基于碳點熒光恢復(fù)法測定三磷酸腺苷物理學(xué)專業(yè)

1、基于碳點熒光恢復(fù)法測定三磷酸腺苷摘 要熒光半導(dǎo)體量子點因為具有比較特別的光學(xué)性能而得到了許多研究者的關(guān)注研究，它被很多科研者都用于研究生物領(lǐng)域的成像。但是，因為半導(dǎo)體量子點含有一些不良的重金屬元素，對生物體會造成一定的毒性并且有潛在的可能會對環(huán)境造成一定的危害，它的這些弊端限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用。而熒光碳點作為目前最受關(guān)注的納米材料，它具有比較優(yōu)越的各項性能，從而被大范圍使用在生物方面的成像實驗。但若在細(xì)胞內(nèi)用傳統(tǒng)的熒光量子點成像卻特別容易使細(xì)胞出現(xiàn)故障，從而對細(xì)胞的生命活性造成一定不良作用。而細(xì)胞體內(nèi)能量最關(guān)鍵的來源三磷酸腺苷，對維持生命體的機(jī)理有序進(jìn)行有特別重要的作用。本研究擬采用微波合成法

2、對PEI(聚醚酰亞胺)與丙三醇微波加熱反應(yīng)制得熒光碳點(CDs)，從而建立檢測細(xì)胞內(nèi)ATP含量的發(fā)光方法，用制得的碳點與三磷酸腺苷反應(yīng)，得到ATP的含量與系統(tǒng)中所測得的碳點數(shù)呈成線性關(guān)系。關(guān)鍵詞：碳點；適配體；三磷酸腺苷AbstractFluorescent semiconductor quantum dots have been studied by many researchers because of their relatively specific optical properties. They have been used by many researchers in the f

3、ields of biomimetic imaging and biological imaging. However, because the semiconductor quantum dots contain some bad heavy metal elements, the organisms will cause some toxicity and potential may cause some harm to the environment, its shortcomings limit its further application. The fluorescent carb

4、on spot as is the most concerned about the current nano-materials, because it has a superior performance, a wide range of use in biological imaging, if the cells in the traditional fluorescent quantum dot imaging is particularly easy to make cell failure, Thus causing a certain adverse effect on the

5、 cell's life activity. The most important source of energy in cells is the most important source of adenosine triphosphate, which plays a particularly important role in maintaining the order of the organism. In this study, we used microwave synthesis to synthesize fluorescent light (CDs) by PEI

6、(polyetherimide) and glycerol microwave heating to establish the method of detecting ATP content in intracellular ATP. Adenosine triphosphate reaction, the ATP content and the system measured in the carbon number was linear relationship.Key words:Carbon point;Aptamer; Adenosine triphosphateAbstract目

7、 錄摘 要I前 言11 文獻(xiàn)綜述21.1 概述21.2 碳點的應(yīng)用21.2.1 在生物成像的應(yīng)用21.2.2 作發(fā)光材料的應(yīng)用31.2.3 作光催化劑的應(yīng)用41.2.4 作藥物載體的應(yīng)用51.2.5 作檢測探針的應(yīng)用61.3 本課題的研究意義與研究內(nèi)容72 實驗部分93 結(jié)果與討論結(jié) 論參考文獻(xiàn)致 謝目錄前 言碳點作為目前最受關(guān)注的新新納米熒光材料，因為其具有比較好的各項性能而受到了科研者們的特別關(guān)注。用于制作碳點的碳源可供使用的材料比較多，如果想制得碳點會有許多種不同的制作方法。至今為止，碳點已慢慢成為碳材料群體里冉冉升起的新星。就現(xiàn)有的研究成果發(fā)現(xiàn)，大家都主要在研究如何去制備碳點，還有碳點

