神經(jīng)元的再生

1、操縱神經(jīng)元生長錐來促進(jìn)軸突越過抑制劑分子再生由于在受到傷害后體內(nèi)成熟的神經(jīng)元的軸突生長能力的降低和體外環(huán)境中不利的抑制因子的影響，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元不能使軸突再生。最近的研究顯示，標(biāo)記一組特殊的體外抑制因子來觸發(fā)長距離的神經(jīng)軸突的再生是不可行的。為了代替對生長起反作用這個缺陷，解決一個普通的目標(biāo)能夠調(diào)節(jié)軸突的生長抑制提供一個不同尋常的策略去促進(jìn)軸突的再生。神經(jīng)元生長椎可以使軸突伸展，是最多的終端聚集靶點(diǎn)，即使不是全部，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也會妨礙軸突生長。在這項研究中，我們準(zhǔn)備通過直接調(diào)節(jié)圓錐細(xì)胞的生長來促進(jìn)軸突的再生。在這里我們用藥理學(xué)的抑制或肌球蛋白的基因沉默來顯著的促進(jìn)軸突的再生而不是任

2、意和非許可的酶作用物，就像主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑如硫酸軟骨素蛋白聚糖和髓鞘相關(guān)抑制劑。我們發(fā)現(xiàn)肌球蛋白抑制劑能使肌動蛋白和微管在生長錐里重組，從而使微管改編允許快速軸突伸展超過抑制劑培養(yǎng)基。除了增進(jìn)軸突的伸展之外，我們得到肌球蛋白在軸突里活性的局部封閉可以引發(fā)軸突越過自由抑制劑的邊界而生長。同時，我們的研究提示肌球蛋白和生長錐細(xì)胞支架的成分是促進(jìn)軸突再生的有效靶點(diǎn)。1. 微管伸展到生長錐的邊緣是軸突生長的基本過程，因?yàn)楫?dāng)連接到一個退化的肌動纖維時微管會自動遠(yuǎn)離重要邊緣，我們?yōu)榱藴y試通過抑制NM的活性來使流動的肌動蛋白獲得能量是否能夠提高軸突的生長能力而做了以下實(shí)驗(yàn)。Fig.1封鎖肌球蛋白的活

3、性促進(jìn)軸突的再生胎兒的DRG神經(jīng)元培養(yǎng)在任意培養(yǎng)基（單獨(dú)的多聚賴氨酸或多聚賴氨酸加層粘連蛋白）或抑制劑培養(yǎng)基（CSPGs或聚集蛋白聚糖）有或沒有blebbistatin或Y27632作為標(biāo)記。神經(jīng)元被固定（在多聚賴氨酸里2022小時后固定，在其他所有的培養(yǎng)基里1214小時后固定）和用TuJ1抗體做免疫組化。測量軸突的長度（A和B）與典型的圖片（C，TuJ1抗體做免疫組化的反向圖片）。（DF）出生后的小腦小顆粒神經(jīng)元被培養(yǎng)在多聚賴氨酸，聚集蛋白聚糖或髓鞘提取物在有或沒有blebbistatin作為標(biāo)記。測量軸突的長度（D和E）與典型的圖片（F）。當(dāng)NM的活性被抑制后，我們發(fā)現(xiàn)胎兒的背部根神經(jīng)節(jié)在

4、任意培養(yǎng)基中軸突生長能力隨著劑量依賴方法提高了。令我們驚喜的是，NM的活性被封鎖后不能使神經(jīng)元完全克服由CSPGs引起的軸突生長抑制作用。我們也觀察到CSPGs和聚集蛋白聚糖的抑制效果，通過Y27632，有些CSPGs的作用有所緩解。2. 接下來我們檢驗(yàn)了一下如果NM的抑制能夠提高成人神經(jīng)元的軸突生長能力，那哪一些與軸突的再生更相關(guān)呢？我們做了以下實(shí)驗(yàn)。Fig.2. 肌球蛋白的抑制引起來自成人的DRG神經(jīng)元的強(qiáng)大軸突在聚集蛋白聚糖里的伸展。（A和B）來自條件損傷小鼠的成人DRG神經(jīng)元培養(yǎng)在多聚賴氨酸加層粘連蛋白培養(yǎng)基或聚集蛋白聚糖里有或沒有blebbistatin 或Y27632，作為標(biāo)記。測

5、量軸突的長度（A）和典型的圖片（B）。（CE）成人的DRG神經(jīng)元用venus和siRNAs轉(zhuǎn)染來對抗NMA(siNMA)和B(siNMB)做標(biāo)記。在轉(zhuǎn)染4天后，收集神經(jīng)元做蛋白質(zhì)印記（C），或在多聚賴氨酸加層粘連蛋白電鍍或聚集蛋白聚糖允許軸突再生長（D和E）。典型的免疫印記（C）和用venus和siRNAs轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的電鍍圖（E中的箭頭）顯示的。測量的軸突的長度在D中。*P < 0.05; *P < 0.01; *P < 0.001; n.s., not significant。這些結(jié)果暗示，在任意培養(yǎng)基中封閉NMA的活性可以對由blebbistatin引起的軸突生長促進(jìn)作用

