表皮生長因子和維生素A對高濃度葡萄糖抑制腹膜間皮細胞增殖和分化的影響

1、    表皮生長因子和維生素A對高濃度葡萄糖 抑制腹膜間皮細胞增殖和分化的影響        【摘要】目的研究表皮生長因子(EGF)和維生素A(Vit A)對高濃度葡萄糖抑制腹膜間皮細胞增殖和分化的影響，以探討EGF和Vit A在腹膜修復(fù)中的作用。方法采用胰蛋白酶消化法，從人腹膜組織中分離間皮細胞，并建立體外人腹膜間皮細胞(HPMC)培養(yǎng)模型；以3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法測定細胞內(nèi)DNA含量示細胞增殖程度；以免疫組織化學(xué)染色法，用像分析儀測細胞表面角蛋

2、白和波形蛋白(vimentin)表達量示細胞分化程度。結(jié)果隨著葡萄糖濃度增高和培養(yǎng)時間的延長，HPMC 3 H-TdR摻入降低；EGF和Vit A可增加HPMC對3H-TdR的摻入，但兩者cpm值比較無顯著性差異(P0.05)；在含高濃度葡萄糖的培養(yǎng)液中分別加入EGF或Vit A后，EGF可明顯促進HPMC的增殖，其3H-TdR摻入量明顯增加，與Vit A組比較有顯著性差異(P0.05)。EGF和Vit A不影響細胞表面角蛋白和波形蛋白的表達。結(jié)論EGF和Vit A對腹膜間皮細胞的分化未顯示出明顯作用，但兩者均可刺激細胞的增殖，特別是EGF可改善高濃度葡萄糖對腹膜間皮細胞的增殖抑制作用，這對C

3、APD患者損傷腹膜的再生修復(fù)以及促進其功能恢復(fù)可能有重要意義?！娟P(guān)鍵詞】表皮生長因子維生素A腹膜間皮細胞細胞增殖細胞分化 Effects of epidermal growth factor and vitamin-A on proliferation and differentiation of human peritoneal mesothelial cells inhibited by high concentration glucoseZANG Yan,LIU Hongfa,HOU Fanfan,et al.Department of Nephrology,Nanfang Hospit

4、al,Guangzhou 510515【Abstract】ObjectiveTo study the effects of EGF and VitA on the proliferation and differentiation of human peritoneal mesothelial cells(HPMC) inhibited by high concentration glucose and investigate their roles in the repair of peritoneal mesothelium. MethodsHPMC was separated with

5、trypsin and the synthesis of DNA was measured by 3H-TdR incorporation.The expression of keratin and vimentin on the surface of HPMC were measured by immunohistochemistry staining. ResultsEGF and VitA didn't effect the expression of keratin and vimentin on the surface of HPMC.3H-TdR incorporation

6、 of HPMC cultured in the medium containing high concentration glucose was decreased significantly than in the RPM-1640 alone(P0.05). EGF and VitA both increased the 3H-TdR incorporation,showing no significant difference.But 3H-TdR incorporation of HPMC cultured in the medium with high concentration

7、glucose and EGF was increased significantly(P0.05)than in the medium with high concentration glucose and VitA. ConclusionEGF and Vit A do not effect the differentiation of HPMC,but can ameliorate the inhibitive effect on proliferation of HPMC by high concentration glucose.It may play an important ro

8、le in the repair of damaged mesothelium and restoration of its function.【Key word】Epithelial growth factorVitamin APeritoneal mesothelial cellsCell proliferationCell differentiation持續(xù)性不臥床腹膜透析(CAPD)時腹膜長時間浸浴在腹膜透析液中，腹透液含高濃度葡萄糖、高滲透壓、低pH和乳酸鹽等生物不相容性因素。臨床研究顯示1，透析液進入腹腔后，透析液中的低pH值等在短時間內(nèi)即迅速平衡，而葡萄糖的濃度可持續(xù)升高數(shù)小時。

9、我們曾研究證實2，持續(xù)存在的高濃度葡萄糖可抑制腹膜間皮細胞增殖，從而阻礙損傷腹膜的修復(fù)；同時也證實3EGF有促進腹膜間皮細胞增殖的作用。但EGF能否影響HPMC的分化和高濃度葡萄糖對腹膜間皮細胞的增殖抑制作用，目前尚未見報道。EGF和Vit A是目前公認的上皮細胞分化和增殖因子。為此，我們采用體外人腹膜間皮細胞(HPMC)培養(yǎng)模型，研究EGF和VitA對腹膜間皮細胞分化和刺激增殖作用，及其對高濃度葡萄糖抑制腹膜間皮細胞增殖效應(yīng)的影響，以探討EGF和VitA在腹膜間皮細胞修復(fù)中的作用。材料與方法一、人腹膜間皮細胞的分離培養(yǎng)按我們先前建立的方法操作2。傳代細胞經(jīng)形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)鑒定具有間皮細胞特征

