一種新的硅微通道紅細(xì)胞變形性測(cè)量方法

1、    一種新的硅微通道紅細(xì)胞變形性測(cè)量方法?        一種新的硅微通道紅細(xì)胞變形性測(cè)量方法?                     摘要：本文將微機(jī)械加工技術(shù)引入細(xì)胞流變學(xué)研究領(lǐng)域，利用集成電路光刻和異向腐蝕工藝，在硅晶體表面形成了亞微米級(jí)精度的通道，建立了一種新的硅微

2、通道細(xì)胞流變學(xué)測(cè)量系統(tǒng)，可觀察細(xì)胞流過(guò)微通道的全過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，系統(tǒng)具有良好的重復(fù)性(變異系數(shù)CV<5%)，可靈敏地反映細(xì)胞流變特性的改變，可在一定程度上模擬細(xì)胞通過(guò)毛細(xì)血管的行為，并可提供較為豐富的信息。關(guān)鍵詞：硅微通道；紅細(xì)胞；變形性；微機(jī)械技術(shù)分類號(hào)：R318.01; R331.141NEW METHOD FOR MEASUREMENT OF DEFORMABILITYOF RBCs USING MICROCHANNELS FORMEDIN A SILICON SUBSTRATEZheng XiaolinWu NanLu XiaoCai ShaoxiWu YunpengPeng

3、 Chenglin（Bioengineering Research Institute, Chongqing University, Chongqing 400044）He LinHu GanyiZheng WoCui Maojing（The 24th Institute of The Ministry of Electronic Industry, Chongqing 400060）ABSTRACT：Method and technique of The simulation system of capillary were studied by microchannels formed i

4、n a silicon substrate. The design principle and the method were based on the micromechanical technology. The paper presented the manufacturing process of silicon microchannels. The channel grooves were measured at submicrometer accuracy, and formed by the technology of photolithography and etching f

5、or integrated circuits. The full process of the flow of cells through the microchannels can be quantitatively observed. The author also studied the reproducibility and application experiment of the method. The experimental results proved that the a new method has a good reproducibility (Coefficient

6、of variation CV<5%). The new method was is informative, accurate, convenient and economical.Key words：Silicon-microchannels; Red blood cells; Deformability; Micromechanical technology0引言實(shí)驗(yàn)方法及理論模型是支撐血液流變學(xué)研究的兩大支柱。從某種意義上可以說(shuō)：“細(xì)胞力學(xué)(特別是紅細(xì)胞與白細(xì)胞力學(xué))的發(fā)展史是一部不斷完善技術(shù)與改進(jìn)模型的歷史2。”隨著血液流變學(xué)研究的發(fā)展，人們提出了許多測(cè)量紅細(xì)胞變形性的方法并促

7、進(jìn)了對(duì)紅細(xì)胞變形性的研究。目前應(yīng)用較為廣泛的有微管法和微孔濾膜法以及粘度法13。微管法可定量計(jì)算單個(gè)紅細(xì)胞的變形性及膜的一些力學(xué)參數(shù)，但技術(shù)要求較高，設(shè)備昂貴，測(cè)量費(fèi)時(shí)，不宜用于臨床檢查，限制了它的應(yīng)用范圍。微孔濾膜法的優(yōu)點(diǎn)是裝置較簡(jiǎn)單，又能在一定程度上模擬紅細(xì)胞通過(guò)微循環(huán)中的毛細(xì)血管的過(guò)程。但不能觀察細(xì)胞過(guò)孔全過(guò)程，所得某些結(jié)果在各個(gè)研究者的報(bào)告中存在較大差異，這除了反映出測(cè)量紅細(xì)胞變形性在測(cè)量方法上的復(fù)雜性外，與濾膜(特別是核孔濾膜)本身性能有較大關(guān)系。粘性測(cè)量法優(yōu)點(diǎn)在于一次測(cè)量可獲得紅細(xì)胞群體的平均變形性，且操作簡(jiǎn)便，適用于臨床觀察。缺點(diǎn)是不能分辨或?qū)崪y(cè)單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞亞群體的變形情況，不