8、在不同的領(lǐng)域它是如何利用和使用的。如果用微波法制備碳點合成速度往往更快一些，而且加熱也更均勻一些。以本研究擬采用微波合成法對PEI(聚醚酰亞胺)與丙三醇微波加熱反應(yīng)制得熒光碳點(CDs)。然后用投射電子顯微鏡、X射線光電子能譜分析等技術(shù)對合成的硫摻雜碳點進(jìn)行光譜性質(zhì)、粒徑大小這些參數(shù)進(jìn)行表征。在最合適的條件下所制得的硫摻雜碳點不僅有產(chǎn)物產(chǎn)率比較高的特點，還有較為均勻的粒徑分布，光也比較穩(wěn)定，可以長時間保存等這些優(yōu)點。1 文獻(xiàn)綜述1.1 概述三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，簡稱為ATP)是活細(xì)胞內(nèi)的一種高能磷酸化合物。ATP在全部的生命體中都存在，特別方便保存和使用，是

9、細(xì)胞死亡和新生所需要的重要能量。在一般的反應(yīng)中，基本都是通過釋放磷酸分子而起到放出能量的目的，對保持生物體的正常性能維持有著不可替代的用處。測定細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷含量對細(xì)胞機(jī)體的代謝和活性都具有比較大的意義。碳點是一種逐漸壯大發(fā)展的熒光納米材料1-3，最開始是Xu課題組4處理用電弧因放電而產(chǎn)生的煙灰并用它來制得單層碳納米管時，無意間發(fā)現(xiàn)了一種發(fā)熒光的物質(zhì)，剛一被發(fā)現(xiàn)，它便吸引了許多研究者的目光去鉆研其各項特性。而且它自身存在很多的優(yōu)勢， 比如能耐光可漂白、光比較平穩(wěn)、光強(qiáng)高、激發(fā)波長和發(fā)射波長能改變這些好處；與此同時, 跟已經(jīng)大批量投入使用的納米熒光顆粒相比, 又具有生物相容性好、低分子量、毒性

10、低和小粒徑等這些特點, 在生物成像5-8等許多范疇都具有很好的利用遠(yuǎn)景?？墒牵瑹晒馓键c在分析檢測中的運(yùn)用卻很少有報導(dǎo)。1.2 碳點的應(yīng)用1.2.1 在生物成像的應(yīng)用就一般我們比較常見的量子點來說，不管是在生物體內(nèi)部還是在生物體外部都可以進(jìn)行光學(xué)方面的成像試驗，但不管是對于人的身體健康來說還是對環(huán)境來說，因為它具有一定的危害性，在極大程度上將導(dǎo)致它的用途會受到一定的限制和影響9。只有具有低微毒性和具有生物相容性的碳點才有極大的可能去代替量子點，從而在生物成像上發(fā)揮出足夠重要的作用。碳點的表面比較容易被修飾，可以使用它表面的羧基，羥基和氨基這些官能團(tuán)，然后在它的表面連接到核酸適配體，因為它對生物分

11、子具有比較特殊的識別標(biāo)記作用，可用于對待測分子進(jìn)行精準(zhǔn)的選擇和較高靈敏度的檢測。最早的時候Sun10課題小組對碳點生物成像方面進(jìn)行了一定的研究分析。他們在含有碳點的培育基中接種了MCF-7細(xì)胞，然后培養(yǎng)了大約2小時后，在熒光顯微鏡中看到了通亮的熒光從細(xì)胞周圍發(fā)出，在此實驗中可以直觀的觀察到生物體的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)大部分都充滿了熒光。Ray課題小組11將碳點放進(jìn)含有艾氏腹水癌細(xì)胞（EACS）的溶液當(dāng)中，此溶液的濃度約為107 cell/mL，通過研究此實驗的現(xiàn)象，他們發(fā)現(xiàn)了碳點可以不需要經(jīng)過被酸氧化和表面發(fā)生鈍化，就能夠迅速并且直接的滲透到細(xì)胞內(nèi)部。而劉等人制出了粒子徑長大致約為1.52納米的粒子

