PCR實驗室操作流程

1、本文格式為Word版，下載可任意編輯PCR實驗室操作流程 乙型肝炎病毒（ HB A A R R A A I7300) ) 檢側(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序 一、N N O O A A I I F F T RTEST 檢測信息 項目名稱 乙型肝炎病毒核酸 方法 聚合酶鏈反應(yīng) 方法依據(jù) 衛(wèi)生部全國臨床檢驗操作規(guī)程第三版(206)第七篇第六章第一節(jié) 二、 LYTICALPRINC E PLE 檢測原理 聚臺酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(CR可對特定核苷酸片段進行指數(shù)級得擴增,而實時熒光定量 PC技術(shù),就是指在 PC反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個CR進程,最終通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析得方法。在實時熒光定

2、量 PCR 反應(yīng)中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),熒光物質(zhì)有兩種:熒光探針與熒光染料。我們目前就是使用 Tqa熒光探針得檢測原理:R 擴增時在加入一對引物得同時加入一個特異性得熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團與一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團放射得熒光信號被淬滅基團汲取；P擴增時,Taq 酶得 5一 3外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團與淬滅熒光基團分別,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條 DNA 鏈,就有一個熒光分子形成,熒光信號強度也等比例增加(圖一)。這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量得變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 三、操作步驟 （一)

3、 ) 試劑配制 1、進入試劑預(yù)備區(qū)，開啟冰箱冷凍層取出 HBV-NA 檢測試劑盒。查瞧外包裝盒(包括生產(chǎn)批號、有效期）,無誤后拆開試劑盒,取出核酸提取液、反應(yīng)液及 Taq 酶(核對核酸提取液、HBVPR 反應(yīng)液及 Tq 酶管上批號與試劑外包裝盒批號就是否全都)(圖）,不全都則不行使用,需更換新得試劑。室溫平衡 2min,完全溶化后 20rpm 離心備用。 2、核酸提取液得分裝 （）取 0、l 離心管架置于超凈工作臺內(nèi)(開機前用紫外線消毒30 分鐘),用右手拿起鑷子逐個將離心管放入離心管架（留意應(yīng)夾住離心管外壁,不能遇到管內(nèi)壁）,擺放挨次為橫列從左往右擺，豎列為從上往下隔行排,離心管個數(shù)為 n(

4、=樣本數(shù)+對比品+質(zhì)控品)。完成后將鑷子放回原位(圖 2)。 (）用移液器精確吸取核酸提取液 50u分裝至 0、5m1 離心管中(左上角第一排開頭，從左住右依次加入)。因核酸提取液內(nèi)含固體沉淀顆粒物,為使顆粒勻稱分布,故每次取樣時都要用移液器反復(fù)吸打3-4次（圖 3)。分裝完畢后將移液器量程歸位。 （3)加完一架后用右手拿鑷子將離心管拿起,左手大拇指與中指夾緊離心管下部,然后用食指將蓋子蓋上，挨次為:從右下角第一個開頭,從右住左依次蓋上(圖),離心管蓋全部蓋完后，通過傳遞窗轉(zhuǎn)移至標(biāo)本處理區(qū)。 3、HBV-DNA 反應(yīng)液得配制 每批需設(shè)置空白對比、陰性對比、臨界陽性對比(同時檢測低值陽性質(zhì)控品,

5、則無需再檢測臨界陽性對比、陽性質(zhì)控品、陽性標(biāo)準(zhǔn)品。所需每批需配制數(shù) n=樣本數(shù)+對比品+陽性標(biāo)準(zhǔn)品+質(zhì)控品,每個測試反應(yīng)體系配制如下表: 試劑 BV P反應(yīng)液 Ta酶 (1）每盒 HBV-DN試劑可檢測 32 人份,依據(jù)每日需檢測標(biāo)本份數(shù)計算出每批所需BV CR 反應(yīng)液與aq 酶用量(例有 11人份需要進行檢測,則有 3 盒試劑可直接使用 10ul 移液器將 Ta酶加入 HV PC反應(yīng)液中,另有 11-*3=1人份試劑需將 HBV PC反應(yīng)液與q 酶使用移液器按反應(yīng)體系比例吸取至 1、5m1 離心管中配制(圖 5）。 （2)取出離心后備用得HBV PCR反應(yīng)液與Taq酶,按上述要求配制后用旋渦

6、振蕩器振蕩混勻 50sec,然后再用離心機 2021m 離心10sec 備用(圖 6)。 (3)從操作臺面上拿取 HBVDHA 試劑配制盒(可選用空余得 200槍頭盒)至超凈工作臺內(nèi)，打開配制盒并用記號筆在相應(yīng)得孔位右旁按挨次編號（圖 7）。編號規(guī)章為:樣本擴增反應(yīng)管對應(yīng)得孔位按相應(yīng)得樣本流水號編寫、陽性質(zhì)控品反應(yīng)管對應(yīng)得孔位編"Q'(如有高值則標(biāo)為 H,低值為),陰性對比品孔位編"-',臨界陽性對比對應(yīng)得孔位編"',空白對比對應(yīng)得孔位編"B',1 號標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)得孔位編"S',2 號標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)得孔位編&q

