慢病毒生產(chǎn)及使用操作手冊(cè)

1、慢病毒生產(chǎn)及使用操作手冊(cè)一、實(shí)驗(yàn)流程制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 和 72h 后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。以下內(nèi)容由漢恒生物科技（上海）有限公司精心整理總結(jié)。二、實(shí)驗(yàn)材料（一）慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pHBLVTM 系列質(zhì)粒。1、載體信息（見附錄）2、細(xì)胞株293T,慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為DMEM（含10% FBS）貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖

2、形成單層細(xì)胞。3、菌株 大腸桿菌菌株DH5”。用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。三、包裝細(xì)胞293T 細(xì)胞的培養(yǎng)（一）293T 細(xì)胞的凍存隨著傳代的次數(shù)增加，293T 細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長狀態(tài)下降、突變等。為了防止此類現(xiàn)象的出現(xiàn)， 我們需要在開始就對(duì)細(xì)胞進(jìn)行大量凍存，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。1、去掉上清液，加入 PBS洗去殘留的培養(yǎng)基；2、加入的胰酶，消化12min后，鏡下觀察細(xì)胞變圓，細(xì)胞間間隙加大時(shí)， 去除胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，移入離心管中。3、細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞全部晃下，加入 3mL 37 C預(yù)熱的10% DMEM ,用10mL移 液

3、管進(jìn)行吹打，較大力吹打68次即可，不留死角，之后，將所有細(xì)胞吸出，置于15mL離 心管中， 取 50ul 混勻后的細(xì)胞于eppendorf 管中， 加 入 450ul 10DMEM， 即為 10 倍稀釋，混勻，取10ul 細(xì)胞于計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共4 大格，每大格16 小格。計(jì)數(shù)時(shí)， 4 大格均計(jì)數(shù)，總數(shù)除以4（得每大格細(xì)胞數(shù)），再乘以10（ 10 倍稀釋） ，即 為實(shí)際 n 萬 /mL 細(xì)胞濃度。4、細(xì)胞離心，1000rpm ， 5min 。去掉上清。5、 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液（ 70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO） ,重懸細(xì)胞，密度為3 x 106 個(gè) /ml 。

4、6、分裝進(jìn)細(xì)胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80超低溫冰箱。7、第二天將細(xì)胞放于液氮罐中長久保存，并作記錄。保存過程中，要不時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞檢 測細(xì)胞存活率，觀察細(xì)胞狀態(tài)等。（2） 293T 細(xì)胞的傳代當(dāng)細(xì)胞生長到匯合率達(dá)到 80%90%時(shí)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維 持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。1、消化細(xì)胞，方法同細(xì)胞凍存。2、細(xì)胞離心結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。3、根據(jù)具體情況，將細(xì)胞分到10cm 培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿補(bǔ)足到10ml 培養(yǎng)基。4、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放回 37C、5%CO2和95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3） 293T 細(xì)胞的復(fù)蘇當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過多，細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)，或者細(xì)胞出現(xiàn)污

5、染事故時(shí)，需要丟棄并對(duì)最初凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。1、設(shè)置溫度為 3742 c的水浴。2、查看細(xì)胞庫記錄，根據(jù)記錄從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng)，盡量在 12min內(nèi)使細(xì)胞溶液完全溶解。3、將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中，并在其中加上1ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻后離心， 1000rpm ， 5min。4、去掉上清，加入5ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻沉淀后，轉(zhuǎn)入6cm 培養(yǎng)皿。5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入 37C、5%CO2和95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、第二天觀察細(xì)胞存活率。給細(xì)胞換一下培養(yǎng)基。以后每天觀察細(xì)胞生長情況。四、慢病毒包裝和濃縮（一）