8、能獲得物理測(cè)量和實(shí)際變形之間的定量關(guān)系。1992年，Kikuchi等提出了硅微通道毛細(xì)血管模型新技術(shù)，其測(cè)量結(jié)果類似于微孔濾膜法，但卻改善了測(cè)量可靠性并可觀察流路4。作者在吸收國(guó)外新技術(shù)方法的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了硅微通道毛細(xì)血管模型及在細(xì)胞流變學(xué)(紅細(xì)胞變形性)中的應(yīng)用研究，建立了一種新的硅微通道細(xì)胞流變學(xué)測(cè)量系統(tǒng)及技術(shù)。1硅微通道的設(shè)計(jì)利用硅的特性而建立起的硅微機(jī)械加工技術(shù)可以制作出尺寸從亞微米到毫微米級(jí)的微結(jié)構(gòu)，并有很高的加工精度。參照國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)對(duì)微孔濾膜孔徑的建議，并考慮硅微機(jī)械加工技術(shù)中的具體情況，作為初次試驗(yàn)，確定通道的等效直徑為6m。根據(jù)目前的工藝條件，若欲獲得圓

9、形通道，則難以達(dá)到微米精度，且不利于觀察。所以將通道橫截面形狀確定為梯形形狀(1)，按異向腐蝕特性確定上底、下底、高的尺寸分別為9m、2.6m、5m。這樣，通道的橫截面積為29m2，和直徑為6m的圓形通道截面積大致相等(28.3m2)，即通道的等效直徑約為6m。通道長(zhǎng)度可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定，本文的工作選擇了3種長(zhǎng)度，即10m、30m及100m。通道排列密度參照ICSH對(duì)微孔濾膜孔密度應(yīng)在4×105目/cm2的建議值進(jìn)行設(shè)計(jì)，取通道排列密度為63條/mm。2示出了硅微通道整體結(jié)構(gòu)示意。邊長(zhǎng)為10mm的正方形腔體的4條邊呈堤壩狀，每條邊上都加工有許多同一尺寸的微通道。正方形腔體內(nèi)中央有一個(gè)

10、較大的通孔，以使血液試樣流入腔內(nèi)，在腔外側(cè)施加一定負(fù)壓，則血細(xì)胞將經(jīng)微通道從腔內(nèi)流至腔外側(cè)。(a)通道梯形橫截面；(b)微通道局部立體結(jié)構(gòu)1硅微通道剖面2硅微通道整體結(jié)構(gòu)2測(cè)量系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)硅微通道毛細(xì)血管模型的基礎(chǔ)上，即可構(gòu)造測(cè)量系統(tǒng)。系統(tǒng)包括三部分：固定硅片的硅片座部分；壓力控制及外管路部分；觀察、記錄、測(cè)量及顯示部分。硅片座的作用是固定硅片，形成微通道，并與外流路相連接。3示出了硅片座的結(jié)構(gòu)。在一定的負(fù)壓下，細(xì)胞被吸入硅片腔內(nèi)，再經(jīng)腔四周壁上的微通道出(3(f)。由于硅片是不透可見(jiàn)光的，故采用反射式顯微鏡透過(guò)覆蓋在硅微通道上方的玻璃片來(lái)觀察通道情況。象攝取采用CCD攝象機(jī)。(a)壓蓋；(b)

11、硅片；(c)玻璃片；(d)基座；(e)整體結(jié)構(gòu)；(f)細(xì)胞流路3硅片座結(jié)構(gòu)示意3系統(tǒng)流變學(xué)檢測(cè)方法借鑒核孔濾膜法的檢測(cè)方法6，作者對(duì)該系統(tǒng)建立了較已有類似系統(tǒng)更為簡(jiǎn)化的細(xì)胞力學(xué)模型(將在另文中詳細(xì)介紹)，給出了4類定量評(píng)價(jià)紅細(xì)胞變形性的參數(shù)指標(biāo)。(1)反映單個(gè)細(xì)胞通過(guò)微通道群體效應(yīng)的參數(shù)：濾過(guò)指數(shù)IF(1)式中，tm是一定體積紅細(xì)胞懸浮液通過(guò)微通道的時(shí)間，ts是相同體積對(duì)照緩沖液通過(guò)時(shí)間，H為紅細(xì)胞壓積。紅細(xì)胞通過(guò)微通道的阻力系數(shù)(2)式中，F(xiàn)o值是t=0時(shí)的細(xì)胞懸浮液初始流量，F(xiàn)s為對(duì)照緩沖液流量。紅細(xì)胞通過(guò)微通道時(shí)的堵塞概率(3)式中，Q為流量增量，取細(xì)胞懸浮液流量Fm和對(duì)照緩沖液流量Fs