7、uot;S2',依此類推。 (4）編號完畢后，用右手拿起鑷子夾起反應(yīng)管(ABI7300 使用得就是八聯(lián)一薄壁反應(yīng)管，鑷子應(yīng)夾住反應(yīng)管外壁，不行接觸到內(nèi)壁。按(圖8)所示方向依次將全部反應(yīng)管(反應(yīng)管數(shù)=)隔列擺放到配置盒上。 (5）從離心機中取出已混好 Tq 酶得CR 反應(yīng)液,用移液器(量程調(diào)至 36ul),精確吸取反應(yīng)液并按從上到下、從左至右得挨次依次加至反應(yīng)管中，留意:吸頭應(yīng)深化到反應(yīng)管底部,放液時應(yīng)緩慢,切勿形成氣泡(圖9)。全部加樣完畢后將配制盒通過傳遞窗轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 用量(ul) 35、7 0、3 ( ( 二) ) 標(biāo)本處理 1、標(biāo)本、質(zhì)控品及對比品得處理 （1)從冰箱冷

8、凍室取出 HV DNA 陽性質(zhì)控品、陰性對比品,室溫平衡 20min 待其完全溶化。 （)核對標(biāo)本與原始申請單得條形碼與檢驗項目,無誤后依次粘貼上相應(yīng)得流水號,如 2、從傳遞窗中取出試劑預(yù)備區(qū)分裝好核酸提取液得離心管架,移至生物平安柜內(nèi)在管蓋上用記號筆寫上阿拉伯?dāng)?shù)字 1、2、3、,陽性質(zhì)控管標(biāo)上"Q'(如有高值則標(biāo)為 H，低值為 L)，陰性對比管標(biāo)上"-'，臨界陽性對比管標(biāo)上"，。離心管蓋上標(biāo)記得就是 1,就表示該管要加入流水號為 P01 得標(biāo)本（圖0)。 留意:每個離心管得編號方向都應(yīng)朝向管口開啟得方向。(圖 1） 3、去除標(biāo)本管蓋:將標(biāo)本從前處

9、理取至標(biāo)本預(yù)備區(qū)，按排列挨次依次去除樣本管上得橡膠塞。詳細操作為:在生物平安柜中,左手拿起血清管并固定,右手拇指與中指涅緊橡膠塞,右手食指輕輕頂住橡膠塞頂部凹面,逆時針方向輕輕旋下橡膠塞后廢棄于裝有消毒液得垃極桶(圖2)。(留意:手指切勿接觸到血清管口或碰觸到血清,如手套上有血清則需準(zhǔn)時跟換新得手套;待全部樣本管蓋都去除完畢后,也需更換新得手套。) 4、樣本及對比品得處理: a、左手拿起樣本,用量程為00u1 調(diào)至 50u1 得移液器精確吸取樣本(注：為保證樣本得均一性與吸樣精確，每次取樣時需用移液器將樣本吸打 3-5 次；吸樣時移液器套筒不行接觸到樣本管內(nèi)壁）（圖3） 、吸樣完畢后,將樣本管

10、放至另一試管架中(切勿不行將樣本放回原 試管架位)(圖4)。 c、再用左手按前面所述樣本流水號與離心管編號得對應(yīng)關(guān)系拿起相應(yīng)得離心管,打開離心管蓋(注:單手操作,食指與中指固定離心管,拇指稍向后上方發(fā)力打開管蓋,手指切勿遇到離心管口與管蓋內(nèi)側(cè))(圖5)。 d、管蓋完全打開后,用左手食指、拇指與中指固定離心管,將吸頭中得樣本全部打入離心管底部,輕輕吸打混勻 3-次。（圖6) e、加樣完畢后棄槍頭干盛有消毒液得垃極桶中（注：一個吸頭只能用于一個樣本得吸樣,禁止使用一個吸頭重復(fù)吸取不同樣本）。同時蓋上離心管蓋并放回離心管架(放回得位置需另起一行,切不行放回原位)，連續(xù)處理下一個樣本。對比品與質(zhì)控品同

11、病人樣本一樣處理。（圖 17) f、待一架離心管全部加樣完成后用振蕩混勻器充分振蕩混勻 10-5秒。 g、左手將混勻后得離心管轉(zhuǎn)移至恒溫金屬浴上(注：離心管需對稱得放置在恒溫金屬浴相匹配得孔槽內(nèi)),用計時器計時,00誤差不超過1干浴in(誤差不超過30sec）。(圖） 干浴時用離心管架置于加熱得離心管上,防止離心管蓋因加熱爆開導(dǎo)致標(biāo)本間得污染(圖)。 h、非常鐘后前后不超過半分鐘),右手用攝子夾起橡皮墊從恒溫金屬浴中拿出離心管(圖）。 I、將上述離心管按挨次對稱放入低溫高速離心機轉(zhuǎn)子孔內(nèi),擺放離心管時要將離心管開口朝內(nèi),蓋上轉(zhuǎn)子蓋及離心機蓋后，12，OOOrpm 離 心min（注:離心時需在轉(zhuǎn)子孔內(nèi)放置 0、5m1 離心管專用適配器（圖)。 j、待離心結(jié)束后,取出離心管并按編號挨次依次擺放在離心管架上(參照(圖0）得排列方式)并 4"冰箱保存?zhèn)溆?若當(dāng)夭不使用,則應(yīng)保存在一 20"條件下,使用前置室溫平衡 20min，再以 12,OOOm 離心 10i。 5、待全部樣本加樣完畢更換手套，左手用鑷子夾起反應(yīng)管蓋得一側(cè)得延長段(不要遇到管蓋）,然后用右手大拇指從左住右依次蓋緊管蓋(不要遇到其她未蓋得反應(yīng)管口）（如圖 22)。 6、將反應(yīng)管連同試劑配置盒通過傳遞窗傳至擴增分析區(qū)。 (三）擴增分