10、。免疫組織化學(xué)示抗細胞角蛋白、抗波形蛋白(vimentin)抗體(購自Dako公司)染色陽性；抗第因子相關(guān)抗原(購自Dako公司)和抗白細胞CD45抗原的抗體(購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)染色陰性。二、不同濃度葡萄糖對腹膜間皮細胞增殖的影響取第二代培養(yǎng)的HPMC，用RPM-1640(含5 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、1 mg/L氫化可的松、抗生素等，用前加入10%小牛血清)培養(yǎng)板調(diào)整細胞懸液濃度為1×105ml，加入96孔培養(yǎng)液中，每孔100 l。設(shè)實驗組葡萄糖終濃度分別0.5、1.0、1.5、2.5、4.25%，同時設(shè)一對照組(單純RPM-1640培養(yǎng))，放置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、4

11、8、72小時，分別于培養(yǎng)結(jié)束前6小時加入3 H-TdR(胸腺嘧啶核苷，中國原子能科學(xué)研究院產(chǎn)品)，每孔0.5 Ci，培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞，液閃儀測3H-TdR摻入量(用cpm值表示)。三、EGF和VitA對腹膜間皮細胞增殖的影響同上，取第二代培養(yǎng)的HPMC接種在96孔培養(yǎng)板上，分別加入不同濃度的EGF(5、10、20、50、100 ng/L)或 VitA(10-8、10-7、5×10-7、10-6、5×10-6 mol/L)，每個因素組設(shè)一對照(單純RPM-1640培養(yǎng)液)，于37、5%CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)24、48、72小時，在培養(yǎng)結(jié)束前6小時加入3H-TdR(胸腺嘧啶核

12、苷，中國原子能科學(xué)研究院產(chǎn)品)，每孔0.5 Ci，培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞，液閃儀測3H-TdR摻入量(用cpm值表示)。四、EGF或VitA對不同濃度葡萄糖抑制腹膜間皮細胞增殖的影響方法同上，將第二代HPMC接種在96孔培養(yǎng)板上。設(shè)兩個不同因素實驗組，即EGF加不同濃度葡萄糖組和VitA加不同濃度葡萄糖組；葡萄糖濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5、4.25%，EGF終濃度為50 ng/L，VitA終濃度為5×10-6 md/L，同時設(shè)一對照組(單純的RPM-1640加EGF或VitA，EGF和VitA的終濃度同上)。放置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，于培養(yǎng)結(jié)束前6小時加入3

13、H-TdR(胸腺嘧啶核苷，中國原子能科學(xué)研究院產(chǎn)品)，每孔0.5 Ci，培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞，液閃儀測3H-TdR摻入量(用cpm值表示)。五、EGF和VitA對腹膜間皮細胞分化的影響取第二代HPMC接種在蓋玻片上，放入培養(yǎng)皿中，分別加入含EGF(終濃度為50 ng/L)或VitA(終濃度為5×10-6 mol/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時，然后用抗細胞角蛋白抗體和抗vimentin抗體(均購自Dako公司)作為特異抗體，以ABC免疫組織化學(xué)染色。在Quantimet 520+型像分析儀上進行分析，以每組100個細胞著色面積積分平均值表示HPMC表面相應(yīng)抗原含量。六、數(shù)據(jù)處理全部數(shù)據(jù)采用B

14、ASE統(tǒng)計軟件進行處理，結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示，對實驗結(jié)果進行方差分析，配對t檢驗，P0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果一、不同濃度葡萄糖對腹膜間皮細胞增殖的影響HPMC與不同濃度葡萄糖共同培養(yǎng)24、48、72小時后，測其3H-TdR摻入量，結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的增高和培養(yǎng)時間的延長，3H-TdR摻入量降低(P0.05)，見1。1人腹膜間皮細胞在不同培養(yǎng)條件下?lián)饺?H-TdR的變化二、EGF和VitA對腹膜間皮細胞增殖的影響用EGF或VitA分別與HPMC培養(yǎng)24、48、72小時，測其3H-TdR摻入量，結(jié)果表明，EGF和VitA均能增加HPMC對3H-TdR的摻入，

