課題3-血紅蛋白的提取和分離-教學(xué)設(shè)計(jì)-教案

1、教學(xué)準(zhǔn)備1 .教學(xué)目標(biāo)1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理2 .教學(xué)重點(diǎn)攤點(diǎn)教學(xué)重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法教學(xué)難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填3 .教學(xué)用具教學(xué)課件4 .標(biāo)簽教學(xué)過(guò)程（一）引入新課蛋白質(zhì)的知識(shí)回憶：含量：占細(xì)胞干重的 50 %以上，是細(xì)胞中含量最多的有機(jī)化合物。2、組成元素：C、H、O、N3、基本單位：氨基酸4、分子結(jié)構(gòu)：氨基酸一多肽一蛋白質(zhì)肽鍵：一CO NH 一5、相對(duì)分子質(zhì)量：高分子化合物蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，是細(xì)胞內(nèi)含量最高的有機(jī)化合物。對(duì)蛋白質(zhì)的研究 有助于人們對(duì)生命過(guò)程的認(rèn)識(shí)和理解。所以需要從細(xì)

2、胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。怎樣提取 蛋白質(zhì)呢？(二)蛋白質(zhì)分子的差異性1 .基礎(chǔ)知識(shí)蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等 千差萬(wàn)別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。1.1 凝膠色譜法(分配色譜法)：(1)原理：(見課件圖)分子量大的分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快; 分子量小的分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。(2)凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。(3)分離過(guò)程：混合物上柱一洗脫一大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢 一收集大分子一收集小分子*洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。1. 2緩沖溶液(1)原理：由弱酸和

3、相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成(如 H2CO3 NaHCO3 , HC-NaC, NaH2PO4/Na2HPO4等)，調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。(2)緩沖液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。1. 3凝膠電泳法：(1)原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力 大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。思考閱讀投影補(bǔ)充材料后，填寫下表：決定運(yùn)動(dòng)方向形礴庫(kù)售力形成阻力決定運(yùn)動(dòng)速率電荷性質(zhì)電荷量4城分子形狀分子大小(2)分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。(3)分離過(guò)程：在一定 pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或

4、負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的 SDS,形成 蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。例：聚丙烯酰胺凝膠電泳1、在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用十二烷基硫酸鈉( SDS)一聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙 烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。2.原理：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的 大小等因素。(SDS的作用)為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。3. SDS作用機(jī)理：SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈

5、，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不 同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。(三)、血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2.1 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。思考：是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的？為什么？不是。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的來(lái)源和性質(zhì)不同，分離方法差別很大。2.2 選擇實(shí)驗(yàn)材料(1)你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動(dòng)物血液中，最好哪種血液來(lái)提取血紅蛋白？為什么?哺乳動(dòng)物血液。因?yàn)樵摷?xì)胞中沒有細(xì)胞核，血紅蛋白含量高。( 2)請(qǐng)閱讀

6、投影資料，認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考回答下列問題：血液由血漿和血細(xì)胞兩部分組成。血細(xì)胞中紅細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是血紅蛋白。該化合物是由兩個(gè)“-肽鏈、兩個(gè) 3-肽鏈和四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2 和 CO2 結(jié)合的亞鐵紅素基團(tuán)。2.3 從紅細(xì)胞中分離出血紅蛋白的過(guò)程為：洗滌紅細(xì)胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透析。洗滌紅細(xì)胞的目的是什么？除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的分離純化。紅細(xì)胞的洗滌過(guò)程為：血液+檸檬酸鈉-低速短時(shí)離心-吸出上層血漿 -紅細(xì)胞+ 5倍體積生理鹽水 -緩慢攪拌10min-低速短時(shí)離心-吸出上清液-反復(fù)洗滌

7、直至上清液無(wú) 黃色思考：加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什么要緩慢攪拌？防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。思考：你有什么方法將紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來(lái)？加入蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時(shí)間。補(bǔ)充：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。此時(shí)，紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細(xì)胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯有機(jī)溶劑等。怎樣除去這些雜質(zhì)呢？由于它們的密度不同，科學(xué)家采取了離心分離的方法：紅細(xì)胞破碎混合液 -中速長(zhǎng)時(shí)離心(2000c/min M0min)-濾紙過(guò)濾除去脂質(zhì) -分液漏 斗分離出血

8、紅蛋白2.4 如何除無(wú)機(jī)鹽離子和小分子有機(jī)物質(zhì)呢？。透析。半透膜的選擇透過(guò)性，大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜，離子和小分子能夠通過(guò)半 透膜。在透析過(guò)程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過(guò)半透膜擴(kuò)散進(jìn)入到pH = 7的磷酸緩沖液中。思考：為何使用pH = 7的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量？維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴(kuò)散。總結(jié)：通過(guò)以上四個(gè)基本過(guò)程，紅細(xì)胞中的血紅蛋白就被提取出來(lái)。但其中還含有其 他種類的蛋白質(zhì)分子（如呼吸酶等）。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開來(lái)呢？我們來(lái)研究 蛋白質(zhì)提取和分離的第二個(gè)步驟 一一粗分離（凝膠色譜操作）。2.5 凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包

9、括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。根據(jù)教材圖5-19,說(shuō)出制作色譜柱需要的材料。橡皮塞2個(gè)、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。色譜柱的制作過(guò)程：準(zhǔn)備材料 一加工橡皮塞一安裝色譜柱卜面進(jìn)行第二步凝膠色譜柱的裝填。請(qǐng)閱讀教材:色譜柱的裝填過(guò)程。步驟操作要求©操作要求色譜柱垂直固定在主架上計(jì)算稱重凝膠根揖色誥柱體積計(jì)理舞膠用量配制黑浮液:賽膠顆粒十蒸斶水f充分滯 帳雄腋顆粒十洗脫菠T溪水浴裝埴曷淳疲一次性會(huì)慢倒入；輕輕尉打緩沖液洗案平衡立刻用磷酸輯沖液洗譙平衡I2h樣品加入和洗脫。其基本過(guò)程是：調(diào)節(jié)緩沖液面一加入蛋白質(zhì)樣品一調(diào)節(jié)緩沖液面一洗脫一收集分裝蛋白質(zhì)

10、至此，血紅蛋白即可得到粗分離。在整個(gè)操作過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)注意以下事項(xiàng)：（1）紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過(guò)少；低速、短時(shí)離心。(2)凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡(3)色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無(wú)氣泡；洗脫液不能斷流。(4)色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。(四)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？觀察你處理的血液樣品離心后是否分層(見教科書圖5-18),如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞 和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)

11、血紅蛋白的提取純度。2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖一2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性 能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過(guò)程嗎？血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即：樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即：樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。4、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過(guò)程中紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色 區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分 離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。課堂小結(jié)當(dāng)今生物科學(xué)在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的進(jìn)展，說(shuō)明提取、分離高純度的蛋白質(zhì)的重要性和 必要性