高效液相色譜法建立的一般步驟

1、高效液相色譜法建立的一般步驟 (1)了解樣品的基本狀況 所謂樣品的基本狀況，主要包括樣品所含化合物的數(shù)目、種類(官能團)、分子量、pka值、uv光譜圖以及樣品基體的性質(zhì)(溶劑、填充物等)、化合物在有關(guān)樣品中的濃度范圍、樣品的溶解度等。 (2)明確分別目的 是分析組分還是制備樣品； 是否已知樣品全部成分的化學(xué)特性，或是否需做定性分析； 是否有須要解析出樣品的全部成分(比如對映體、非對映體、同系物、痕量雜質(zhì))； 如需做定量分析，精密度需多高； 建立的辦法將適用幾種樣品分析還是許多種樣品分析； 將用法終于辦法的常規(guī)試驗室中已有哪些hplc設(shè)備和技術(shù)。 (3)了解樣品的性質(zhì)和需要的預(yù)處理 除非樣品是適

2、于挺直進樣的溶液，否則，高效液相色譜分別前均需舉行某種形式的預(yù)處理。有的樣品需加入緩沖溶液以調(diào)整ph值；有的樣品含有干擾物質(zhì)或“損柱劑”而必需將其去除。此外，為了保證終于的樣品溶液與流淌相的成分盡量相近，最好用流淌相溶解(或稀釋)樣品。 (4)檢測器的挑選 不同的分別目的對檢測的要求不同，如測單一組分，抱負的檢測器應(yīng)僅對所測成分響應(yīng)，而其他任何成分均不出峰。另外，假如目的是定性分析或是制備色譜，則最好有通用型檢測器，以便能檢測到混合物中的各種成分。儀對分析而言，檢測器敏捷度越高，最低檢出量越小越好；假如目的是用作制備分別，則檢測器的敏捷度沒須要很高。 應(yīng)盡量用法紫外檢測器(uv)，由于目前普通

3、的hplc都配有這類檢測器，它便利且受外界影響小。如被測化合物沒有足夠的uv生色團，則應(yīng)考慮用法其他檢測手段：如示差折光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器等。假如實在找不到合適的檢測器，才可以考慮將樣品衍生化為有uv汲取或有熒光的產(chǎn)物，然后再用uv或熒光檢測。 (5)分別模式的挑選 在充分考慮樣品的溶解度、分子量、分子結(jié)構(gòu)和極性差異的基礎(chǔ)上，確定hplc的分別模式。 (6)固定相和流淌相的挑選 在實際分析過程中，確立了分別模式之后，挑選合適的固定相與流淌相是非常重要的。下面容易研究幾種常見液相色譜法的固定相與流淌相的挑選。 a硅膠吸附色譜 在硅膠吸附色譜中，對保留值和挑選性起主導(dǎo)作用的是溶質(zhì)與固

4、定相的作用，流淌相的作用主要是調(diào)整溶質(zhì)的保留值在一定范圍內(nèi)。在吸附色譜中，流淌相的弱組分是正己烷，實際過程中，可按照溶質(zhì)所包含的官能團信息，挑選適當?shù)牧魈氏嗟膹娊M分。 樣品中只含有一oh、 cooh、-nh2這類質(zhì)子賦予體基團時，可選用異丙醇作為流淌相的強組分； 樣品中的溶質(zhì)中含有一c00一、一co一、 n02一和一c=o這類質(zhì)子接受體的基團時，可選用乙酸乙酯、丙酮或乙腈作為流淌相的強組分； 樣品的溶質(zhì)中只含有一0一和苯基這類極性作用較弱的基團時，可選用乙醚作為沖洗劑的強組分； 樣品中若含有規(guī)章、和中兩種或兩種以上不同類的基團時，可按規(guī)章、和的挨次優(yōu)先挑選沖洗劑的強組分； 樣品中的溶質(zhì)同時含有

5、多個一h2po4、-cooh、-oh和一nh2等氫鍵力較強的基團時，則應(yīng)在規(guī)章挑選的流淌相中加入適量的乙醇或乙腈，須要時也可加入水。 b正相鍵合相色譜 正相鍵合相色譜分別機理與硅膠吸附色譜相像，流淌相的挑選可引用硅膠吸附色譜中的規(guī)章，固定相的挑選原則如下： 若-樣品溶質(zhì)中含有一coo一、-no2、-cn等具有質(zhì)子接受體基團，則可選用氨基、二醇基這一類具有質(zhì)子賦予能力的固定相； 若樣品溶質(zhì)中含有nh2、nh、oh、一cooh等具有質(zhì)子賦予能力的基團，則可選用腈基、氨基和醇基鍵合固定相； 若樣品中同時包含有規(guī)章與中所示的兩類基團，則可選用規(guī)章中推舉的鍵合同定相。 c反相色譜 在反相色譜中，水是常用

6、的流淌相，c18是常用的填充載體。重要的是挑選流淌相的強組分，常用的強組分有甲醇、乙腈與四氫呋喃。反相色譜流淌相的挑選規(guī)章如下： 若樣品溶質(zhì)中含有兩個以下氫鍵作用基團(如-cooh、-nh2、-oh等)的芬芳烴鄰、對位或鄰、間位異構(gòu)體，可選用甲醇水為流淌相; 若樣品溶質(zhì)中含有兩個以上c1、i、br的鄰、間、對位異構(gòu)體或極性取代基的間、對位異構(gòu)體以及雙鍵位置不同的異構(gòu)體，可選用苯基或c18鍵合固定相、乙腈水為流淌相； 當實際過程中獲得溶質(zhì)的k值大于30(普通要求1 k 20時)，應(yīng)在反相色譜系統(tǒng)的甲醇水流淌相中加入適量四氫呋喃、三氯甲烷或丙酮，以使被分別溶質(zhì)的k值保持在適當范圍內(nèi)；固然，也可以通

7、過削減固定相表面鍵合碳鏈濃度或縮短碳鏈長度來達到減小k值的目的； 若樣品溶質(zhì)中含有一nh2、nh或n一這一類基團時，應(yīng)在反相色譜的流淌相中加入適量有機胺以提高樣品保留值的重臨性和色譜峰的對稱性。 d凝膠色譜 凝膠是凝膠色譜的核心，是產(chǎn)生分別作用的基礎(chǔ)，舉行凝膠色譜試驗的重要一環(huán)是挑選和搭配具有不同孔徑的性能良好的凝膠。生物大分子分別的傳統(tǒng)辦法多采納多糖聚合物凝膠gpc填料，這種填料只能在低壓、慢速操作條件下用法，目前在很大程度上已被微粒型交聯(lián)親水硅膠和親水性鍵合硅膠取代。填料具有一定的孔徑尺寸分布，隨孔徑大小的差別，分別分子量范圍為1200萬之間。對于試驗室分析或小規(guī)模制備，平均粒度在313m的填料，普通有良好的柱效和分別能力；但對于大規(guī)模制備和