6、有很大的關(guān)聯(lián)，然而在抑制劑培養(yǎng)基中，軸突的生長促進(jìn)作用是由NMA和NMB共同抑制的結(jié)果。然而，在這個研究中被用到的電鍍過程與神經(jīng)元中NM抑制不斷生長的軸突或有長軸突的神經(jīng)元的表達(dá)作用不同，這是因?yàn)镹M在生長錐中的轉(zhuǎn)向可能是不同的。3. 為了了解哪一個NM調(diào)控軸突的生長的細(xì)胞機(jī)制，我們首先檢驗(yàn)了一下NM亞型在生長錐里的局部化情況。Fig.3. NMA和NMB在生長錐中的定位。（A和B）培養(yǎng)在多聚賴氨酸加層粘連蛋白培養(yǎng)基中的胎兒的DRG神經(jīng)元用鬼筆環(huán)肽和NMA或NMB抗體染色。指出肌動蛋白的弧形結(jié)構(gòu)和NM亞型的局部翻譯被blebbistatin的應(yīng)用所減少。 結(jié)果顯示在生長錐細(xì)胞中NMA的免疫染色

7、結(jié)果和NMB相比效果不顯著。在過渡區(qū)域NMA的局部與NMB很相似，但是在神經(jīng)末梢區(qū)域NMA與肌動蛋白纖維也結(jié)合。NM亞型在過渡結(jié)構(gòu)域的特殊的局部與它們在生長錐中調(diào)節(jié)退化的肌動纖維的作用是一致的，并且NM局部的明顯減少是對blebbistatin的效果提供一個了解blebbistatin結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。4. 為了更進(jìn)一步的研究哪一個NM抑制導(dǎo)致了軸突生長增強(qiáng)的分子機(jī)制，我們檢驗(yàn)了生長錐的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和它們在應(yīng)答blebbistatin時的結(jié)構(gòu)改編情況，做了以下實(shí)驗(yàn)。Fig.4. NM抑制引起生長錐細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)的改編。（AE）培養(yǎng)在多聚賴氨酸加層粘連蛋白培養(yǎng)基中的胎兒的DRG神經(jīng)元（A和C）或聚集蛋白

8、聚糖（B和D）有（C和D）或沒有（A和B）blebbistatin用鬼筆環(huán)肽和tublin抗體染色。每一張圖片暴露的時間隨著增加肌動蛋白的能見度而調(diào)整。典型的圖片（AD）和生長錐結(jié)構(gòu)的量化（E）。（F和G）成人的DRG生長錐典型的圖片。成人的DRG神經(jīng)元培養(yǎng)在多聚賴氨酸加多聚賴氨酸（F）或聚集蛋白聚糖（G）有或沒有blebbistatin作為標(biāo)記，并且用鬼筆環(huán)肽和tublin抗體染色。 NM的抑制把微管從扁長型的結(jié)構(gòu)釋放出來并且允許微管朝著主要邊界伸展，結(jié)果導(dǎo)致生長錐的細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)與在任意培養(yǎng)基中類似。5為了檢驗(yàn)通過NM抑制如果引起細(xì)胞骨架的改編從而影響軸突的生長速率，我們通過時間間隔顯微鏡來

9、分析軸突的生長。Fig.5.軸突的伸展促進(jìn)CSPGs產(chǎn)生通過NM抑制要求肌動蛋白和運(yùn)輸動力學(xué)。成人的DRG神經(jīng)元來自于條件損傷小鼠在CSPGs里電鍍并且第一次用blebbistatin或DMSO處理作為一個對照組。處理了13個小時后，細(xì)胞松弛素D或噻氨酯噠唑加入blebbistatin包含培養(yǎng)并且再另外培養(yǎng)8個小時，顯示細(xì)胞松弛素D或噻氨酯噠唑完全阻止了當(dāng)加入blebbistatin后積極伸展的軸突的促進(jìn)效果。然而那些只用blebbistatin處理的神經(jīng)元在繼續(xù)伸展。 結(jié)果支持blebbistatin促進(jìn)軸突生長，CSPGs直接影響生長錐細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)。6.為了成功的再生，軸突的裝配必須越過有

10、抑制劑的培養(yǎng)基，但是在進(jìn)入抑制劑區(qū)域損害軸突之前，它們遭遇了任意抑制劑環(huán)境的邊界。擴(kuò)展軸突穿過相同抑制劑涂層的能力也許沒有必要轉(zhuǎn)化成穿過抑制劑邊界的能力。為了解決這個問題，我們改進(jìn)了一種兩隔間的培養(yǎng)瓶來檢驗(yàn)。Fig.6.在軸突中NM的活性局部的封鎖后允許生長錐穿過抑制劑邊界。（A）兩個分區(qū)限制的圖片。（B）典型的圖片關(guān)于成人的DRG神經(jīng)元營養(yǎng)障礙生長錐到達(dá)任意的抑制劑邊界。（C）軸突在任意抑制劑邊界的典型圖片。顯示軸突離開了微型通道沒有進(jìn)入CSPG涂層軸突隔間而是稍微的沿著邊界伸展（紅色箭頭）或向后調(diào)整方向又進(jìn)入微型通道（黃色箭頭）來避免CSPG。（D和E）成人的DRG神經(jīng)元培養(yǎng)在兩隔間里，并

