參附注射液對(duì)肝缺血再灌注大鼠血漿前列環(huán)素和血栓素A2及肝組織ATP酶的影響

1、參附注射液對(duì)肝缺血再灌注大鼠血漿前列環(huán)素和血栓素A2及肝組織ATP酶的影響作者：彭松林，顧璽，戴朝六，黃勇，趙陽(yáng)【關(guān)鍵詞】缺血再灌注損傷；血栓素A2；前列環(huán)素；川Ki ATP酶；02+虺2+ AT卩酶肝臟缺血再灌注損傷是肝切除、嚴(yán)重肝外傷以及肝臟移植手術(shù)中經(jīng)常遇到 的問(wèn)題和導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭的重要原因。研究表明缺血再灌注導(dǎo)致肝臟損傷的機(jī)制與細(xì)胞能量代謝障礙、線粒體功能受損、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基產(chǎn)生、一 些細(xì)胞因子的合成與釋放等有關(guān)。 參附注射液由人參、附子提取物組成，其有效 成分為人參皂苷和烏頭類(lèi)生物堿。本文通過(guò)觀察參附注射液對(duì)血栓素A2(thromboxane A2, TXA2 )和前列環(huán)

2、素(prostacyciin, PGI2)、a+ K- ATP酶和。吃+ AT卩酶的影響探討參附注射液保護(hù)肝缺血再灌注損傷的機(jī)制。1材料與方法動(dòng)物分組與給藥24只Wistar大鼠，體質(zhì)量200250 g，隨機(jī)分為肝缺血再灌注模型組和參附注射液(She nfu Injectio n, SF )治療組。SF治療 組給予參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào)031115)10 ml/kg腹腔注射， 1次/d，連續(xù)給藥6 d,第6天于手術(shù)前30 min給藥。模型組大鼠同樣方法給予 相同劑量的生理鹽水。兩組均于第 6天手術(shù)，給藥期間常規(guī)自由喂養(yǎng)，給水。動(dòng)物模型及取材 術(shù)前12 h禁食，自由飲水。10%水

3、合氯醛3 ml/kg 腹腔注射麻醉后，剃除腹部體毛，局部消毒，取腹正中切口開(kāi)腹，開(kāi)腹后離斷肝 周韌帶，包括鐮狀韌帶、肝胃韌帶、冠狀韌帶，消除肝臟側(cè)枝循環(huán)。用Pringle ' s法(無(wú)創(chuàng)傷微血管夾夾閉門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈、膽總管)使肝缺血，持續(xù)15 min后松開(kāi)血管夾，恢復(fù)肝臟血供，然后關(guān)腹。分別于再灌注1 h和3h再次開(kāi)腹。先取一次性5 ml無(wú)菌注射器吸取消炎痛I'DTANaS ml，自下腔靜脈肝下段快速抽取靜脈血3 ml，即刻在空針內(nèi)顛倒混勻，3 500 r/min (上海手術(shù)器械廠80 2 型離心沉淀器)、4 C離心15 min，分離血漿，20 C保存。用取肝組織鑷子 快速夾取

4、大小約1 cm3和cm3兩塊肝組織，PBS液沖洗后分別置于10%福爾馬 林溶液中固定和戊二醛溶液中固定，用于光學(xué)顯微鏡和電鏡檢查?？焖偾腥∈?余肝組織，PBS液沖洗后立即置于液氮中冷凍，用錫箔紙包裹置于液氮中保存， 再轉(zhuǎn)至80 C冰箱中保存，待測(cè)a- K- AT卩酶和。邊+艙2+ AT卩酶。然后 處死大鼠。檢測(cè)指標(biāo)與方法血漿TXA2和 PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物血漿血栓素 B2 （thromboxane B2,TXB2和6 酮 前列腺素F1 a （6血匚。piPStHgmndin卩1 a , 6 keto卩GM a）測(cè)定用放免法進(jìn)行測(cè)定，6庶Lo卩GM a和txb2式劑盒購(gòu)自北京解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)