12、之比值(Fm/Fs)，V為流過(guò)體積，P為通道兩端的壓差，Vc為紅細(xì)胞體積，Ro為紅細(xì)胞的流阻。阻塞概率的表達(dá)式較為簡(jiǎn)潔，可利用曲線上多個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘擬合，容易實(shí)現(xiàn)，且可避免用單點(diǎn)數(shù)據(jù)計(jì)算可能帶來(lái)的較大的誤差。(2)紅細(xì)胞內(nèi)液粘度(近似估算值)(4)式中，P恒定不變，為可測(cè)量，m為考慮膜粘性等的校正系數(shù)。(3)細(xì)胞通過(guò)微通道的時(shí)間參數(shù)細(xì)胞通過(guò)整個(gè)通道時(shí)間tp；細(xì)胞從頭至尾進(jìn)入通道入口處所需的時(shí)間te(當(dāng)通道較長(zhǎng)時(shí))；細(xì)胞在通道出口處從頭至尾流出通道口所需的時(shí)間to(當(dāng)通道較長(zhǎng)時(shí))；細(xì)胞在通道中流動(dòng)時(shí)間tc(當(dāng)通道較長(zhǎng)時(shí))；以上各時(shí)間參數(shù)的分布及中值。(4)紅細(xì)胞變形的形態(tài)參數(shù)紅細(xì)胞在靜息狀態(tài)

13、下的平均直徑Do；紅細(xì)胞長(zhǎng)軸L與短軸S之比；紅細(xì)胞平均體積MCV。初步實(shí)驗(yàn)表明，上述參數(shù)可從不同角度反映出細(xì)胞流變特性的改變。4實(shí)驗(yàn)研究根據(jù)ICSH血液流變專家組的建議，對(duì)所建立系統(tǒng)進(jìn)行了可行性實(shí)驗(yàn)(包括對(duì)系統(tǒng)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以及對(duì)測(cè)定參數(shù)的敏感性實(shí)驗(yàn))。(1)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按照ICSH血液流變學(xué)專家組的建議，用1份細(xì)胞懸浮液測(cè)定10次IF指標(biāo)，并以此來(lái)計(jì)算儀器的變異系數(shù)CV，測(cè)得CV<5%，有良好的重復(fù)性。(2)正常人紅細(xì)胞懸浮液及藥物作用下紅細(xì)胞懸浮液的實(shí)驗(yàn)試樣：正常人紅細(xì)胞懸浮液，即取5名正常健康志愿者血樣，制得5份紅細(xì)胞懸浮液；含一定藥物濃度血樣，包括：(a)0.5mmol/L CP(鹽酸

14、氯丙嗪)紅細(xì)胞懸浮液；(b)120mmol/L SA(水楊酸鈉)紅細(xì)胞懸浮液。用秩和檢驗(yàn)法對(duì)正常組及藥物作用組分別進(jìn)行兩樣本比較，藥物組所測(cè)的紅細(xì)胞變形性參數(shù)IF、均較正常組有顯著差異，其雙側(cè)P值均小于0.05(其中IF顯著性差異為P0.02)。由于0.5mmol/L CP使紅細(xì)胞大多成為裂口球形，變形性差，入通道口的阻力明顯大于正常組和另一藥物作用組。而棘形細(xì)胞則易堵塞通道，其堵塞率高于其它兩組。所得結(jié)果與理論分析及已有的文獻(xiàn)報(bào)道是一致的，這表明本系統(tǒng)及所建立的計(jì)算方法可較靈敏反映藥物引起紅細(xì)胞變形能力的改變(包括膜流變特性的改變所引起的變化)，并能區(qū)別阻力系數(shù)與堵塞概率兩種不同情況，見(jiàn)表1