11、且只在軸突的邊緣有blebbistatin局部接觸。生長在不同隔間的神經(jīng)元在同一時間染色來確定生長在軸突隔間里的軸突的數(shù)量。典型的圖片（D）和量化的（E）是軸突進(jìn)入軸突隔間的情況，*P < 0.01。討論：多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑在阻斷了NMII在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的活性后，能夠加速軸突的生長。盡管NMII的活性能夠被ROCK調(diào)控，但是NMII抑制劑的促軸突生長的作用好像是獨(dú)立于Rho-ROCK通路。與NMII抑制劑呈現(xiàn)鮮明對比的是， ROCK通路的阻斷對軸突生長幾乎沒有作用，無論是在聚集蛋白聚糖方面還是在CSPs方面，尤其是在成熟的神經(jīng)元中在repulsive guidance

12、 cues（不會翻譯）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑的作用下，Rho-ROCK通路能夠調(diào)控生長錐的萎縮。但是主要通過誘導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排而不是MTs已被廣泛認(rèn)為的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑的慢性軸突生長抑制作用體現(xiàn)在生長錐急性萎縮上，然而目前的研究清楚地表明急性生長錐萎縮與慢性軸突生長抑制是兩種機(jī)制截然不同的事件，表明了基于MT和基于肌動蛋白的生長錐的反應(yīng)，隨后軸突生長能夠被區(qū)分。在最近的研究中我們顯示聚集蛋白聚糖阻止微管在生長錐里的伸展并且抑制NM從扁長型的組織里釋放這些微管并且引起這些微管朝著重要的邊界伸展。盡管blebbistatin顯示可以在任意的培養(yǎng)基中促進(jìn)微管朝著生長錐的邊緣伸展（39），它是

13、怎樣調(diào)節(jié)生長錐的細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)的和隨后的軸突在中央神經(jīng)系統(tǒng)抑制中的生長情況，據(jù)我們所知，還沒有被探索過。在肌動蛋白結(jié)構(gòu)重組和生長錐降低F肌動蛋白水平的基礎(chǔ)上，它很可能軸突的伸展促進(jìn)效果是NM抑制在抑制劑培養(yǎng)基中重現(xiàn)通過增加微管朝著生長錐的主要邊界伸展，這可以作為退化的肌動蛋白排出減少和肌動蛋白弧形結(jié)構(gòu)丟失的一個推論。生長錐微管的結(jié)構(gòu)可以與軸突伸展率結(jié)核起來。在任意培養(yǎng)基中，微管張開的結(jié)構(gòu)可以經(jīng)常被觀察到在緩慢推進(jìn)生長錐，然而在聚集蛋白聚糖里這種成圈的結(jié)構(gòu)會被觀察到當(dāng)生長錐在一個停頓的情況下。我們觀察到的這些來自條件損傷小鼠生長錐中牢固的微管結(jié)構(gòu)和blebbistatin處理的神經(jīng)元是特有的快速推

14、進(jìn)的生長錐。在軸突生長期間，它變得越來越多的可被觀察到，微管功能不僅作為結(jié)構(gòu)上的架子，而且是控制生長錐動力學(xué)的直接的傳感器和調(diào)節(jié)器。通過改變微管的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)，微管的活性相互作用和與細(xì)胞支架上其他的成分之間的協(xié)調(diào)性改變了軸突的生長。關(guān)于層粘連蛋白，blebbistatin顯示是減少，而不是促進(jìn)胎兒神經(jīng)元軸突的生長。這看起來是與先前的研究矛盾的并且我們應(yīng)該是由于與他們在底層上有差異導(dǎo)致的。在我們的研究中，神經(jīng)元被培養(yǎng)在多聚賴氨酸（100ug/ml）加510ug/ml層粘連蛋白，然而其他的研究是用更高濃度的層粘連蛋白（25ug/ml）而沒有多聚賴氨酸或有很少一點(diǎn)粘著性的培養(yǎng)基。NM抑制軸突生長的最終結(jié)果是效果超過了依賴可粘著的任意培養(yǎng)基，但是這個問題更深一步的研究還要繼續(xù)。修復(fù)被損傷的軸突的主要策略是在損傷點(diǎn)構(gòu)建一個橋梁通過促進(jìn)長距離的軸突再生。在生長錐里調(diào)節(jié)軸突裝配和soma里基因的表達(dá)對于促進(jìn)軸突生長同樣重要。因?yàn)樯L錐細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)的改變直接影響軸突伸展的速度，接觸調(diào)節(jié)生長錐微管提供一個策略不僅允許軸突越過復(fù)雜的中樞