12、碳點，這種碳點可被小鼠P19祖細(xì)胞和大腸桿菌細(xì)胞所吸收攝取，它的熒光激起波長大約是在458514納米這個區(qū)域之間，具有很強(qiáng)的光穩(wěn)定性。如果碳點能夠和多肽或者轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合在一起，將會更方便碳點從細(xì)胞膜穿過，從而增強(qiáng)它對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的標(biāo)記識別功能。Li課題組12制備碳點先使用的是支架法，然后再對含有氨基端基的化合物進(jìn)行鈍化其表面的步驟，讓它能夠和轉(zhuǎn)鐵蛋白相互結(jié)合，得到與之共軛的轉(zhuǎn)鐵蛋白碳點（Tf-CDs）。之后把已共軛和沒有共軛的碳點與HeLa 細(xì)胞一同培育，發(fā)現(xiàn)已共軛細(xì)胞的熒光亮度明顯大幅度增強(qiáng)。在生物成像領(lǐng)域，使用純天然原料制備而成的碳點也得到了成功的應(yīng)用，例如Sahu課題組13使用水熱處理法一

13、步制備的碳點具有強(qiáng)烈的綠色熒光，不僅如此它還能夠有效進(jìn)入人骨肉瘤細(xì)胞（MG-63），然后被波長為488納米的光激起發(fā)出清晰的綠色熒光。以上這些研究都說明了碳點的熒光性能將為它在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用研究開辟一個更寬廣的前景。1.2.2 作發(fā)光材料的應(yīng)用Guo 課題組14通過在高溫下熱分化處理含有大量環(huán)氧基的聚苯乙烯之后，制備出了不同顏色的熒光碳點（如圖1所示）。Wang等人實驗所用溶液的溶劑是十八碳烯，表面鈍化劑使用的是1- 十六烷胺，然后以檸檬酸作碳源來制碳點。當(dāng)通過的電流達(dá)到5 Ma/cm2 這種密集程度時，用此碳點合成物件的外部最大效力為百分之零點零八三，可被觀測到的顯色程度為八十二。圖1

14、通過發(fā)光晶體的碳點因為受熱而產(chǎn)生分解的圖像在大氣中Qu課題組15把含有碳點的水溶液涂抹在紙上并進(jìn)行干燥處理，碳點的熒光與碳點覆蓋的紙張兩者發(fā)出的熒光相似，可用于信息加密和防偽。而且還可以與市面上售賣的能發(fā)出熒光的綠色油墨實行兩重加密（圖 2a）。在被藍(lán)色光激起下，表面出現(xiàn)熒光數(shù)字“888”，顏色為綠色；在被綠色光激起下，市面上所賣的那種可發(fā)出熒光的綠色墨水卻沒有發(fā)光，只能看到碳點發(fā)出了赤色熒光，數(shù)字為“395”。在確定了這類碳點沒有毒的前提之下，在藍(lán)光激發(fā)下然后再涂抹在人的皮膚上可觀察到發(fā)出綠色熒光，而且能夠很容易地用水沖洗掉（圖2b、c）。碳點作為發(fā)光材料使用也表現(xiàn)出了其比較優(yōu)越的性能。圖

15、2 （）當(dāng)在不一樣的波長下在水里溶了碳點的溶液和售賣的發(fā)光綠色油墨各自發(fā)出熒光的區(qū)別圖；（）人身體上用發(fā)熒光碳點的書寫表現(xiàn)圖；（）有亮光的指紋用碳點構(gòu)成的除此之外，如果把碳點應(yīng)用到可以發(fā)光的材料上，比如可以用到發(fā)光二極管的器件、宏觀的結(jié)構(gòu)材料和可以發(fā)熒光的油墨等這些物件上面，它們都將會有非常有潛力的發(fā)展。1.2.3 作光催化劑的應(yīng)用光的氧化還原反應(yīng)和催化反應(yīng)技術(shù)在能源領(lǐng)域、綠色化學(xué)處理及環(huán)境研究領(lǐng)域都占有非常大的比例，而且在這些領(lǐng)域都表現(xiàn)了其不錯的優(yōu)越性并有著很好的發(fā)展方向。在新能源、綠色化學(xué)等領(lǐng)域，光的催化氧化還原反應(yīng)是一種非常有前景的化學(xué)工藝。跟別的納米質(zhì)料相比來說，在這一范疇碳點因為具有