6、質(zhì)粒擴(kuò)增構(gòu)建好的慢病毒載體和輔助質(zhì)粒需經(jīng)過大量抽提，濃度大于1ug/ul,A260/280在間方可用以包毒。推薦使用 Qiagen大抽試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的大量去內(nèi)毒素抽提。（二）傳293T細(xì)胞將培養(yǎng)293T細(xì)胞T75瓶中的培養(yǎng)基吸凈，加入 2mL 4度冰箱取出的胰酶，使其均勻 覆蓋瓶底，置于37度培養(yǎng)箱中3-5min,取出，搖晃可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞于底部脫離，將其全部晃下，加入3mL 37度水浴中預(yù)熱的10% DMEM,移液槍用10mL移液管進(jìn)行吹打，較大力吹打 6-8次即可，不留死角，瓶口處較難吹打可將移液管對(duì)準(zhǔn)培口，小力將培養(yǎng)基打出即可覆蓋 到接近瓶口的細(xì)胞。之后，將所有細(xì)胞吸出，置于15mL離心管中，

7、取50ul混勻后的細(xì)胞于eppendof管中，加入450ul 10% DMEM ,即為10倍稀釋，混勻，取 10ul細(xì)胞于計(jì)數(shù)板中 計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共 4大格，每大格16小格。計(jì)數(shù)時(shí)，4大格均計(jì)數(shù)，總數(shù)除以 4 （得每大 格細(xì)胞數(shù)），再乘以10 （10倍稀釋），即為實(shí)際 n萬/mL細(xì)胞濃度。傳代當(dāng)天記為第一天， 若第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，鋪 900-1000萬/T75;若第三天轉(zhuǎn)染，鋪 350-400萬/T75。每瓶T75加 10mL 10%DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染當(dāng)天觀察細(xì)胞密度，80-90 %滿即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前無需換 J口喬9。（三）做月旨轉(zhuǎn) complexDMEM需在37度水浴中預(yù)熱，LipoFi

8、terTM轉(zhuǎn)染試劑需恢復(fù)至室溫方可使用，使用前需 搖勻。轉(zhuǎn)染每瓶T75的complex成分如下：pspax10dgPMD2G10 dgpHBLVTM系列載體10 dg轉(zhuǎn)染后6h換新鮮培液。注：LipoFiterTM轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品，使用說明參考 LipoFiterTM說明書。（四）病毒收集轉(zhuǎn)染后48和72h分別兩次收集病毒上清（24h收集后置換新鮮培液），收集后以濾器過濾，于40 mL超速離心管中，4C, 72000g/min離心120分鐘；（五）病毒重懸和保存500ul 新鮮培養(yǎng)液重懸病毒沉淀，置于-80 度甚至液氮保存。五、感染目的細(xì)胞（一）細(xì)胞準(zhǔn)備將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞接種到24孔板

9、，使細(xì)胞濃度為1X 105/mi細(xì)胞，接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進(jìn)行病毒感染的時(shí)候細(xì)胞匯合率介于50%至 70%直接。（二）病毒感染的選擇：Polybrene: 是帶正電的小分子，與細(xì)胞表面的陰離子結(jié)合，提高慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率 210倍。Polybrene 有一定的細(xì)胞毒性，有的細(xì)胞對(duì)polybrene 的毒理反應(yīng)明顯，因此細(xì)胞感染時(shí)是否適合polybrene需要摸索；不同細(xì)胞對(duì)polybrene的敏感度不同，可以用 1lOg/ml的范圍篩選合適的濃度，以24h 內(nèi)細(xì)胞無明顯毒性反應(yīng)為佳，可參考文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，p

10、olybrene最常用的工作濃度為68（ig/ml注： 1 ）漢恒生物的自產(chǎn)的Polybrene 產(chǎn)品，用戶可用以進(jìn)行輔助感染。提供的Polybrene 母液保存在-20 （可保存1 年以上）， 避免反復(fù)凍融3 次以上， 否則活性受影響。4 可保存 2 周。2） Polybrene 預(yù)實(shí)驗(yàn)請(qǐng)先以對(duì)照病毒進(jìn)行摸索，部分細(xì)胞系MOI 及 Polybrene 的使用參見附表2。2 . 感染細(xì)胞最佳MOI 的測定MOI（ Multiplicity of Infection ， 感染復(fù)數(shù)）是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù)，通常 MOI 越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達(dá)量越高。對(duì)于分裂活躍的細(xì)胞，比