15、。表1同一血樣在正常及不同藥物作用情況下的IF、參數(shù)正常0.02mmol/LCP0.5mmol/LCP7.5mmol/LSA120mmol/LSAIF71.385.0165.3146.2167.417.872.2103.518.452.23.6×10-43.2×10-44.5×10-418.4×10-44.0×10-411.1×10-4(3)正常鼠及疲勞鼠的紅細(xì)胞變形性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)對(duì)象：健康大白鼠(雄性)5只(對(duì)照組)；疲勞大白鼠(雄性)5只。疲勞模型為將鼠放進(jìn)水溫35±2的水箱內(nèi)，使鼠大運(yùn)動(dòng)量疲勞力竭下沉不浮出水面約8s后撈起

16、取血。表2示出了疲勞組與對(duì)照組IF、參數(shù)。疲勞組的IF、較對(duì)照組有非常顯著的差異(P<0.01雙側(cè)，秩和檢驗(yàn)，下同)，而無(wú)明顯差異(P>0.1)。這意味疲勞組細(xì)胞濾過(guò)阻力明顯增大，將使濾過(guò)速度顯著下降。實(shí)際觀察單個(gè)細(xì)胞通過(guò)通道時(shí)間，疲勞組較正常組多數(shù)細(xì)胞的流速并無(wú)很顯著差異，但個(gè)別細(xì)胞流速顯著減慢的機(jī)率增大。這提示個(gè)別變形性極差、濾過(guò)阻力很大的細(xì)胞對(duì)IF、的影響顯著。即所反映的濾過(guò)阻力是一個(gè)平均、群體參數(shù)。由于是等權(quán)值平均，故個(gè)別差異很大的值對(duì)總平均的影響是很大的(特別在統(tǒng)計(jì)數(shù)不是很大時(shí))。表2疲勞組與對(duì)照組IF、參數(shù)IF對(duì)照組27.57±11.369.4±5.

17、832.21×10-4±0.9×10-4疲勞組150.88±124.8955.26±24.422.24×10-4±1.4×10-4P檢驗(yàn)P<0.01P<0.01P>0.1根據(jù)已有的報(bào)道，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)力竭疲勞后，紅細(xì)胞硬度增加，阻力增大，運(yùn)動(dòng)速度下降，變形性降低。本文所作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法也能反映出上述改變，且這種改變的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)非常顯著。4表示了一例對(duì)照組和疲勞組的懸浮液Fm/Fs-V(流量比-通過(guò)體積)對(duì)照曲線。可看出疲勞組的濾過(guò)阻力IF明顯大于對(duì)照組，而阻塞概率無(wú)明顯差異。 4對(duì)照組和疲勞組中

18、的Fm/Fs-V曲線(4)流變現(xiàn)象的觀察本方法可在不同外界條件下觀察紅細(xì)胞流經(jīng)微通道的全過(guò)程，可提供較多細(xì)胞流變學(xué)信息。不僅可以了解細(xì)胞變形的幾何變化，還可根據(jù)細(xì)胞的流路獲得流場(chǎng)分布情況。此外，可考察細(xì)胞的粘附、堆積、堵塞產(chǎn)生的過(guò)程，考察流路中影響紅細(xì)胞流速的因素等等。實(shí)驗(yàn)中觀察到，在變形性差的細(xì)胞幾乎完全將某個(gè)通道堵塞時(shí)，變形性好的紅細(xì)胞仍能將堵塞細(xì)胞“頂”開(kāi)，并通過(guò)此通道。表明在較嚴(yán)重流路障礙情況下，紅細(xì)胞變形性起了一個(gè)十分重要的作用。4小結(jié)筆者在國(guó)內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞流變學(xué)測(cè)量技術(shù)及方法硅微通道細(xì)胞流變學(xué)測(cè)量方法。本文的初步工作已表明這種方法的優(yōu)越性以及較大的應(yīng)用前景。新方法具有如下