16、良好的的物理化學(xué)性質(zhì)（如光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移、氧化還原性）表現(xiàn)出了很好的利用遠(yuǎn)景。Li課題組16的實驗所用到的碳源是葡萄糖，此實驗通過超聲作用獲得碳點，在溶液呈堿性的條件下放入硫酸銅和聚乙烯吡咯烷酮，然后獲得了一種共同物CDsCu2O，他們還通過電解石墨棒的電化學(xué)合成方式獲得了粒徑為14 納米的碳點。在近紅外光下使苯甲醇通過H2O2的氧化催化作用得到苯甲醛，轉(zhuǎn)化率高達(dá)百分之九十二，選擇性甚至達(dá)到了百分之百（圖 3）。圖3碳點100%選擇性的示意圖除了這些以外，碳點復(fù)合材料還可以通過光催化作用來有效降低分解廢棄污染物的不良性能。就比較常見常用的光催化材料（比如TiO2）和一般的半導(dǎo)體量子點而言，它們都

17、是因為帶隙過于寬的原因，只能局限性的吸收到近紫外光線和紫外光線。但是碳點卻能夠進(jìn)行上轉(zhuǎn)換，它可以吸收到可見光線。2010年，Kang課題組17使用Sol-Gel法制備了碳點和二氧化鈦的復(fù)合材料與碳點和二氧化硅的復(fù)合材料，而且他們還證明了自己的猜想，確認(rèn)了這兩種含有碳點的復(fù)合材料在能見光的照射下可以分解亞甲基藍(lán)。由以上實驗發(fā)現(xiàn)碳點是具有很大發(fā)展前景的一種對光有感知識別作用的催化材料。1.2.4 作藥物載體的應(yīng)用因為我們常見的這些藥物它們沒有能被查看的性能，也不能夠被定位去觀察它的性能，如果可以用發(fā)熒光的納米碳點作為藥物的載體，那便有可能解決這些問題。賴課題組18在很熱的溫度下把甘油高溫?zé)峤獾玫教?/p>

18、點，然后再把介孔納米這種粒子包起來，最后再用PEG來潤色。將一種用來抵御癌癥的叫做阿霉素（DOX）的藥物用PEG來潤色一下，再去研究DOX這種藥物在HeLa細(xì)胞中的接收速率。納米復(fù)合材料在阿霉素中通過PEG修飾經(jīng)由內(nèi)吞作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，不同于阿霉素的被動運(yùn)輸，此過程中細(xì)胞的攝入速度得到了一定提高。CDs和阿霉素在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分別發(fā)赤色和藍(lán)色熒光（圖4），根據(jù)這種同色熒光卻比例不同的情況，在原位置可以迅速看到阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的釋放效果如何，從而CDs實現(xiàn)了作為藥物載體的可觀測性與可追溯性。該實驗合成碳點的方法不僅操作簡單，而且易于工業(yè)化批量生產(chǎn)。因為生物體對能見光區(qū)具有很強(qiáng)的吸收性能，而且碳點

19、在藥物的傳遞領(lǐng)域和靶向定位治療領(lǐng)域都有著比較寬泛的使用前景，所以將熒光碳點用在含有藥物的載體上面會有很大的可能性處理并且解決這些比較困難的問題，比如一般常見的藥物載體不能被追蹤和觀察到等情況。圖4 在Hela細(xì)胞培養(yǎng)基中負(fù)載阿霉素的經(jīng)PEG修飾的碳點差別時刻的熒光圖象（ac）；Hela細(xì)胞248小時后細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的熒光光譜（d）1.2.5 作檢測探針的應(yīng)用碳點作為一種新的帶金屬離子的熒光探針，容易被電子受體在溶液中輕易猝滅，它可以被用來測驗存在于溶液里面的的這些金屬離子，并能在一定范圍內(nèi)測定它的濃度，之后可以進(jìn)行痕量分析19測定。要想制備碳點，就制備碳點的碳源來說，它不僅有很多制備來源而且很

