稀釋 液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。6.1.4.2.3油脂類供試品取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌 聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40C（特殊

6、情況下，最多不超過45C）,小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加入預(yù) 熱的稀釋液使成1:10供試液，保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。6.1.4.2.4腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g，加入pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液，置45C水浴中，振搖，使溶解，制成1:10的供試液。6.1.4.3供試液的稀釋取1:10均勻供試液1ml,加入裝有9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中混勻， 即為1:100供試液。以此類推， 根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1:1000、1:10000等適宜稀 釋級。每遞增1稀釋劑，必須另換一支吸管。6.1.4.4檢查法6.1.4.4.1檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所

7、用的供試品量（g、ml、cm2）。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml;膜劑為100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品。6.1.4.4.2平皿法6.1 .4.4.2.1取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液的制備和菌數(shù) 測定，每稀釋級每種培養(yǎng)至少制備2個(gè)平板。6.1.4.4.2.2陰性對照 以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對照試驗(yàn)，陰性對照試驗(yàn)應(yīng)無菌 生長。如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。6.1.4.4.2.3傾注培養(yǎng)基將預(yù)先配制好的培養(yǎng)

8、基 （需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基， 霉菌和酵母菌總 數(shù)計(jì)數(shù)用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基） 熔化，置45。C水浴中，備用。將45。C左右的瓊脂傾注上 述各個(gè)平皿約15ml，以順時(shí)針或反時(shí)針方向快速轉(zhuǎn)動平皿 （勿使培養(yǎng)基溢出）使供試液與 培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。6.1.4.4.2.4培養(yǎng)和計(jì)數(shù)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)平板倒置于3035C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35天。 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù) 平板倒置于2025C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，必要時(shí)可延長至7天。觀察菌落生長情況，點(diǎn) 計(jì)平板上生長的所有菌落數(shù)， 計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計(jì)數(shù)。 點(diǎn)計(jì)菌落 數(shù)后，計(jì)算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)， 按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。

9、 若同稀釋級兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上6.1 .4.4.2.5菌數(shù)報(bào)告規(guī)則需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜 選取平均菌數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)，計(jì)算1g、1ml或10cm2供試品中所含的微生物，取兩位有效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級的平板均無菌落生長， 或僅最低稀釋級的平板有菌落生長， 但平均菌落數(shù) 小于1時(shí)，以V1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。6.1.4.4.3薄膜過濾法6.14431薄膜過濾法所采用濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45卩m直徑約為50mm若采用其他直徑的濾膜，沖洗量

10、應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微 生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。 使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過 濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品， 其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。 為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率， 應(yīng)注意保持供試品溶 液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。 供試液經(jīng)薄膜過濾后， 若需要沖洗液沖洗濾膜， 每張濾膜 每次沖洗量為100ml。總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。6.1.4.4.3.2取相當(dāng)于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)

11、，可取適宜稀釋級的供試液1ml,過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪 大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。 濾膜 貼于平板上是不得有空隙或氣泡，否則影響微生物的生長。6.1.4.4.3.3陰性對照 取試驗(yàn)用的稀釋液1ml照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。 陰性對照不得有菌生長。6.1.4.4.3.4培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。6.1.4.4.3.5菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌 落生長，以1報(bào)告菌

12、數(shù)（每張濾膜過濾1g或1ml供試品），或1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào) 告菌數(shù)。6.144.4MPN法MPN法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過濾法和平皿法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適 宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用霉菌計(jì)數(shù)。取供試液至少3個(gè)連續(xù)稀級，每一稀釋級取3份1ml分別接種至3管裝有910ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置3035C培養(yǎng)3天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試品的原 因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培 養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)12天，觀察是否有微生物生長。根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表1

13、查被測供試品每1g或1ml中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。表1微生物最可能數(shù)檢索表生長管數(shù)需氧菌總數(shù)最可能數(shù)95%置信限每管含樣品的g或ml數(shù)MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000103+一102vNv103+一一10vNv102一一一Nv10注：（1） +代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長；一代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上無菌落生 長。（2）若供試品量減少 10 倍（0.01g 或 0.01ml，0.001g 或 0.001ml，0.0001g 或 0.0001ml ），則每 1g （或 1ml）供試品中可能的菌數(shù)（N）應(yīng)相應(yīng)增加 10 倍。6.4沙門菌6.4.1設(shè)備、儀器及用具6

14、.4.1.1設(shè)備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱(30-35C)、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.4.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注 射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.4.1.3用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅 菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.4.2試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.4.3培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫

15、氧酸鹽瓊脂培養(yǎng) 基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基等。6.4.4操作方法6.4.4.1供試液制備和增菌培養(yǎng) 取10g或10ml供試品直接或處理后接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定)的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035E培養(yǎng)1824小時(shí)。6.4.4.2選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，3035C培養(yǎng)2448小時(shí)。取少量RV沙門增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧 膽酸鹽瓊脂培 養(yǎng)基 平板上，3035E培養(yǎng)1848小時(shí)。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、 中心有或無黑色。 用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培

16、養(yǎng)基高層斜面上 進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1848小時(shí)，或采用基他適宜方法進(jìn)一步鑒定。6.4.4.3結(jié)果判斷 若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生 長但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃 色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。6.5銅綠假單胞菌6.5.1設(shè)備、儀器及用具6.5.1.1設(shè)備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱(30-35C)、電熱恒

17、溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.5.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注 射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.5.1.3用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅 菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.5.2試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.5.3培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基等。6.5.4操作方法6.5.4.1供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“”制成1：10供試液。取相當(dāng)于 或1ml供試

18、液，接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定)的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中， 混勻，在3035E培養(yǎng)1824小時(shí)。6.5.4.2選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035C培養(yǎng)1872小時(shí)。取上述平板上生長的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定。6.5.4.3氧化酶試驗(yàn) 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落 涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸N，N二-甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng) 物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。6.5.4.4結(jié)果判斷 若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，且氧化酶試 驗(yàn)陽

19、性， 應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為銅綠假單胞菌。如果平板上沒有菌落 生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗(yàn)陰性， 判供試品未檢出銅綠假單 胞菌。1g6.6金黃色葡萄球菌6.6.1設(shè)備、儀器及用具6.6.1.1設(shè)備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱(30-35C)、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.6.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注 射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.6.1.3用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅 菌剪刀、滅菌鑷

20、子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.6.2試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.6.3培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基等。6.6.4操作方法6.6.4.1供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“”制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1ml供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中， 混勻。在3035C培養(yǎng)1824小時(shí)。6.6.4.2選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化納瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035T培養(yǎng)1872小時(shí)。6.6.4.3結(jié)果判斷 若甘露醇氯化納瓊脂培養(yǎng)基平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白 色菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn)， 確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板 上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長， 或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結(jié)果 為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。6.7白色念珠菌6.7.1設(shè)備、儀器及用具6.7.1.1設(shè)備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、電熱恒溫水浴鍋、 烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.7.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、