15、并且HPMC的增殖與EGF和VitA呈劑量依賴，其中EGF的最大刺激增殖劑量為50 ng/L、VitA為5×10-6mol/L，見2，3。兩者比較EGF刺激HPMC后的3H-TdR摻入量略高于VitA，但無顯著性差異(P0.05)。2不同濃度EGF和培養(yǎng)時間對腹膜間皮細胞增殖的影響3不同濃度VitA和培養(yǎng)時間對腹膜間皮細胞增殖的影響三、EGF或VitA對不同濃度葡萄糖抑制腹膜間皮細胞增殖的影響HPMC培養(yǎng)在含50 ng/L EGF加不同濃度葡萄糖或5×10-6mol/L VitA加不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)72小時，同樣測其3H-TdR摻入量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加EGF的實驗組H

16、PMC的3H-TdR摻入量明顯高于加VitA組，見4，兩組比較有顯著性差異(P0.05)。表明EGF有明顯的改善高濃度葡萄糖對腹膜間皮細胞的增殖抑制作用。4EGF和VitA對不同濃度葡萄糖抑制腹膜間皮細胞增殖的影響四、EGF和VitA對腹膜間皮細胞分化的影響EGF和VitA刺激的間皮細胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后，像分析儀分析結(jié)果顯示，細胞表面角蛋白和波形蛋白的著色面積積分平均值分別為：EGF組0.0671±0.0164，VitA組0.0674±0.0135，對照組0.0642±0.0144，三組之間比較無顯著性差異(P0.05)。表明EGF和VitA均不影響HPMC的

17、分化。討論間皮細胞是構(gòu)成腹膜的最主要細胞群體，其結(jié)構(gòu)完整對腹膜功能的行使至關(guān)重要。以往研究證實，腹膜透析并發(fā)腹膜炎時，由于間皮層受損，部分間皮細胞從腹膜脫落，組織病理學(xué)研究也顯示，感染腹膜的間皮層喪失4。但大量研究資料表明，腹膜間皮細胞具有強大的再生能力，在炎癥控制后其可通過再間皮化而迅速修復(fù)損傷的腹膜5。然而，CAPD時由于患者的腹膜長時間浸浴在含高濃度葡萄糖的透析液中，特別是在腹膜炎時，由于腹膜的超濾功能降低，臨床常使用高濃度的葡萄糖透析液行CAPD，此時可加重腹膜間皮細胞的損傷、抑制腹膜間皮細胞的增殖，不利于損傷腹膜的修復(fù)。因此，在此特殊時期，除臨床上應(yīng)盡量避免使用高濃度葡萄糖透析液以減

18、少對腹膜間皮層的損害和增殖抑制作用外，尋找一種腹膜間皮細胞保護和修復(fù)因子顯得更加重要。近年研究表明，EGF和VitA有促進上皮細胞分化和增殖，加速損傷組織再生和修復(fù)的作用6，7。我們曾研究證實EGF可促進腹膜間皮細胞增殖；VitA刺激上皮細胞分化和增殖的作用也已在其它細胞模型上得到證實。但由于腹膜間皮細胞是一類非常特殊的上皮細胞，與起源于內(nèi)胚層或外胚層的大多數(shù)上皮細胞不同，它起源于中胚層，可同時表達上皮細胞和纖維細胞特征性的中間纖維角質(zhì)蛋白和波形纖維蛋白，其表達量隨培養(yǎng)條件和生長速度不同而表現(xiàn)為類上皮型或類纖維型細胞8。EGF和VitA促進間皮細胞向哪種類型細胞分化，它們能否改善高濃度葡萄糖對腹膜間皮細胞的增殖抑制效應(yīng)，迄今尚未見研究報道。我們的體外細胞模型研究結(jié)果顯示，EGF和VitA未改變HPMC表面角質(zhì)蛋白和波形蛋白的表達量，表明EGF和VitA不影響HPMC的分化。但兩者均可刺激HPMC增殖，其中EGF的作用略強于VitA，但兩者無明顯差異；同時發(fā)現(xiàn)EGF有改善高濃度葡萄糖對HPMC的增殖抑制效應(yīng)，即用EGF和高濃度葡萄糖作用的HPMC 3H-TdR摻入量明顯高于單純高濃度葡萄糖作用的HPMC的3H-TdR摻入量，而VitA組卻未顯示出此作用。關(guān)于EGF影響高濃度葡萄糖抑制間皮細胞增殖效應(yīng)的機制尚不清楚，推測可能是EGF