20、便宜，大多采用天然氣煙灰、蠟燭燒的灰、西瓜的皮等這些草本植物。劉課題組20用水熱法對禾本科植物進(jìn)行處理，完成了水溶性氮摻雜碳量子點的制備實驗，并且對水樣中的Cu2+也成功地進(jìn)行了檢測，溶液上限為1 nmolL。薩利納斯卡斯蒂略組21在180攝氏度聚乙烯亞胺分子的存在下，通過熱分解檸檬酸，獲得了均勻粒徑為12納米的碳點，該碳點不僅具有上轉(zhuǎn)換和下轉(zhuǎn)換熒光性質(zhì)，還有好的水溶性，可應(yīng)用于檢測細(xì)胞內(nèi)的銅離子。此實驗對Cu2+的選擇性數(shù)據(jù)表明，排除掉三價鐵離子，其它離子對于檢測結(jié)果沒有太大的影響（圖5）。圖5（a）碳點對銅離子的選擇性；（b）碳點對銅離子檢測的影響（不同離子下）。350納米紫外光下激起灰色

21、，850納米近紅外光激起黑色通過微波處理甘油和PEG1500，Lin等人22獲得了均勻粒徑為35 納米的碳點，在紫外光（ex 365nm，熒光量子產(chǎn)率12）下發(fā)出了特別耀眼的綠色熒光。表面經(jīng)過絲氨酸修飾潤色的碳點，可用于測定亞硝酸鹽。實驗結(jié)果表明，在1.0x10-71.0x10-5摩爾每升之間熒光強(qiáng)度與NO2-的濃度呈線性關(guān)系。該碳點也已經(jīng)成功的用于檢測河水，純奶，還有水池水中的亞硝酸鹽含量。Zhao等人制備的碳點23在可見的紫外線區(qū)域不能被吸收，這種具有羧基功能化的碳點是通過氨基十一烷酸和檸檬酸縮合制備而得到的，更貼近于量子點的性能。因為Eu3+ 對PO43-具有一定的選擇性，可以用它來調(diào)控

22、碳點從而獲得“off-on”式熒光探針，并用于人工濕地上檢測磷酸鹽含量。Xu課題組24制備了以葡萄糖為碳源并且可溶于水的碳點，然后將TBA29和TBA15兩個氨基色凝血酶適體轉(zhuǎn)移到二氧化硅納米顆粒和碳點中，便可形成“碳點-凝血酶-SiO2納米顆?！边@樣的夾層構(gòu)局。此方法的檢出限為1 nmolL，而且靈敏度跟之前的報道相比也有了明顯的提高。此外，碳點也被廣泛的用于其他金屬離子的檢測中。1.3 本課題的研究意義與研究內(nèi)容碳點作為一種新新的納米材料，具備不同于其他材料的發(fā)光機(jī)能、生物互容性、優(yōu)越的化學(xué)穩(wěn)定性和概況功效可調(diào)理性等特色。它所具有的光可調(diào)性、耐光性、高熒光強(qiáng)度等特征，已成功應(yīng)用于生物檢測探

23、針的合成和研究。然而卻因為碳點的熒光量子產(chǎn)出率比較低，成為了其使用受到一定限制的問題所在。碳點的發(fā)光機(jī)理及其結(jié)構(gòu)的研究仍處于初步的摸索階段，因此應(yīng)加大發(fā)光機(jī)理方面的研究力度，從而為有效提高熒光量子產(chǎn)率提供理論指導(dǎo)。在各位前輩的研究基礎(chǔ)上，本課題擬用聚乙烯亞胺和丙三醇作為前驅(qū)體，通過微波法合成量子產(chǎn)率高的熒光碳點，基于三磷酸腺苷適配體與碳點之間的靜電作用，使碳點熒光猝滅，當(dāng)有三磷酸腺苷存在時，由于適配體與三磷酸腺苷之間的特異性結(jié)合而使碳點熒光恢復(fù)，從而實現(xiàn)基于碳點熒光恢復(fù)的三磷酸腺苷檢測。參考文獻(xiàn)顏范勇,鄒寧,王猛,等.熒光碳點制備及應(yīng)用J.化學(xué)進(jìn)展,2014,26(1):6174韓文英.熒光碳

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