5、發(fā)中心放免所，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。肝組織ATP酶水平的測(cè)定ATP酶測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，底物三磷酸腺苷鈉購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所。用電子天平稱取冰ATP酶/標(biāo)6-組凍肝臟組織100 mg,先用比色法按考馬斯亮藍(lán)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定肝組織 勻漿的蛋白含量，蛋白含量（g/L ）=（測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度）X標(biāo)準(zhǔn)管 濃度（g/L ）;同樣用比色法按測(cè)試盒說(shuō)明測(cè)定組織勻漿中ATP酶的活性，活力（卩恥1卩i 吧pmt 1 * h 1）=（測(cè)定管吸光度一對(duì)照管吸光度） 準(zhǔn)管吸光度X標(biāo)準(zhǔn)管濃度（1卩mol/ml ）x反應(yīng)體系中樣本稀釋倍數(shù)X 織中蛋白含量（mg Prot/ml ）

6、o組織細(xì)胞學(xué)改變分別采用光學(xué)顯微鏡和T, JEM 1200EX透射電子顯肝組織ATP酶水平和血漿TXB2 6 keto卩GM a測(cè)定 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用成組 t檢驗(yàn)。微鏡觀察。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果以x±s表示，應(yīng)用2 結(jié)果keto卩GM a濃度肝臟缺血15 min，再灌注3 h后血漿TXB2 6SF治療組血漿TXB2濃度較模型組低，而6 keto PCria濃度升高，見(jiàn)表1 0koto ?GEI a比值明顯降低（Pv）o肝組織中ATP酶水平 肝缺血15 min，再灌注1 h和3 h , SF治療組 a- K- AT卩酶和012十眩2+ AT卩酶水平均明顯高于模型組（pv）

7、o肝組織中見(jiàn)表2oTXB2/6組織細(xì)胞學(xué)改變光鏡下模型組肝細(xì)胞濁腫、大片壞死，肝竇和微血管內(nèi)明顯淤血。SF治療組肝竇內(nèi)淤血和組織損傷明顯減輕，可見(jiàn)小灶狀壞死。 電鏡下模型組肝細(xì)胞膜缺損、不連續(xù)，甚至溶解；細(xì)胞器中線粒體損傷尤為明顯， 大量線粒體空泡變性、外膜溶解；核異染色質(zhì)邊集、凝集成塊，核膜不規(guī)則；SF治療組肝細(xì)胞損傷較輕，胞膜較完整，線粒體和內(nèi)質(zhì)較豐富，核內(nèi)充盈，但亦有 染色質(zhì)邊集。見(jiàn)圖14o表1 再灌注3 h血漿TXB2 6 keto卩GM a濃度及其比值（略）Table 1 Plasma concentrations oTXB2 6 keLo PCT a andth已ir ratio

8、after three hour reperf'iisi on*P V, vs un treated group.表2 再灌注1 h和3 h肝組織中ATP酶水平（略）Table 2 i.evels of hepatic tissue AT卩rjses after one or three hovr reper-fusi on*P V, vs un treated group.圖1模型組肝細(xì)胞濁腫、竇內(nèi)淤血、大片壞死（HE染色，X 100）（略）Figure 1 Massive hep atocyte swell ing, n ecrosis, sinu soidal and micro

9、vascular con gesti on in un treated group （HE sta ining,X 100）圖2 SF治療組肝竇內(nèi)淤血和組織損傷明顯減輕，可見(jiàn)小片狀壞死（ HE 染色，X 100）（略）Figure 2 Sinu soidal con gesti on and tissue injury were reduced sigjuficajiliy in SF brobod yroup （HE staining, X100）圖3模型組肝細(xì)胞及其線粒體嚴(yán)重?fù)p傷（透射電鏡，X 8 000）（略）Figure 3 Severe injuries of hep atocyte

10、s and mitoch on dria in un treated group （tra nsmissi on electro n microsc ope,X 8 000）圖4 SF治療組肝細(xì)胞和線粒體損傷減輕（透射電鏡，X 8 000）（略）Figure 4 Injuries of hepatocytes and mitochondria were reduced inSF treat cd grouij （braiisniissiori electron microscope, X8 000）3 討論肝臟缺血再灌注損傷首先表現(xiàn)的是微循環(huán)障礙，具有血管活性的細(xì)胞因子 導(dǎo)致的微循環(huán)收縮是導(dǎo)致