19、的特點(diǎn)。(1)具有較高的制做精度能夠以微米級(jí)、亞微米級(jí)精度制做微通道。通道的尺寸可以準(zhǔn)確控制，從而可保證微通道有很好的均勻性，互換性。通道尺寸大小的設(shè)計(jì)具有很強(qiáng)的靈活性，等效直徑可小到1m，大至78m；通道長(zhǎng)度可從數(shù)m到幾百m?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康撵`活設(shè)計(jì)，滿足不同測(cè)試目的的需要。(2)具有良好的使用性能由于流路在平面展開(kāi)，可清晰觀察細(xì)胞通過(guò)微通道的過(guò)程，并可進(jìn)行幾何參數(shù)的測(cè)量。流路構(gòu)成簡(jiǎn)單，拆卸容易，易于清洗。硅微通道采用集成電路工藝制造，可批量生產(chǎn)，成本低，易于推廣。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，具有和微孔濾膜法相近的簡(jiǎn)單性。(3)具有良好的檢測(cè)性能有較好的重復(fù)性，其變異系數(shù)CV<5%。可靈敏、定量反映紅

20、細(xì)胞變形性的改變。(4)可從多角度反映紅細(xì)胞的變形性硅微通道的結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)的構(gòu)成，使該系統(tǒng)同時(shí)兼有微孔濾膜法、微管吸吮法、單孔測(cè)量法以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)象分析方法的一些功能。新方法既可保持微孔濾膜法簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，又避免微孔濾膜不能觀察細(xì)胞通過(guò)孔道的動(dòng)態(tài)過(guò)程的不足，它也不需要微管繁瑣費(fèi)時(shí)的操作和昂貴的設(shè)備。因此，經(jīng)進(jìn)一步完善后，可望推廣到臨床常規(guī)檢查或各級(jí)研究部門(mén)。參數(shù)測(cè)量和流路觀察相結(jié)合，可提高參數(shù)測(cè)量的可靠性，提供更多信息，并有助于一些流變現(xiàn)象的解釋?？稍诓煌饨鐥l件下觀察紅細(xì)胞流經(jīng)微通道的全過(guò)程，獲得流場(chǎng)分布情況?？煽疾旒?xì)胞的粘附、堆積、堵塞產(chǎn)生的過(guò)程，考察流路中影響紅細(xì)胞流速的因素等。(5)可推廣應(yīng)

21、用至相關(guān)研究領(lǐng)域進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)還表明，本方法還可為醫(yī)藥行業(yè)評(píng)價(jià)藥物微粒膠囊進(jìn)入體內(nèi)后通過(guò)微循環(huán)的情況提供一種模擬實(shí)驗(yàn)研究手段?；痦?xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金部分資助作者單位：鄭小林（重慶大學(xué)生物工程院，教育部生物力學(xué)及生物流變學(xué)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044）吳楠（重慶大學(xué)生物工程院，教育部生物力學(xué)及生物流變學(xué)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044）盧曉（重慶大學(xué)生物工程院，教育部生物力學(xué)及生物流變學(xué)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044）蔡紹皙（重慶大學(xué)生物工程院，教育部生物力學(xué)及生物流變學(xué)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044）吳云鵬（重慶大學(xué)生物工程院，教育部生物力學(xué)及生物流變學(xué)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044）彭承琳（重慶大學(xué)生物工程院，教育部生物力學(xué)及生物流變學(xué)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044）何林（原電子工業(yè)部第二十四研究所，重慶 400060）胡剛毅（原電子工業(yè)部第二十四研究所，重慶 400060）鄭娥（原電子工業(yè)部第二十四研究所，重慶 400060）崔茂鏡（原電子工業(yè)部第二十四研究所，重慶 400060）參考文獻(xiàn)：1嚴(yán)宗毅等.血液流變學(xué)