11、肝缺血再灌注損傷的一個(gè)重要因素。Kon do等1報(bào)告在肝臟缺血期，常溫下缺血20 min就導(dǎo)致肝血竇直徑和竇后小靜脈直徑在缺 血末分別縮小25% 20%而且缺血后的肝功能障礙與這種微循環(huán)的收縮有關(guān)。 TXA2和PGI2是花生四烯酸代謝的兩個(gè)產(chǎn)物。PGI2具有很強(qiáng)的擴(kuò)血管作用，同時(shí) 通過(guò)升高CAM功卩強(qiáng)滲透屏障。內(nèi)源性PGI2的反應(yīng)性血管舒張作用維持比較短暫， 更為重要的是PGI2可能激活依賴Ca2+激活的K+1道和依賴ATP激活的K+通道 2, 3 :,這些離子通道的開(kāi)放可使細(xì)胞膜超極化，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載和起到持 久舒張血管的作用4-6。而TXA2是一種很強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，能增加微血管的 通透性

12、。研究表明缺血再灌注后 PGI2的釋放下降7或TXA2的釋放增加，在 再灌注損傷中起著重要作用8。肝缺血再灌注時(shí)TXA2明顯升高，早期更趨明 顯，晚期下降；PGI2的含量亦增高，但增高的梯度遠(yuǎn)低于 TXA2 TXA2/PGI2比 值在肝缺血再灌注早期增高明顯，再灌注 24 h接近正常9。用TXA2合成酶抑 制劑抑制TXA2的釋放或用受體拮抗劑阻斷TXA2效應(yīng)10，用PGI2擬似劑8或通過(guò)提高內(nèi)源性PGI2水平7,都可起到防護(hù)缺血再灌注損傷的作用。Xiao等2報(bào)告當(dāng)血栓素受體缺乏時(shí)也并不減輕心臟的缺血再灌注損傷，而當(dāng)PGI2受體缺乏時(shí)卻明顯加重心臟缺血再灌注損傷；內(nèi)源性PGI2水平下降比TXA2

13、水平升高更易導(dǎo)致再灌注后的組織損傷。 因此，改善PGI2與TXA2二者比例失衡是防 護(hù)缺血再灌注損傷的一個(gè)重要機(jī)制。3- K- AT卩酶和。吃+ 幅+ AT卩酶是 反映細(xì)胞能量代謝和建立跨膜的離子梯度、維持細(xì)胞膜電位與細(xì)胞內(nèi)外離子平衡的兩個(gè)重要的蛋白酶，在生理?xiàng)l件下又稱依賴 ATP的膜結(jié)合蛋白酶。肝臟缺血再 灌注后二者的活性降低，熱缺血時(shí)降低更為嚴(yán)重，且與肝細(xì)胞死亡的方式相關(guān)11谷天祥等12已證實(shí)二者泵功能抑制是心肌缺血再灌注后發(fā)生在亞細(xì) 胞水平Ca2+超載的直接原因。肝缺血再灌注后 曠K- AT卩酶和Ca2+ 眩2+ AT卩酶活性降低，導(dǎo)致亞細(xì)胞水平 Na+ Ca2+ Mg2唾新分布，從 而

14、引起細(xì)胞內(nèi)Na+ Ca2+超載和Mg2降低。尙- K- ATP酶活性下降引起細(xì)胞 內(nèi)Na+超載又激活細(xì)胞膜上Na+ Ca2+交換蛋白，使更多Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；同時(shí) 還引起線粒體中Ca2+釋放，最終導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+超載。細(xì)胞內(nèi)Mg2減少，一方面 削弱它對(duì)Ca2+增多的生理拮抗作用，另一方面，低Mg2本身還可降低細(xì)胞內(nèi)30多種酶的活力，抑制能量合成，增加細(xì)胞膜通透性和減少蛋白質(zhì)合成，結(jié)果細(xì)胞內(nèi)晶體滲透壓增高、水增加、細(xì)胞腫脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。提高二者的活性有 助于減輕組織的缺血再灌注損傷13。本實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟在缺血15 min再灌注3 h后出現(xiàn)明顯的組織損傷，肝細(xì)胞腫脹、壞死；電鏡下大量線粒體水

15、腫和空泡變 性。在再灌注3 h參附注射液通過(guò)降低TXA2和提高PGI2改善PGI2與TXA2二者 的比例失衡；在再灌注1 h、3 h參附注射液明顯提高a- K- AT卩酶和 Ca24- Mg2+ AT卩酶的活性；同時(shí)在再灌注3 h組織損傷明顯減輕。因此參附注 射液通過(guò)改善缺血再灌注后 PGI2與TXA2的比例失衡，和提高a- K- AT卩酶 與0吃+ Mg2+ AT卩酶的活性保護(hù)大鼠肝臟缺血再灌注損傷?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Kondo T, Todoroki T, Hirano T, et al. I mpact ofischeniici reperfusion injury on dimensio

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