11、如Hela、293細(xì)胞，MOI=13時(shí)，80%以上的細(xì)胞均表達(dá)目的基因。而對(duì)于非分裂細(xì)胞，比如原代細(xì)胞，感染效率較低。需要進(jìn)行MOI 梯度摸索實(shí)驗(yàn)，選擇適合的MOI 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3 .感染步驟按實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞鋪板（比如12 孔板）。細(xì)胞數(shù)以第2 天密度約50%為宜。37 培養(yǎng)過夜。對(duì)于Polybrene可施加的細(xì)胞：準(zhǔn)備完全培養(yǎng)基和Polybrene混合物，Polybrene終濃度為摸索得到的最適終濃度。 移去培養(yǎng)基并添加 ml Polybrene/培養(yǎng)基混合物于每孔中 （適 用于24孔板，其他孔板請(qǐng)相應(yīng)調(diào)整體積。）對(duì)于不適用Polybrene的細(xì)胞，以上步驟省略，直接進(jìn)入下面步驟。感染前，從冰

12、箱取出并在37c水浴中快速融化病毒，吸去細(xì)胞原有培養(yǎng)基，加入1/2體積新鮮培養(yǎng)基，再將病毒原液加入細(xì)胞中，輕輕 8字混勻。（具體加入的病毒數(shù)可參考附 表1） 37 c小體積感染4小時(shí)，4小時(shí)后補(bǔ)齊培養(yǎng)基至正常體積。（感染時(shí)培養(yǎng)基體積表格 如下）病毒小培養(yǎng)體積感染表皿色表面積/cm2對(duì)應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液體 積病毒感染對(duì)應(yīng)細(xì)胞 培養(yǎng)液體積96-well100ul50ul24-well2cm2500ul250ul12-well4cm21ml500ul6-well10cm22ml1ml60mm20cm24ml2ml100mm60cm210ml5ml慢病毒感染4小時(shí)后補(bǔ)足至培養(yǎng)體積，感染24小時(shí)后換液，腺病毒

13、感染2小時(shí)后直接換液感染后第二天（約24小時(shí)），吸去含病毒的培養(yǎng)液， 換上新鮮的完全培養(yǎng)液， 繼續(xù)37 c 培養(yǎng)。感染后48小時(shí)，對(duì)于帶 GFP報(bào)告基因的病毒，可通過熒光顯微鏡觀測GFP表達(dá)效率,對(duì)于攜帶Puromycin抗性基因的病毒，換上含適當(dāng)濃度的 Puromycin的新鮮完全培養(yǎng)液，篩 選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株（詳見下方）。注意：溶化的shRNA慢病毒顆粒置于冰上。反復(fù)凍溶或長時(shí)間將病毒顆粒暴露于常 溫可使病毒效價(jià)降低?？剐院Y選：Puromycin標(biāo)準(zhǔn)的施加終濃度范圍為110科/ml,不同細(xì)胞puromycin的工作濃度不同,請(qǐng)查找相關(guān)文獻(xiàn)（部分細(xì)胞參考用量見下圖），另外請(qǐng)?jiān)O(shè)不感染篩選對(duì)照（

14、未經(jīng)過病毒感染的野生型細(xì)胞），加入等量等濃度的puromycin。部分細(xì)胞puromycin參考值Cell lineSpeciesPuromycin （禮 g/ml）293Human3HeLaHuman3B16Mouse1-3Hamster10MC3T3-E1Mouse10H9C2Rat1MCF-7Human1-3MDA-MB- XXXHuman1-3HepG2Human2HT1080Human1A549HumanH1299Human2Human embroyonic stem cells (Human ESC§Human1更多Puromycin使用濃度更新中，詳情請(qǐng)參考公司網(wǎng)站每2

15、-3天換含puromycin的完全培養(yǎng)液一次，至不感染篩選對(duì)照組細(xì)胞被puromycin殺光，可進(jìn)行以下兩步操作（依照具體實(shí)驗(yàn)需要選擇）。不挑取單克隆：將感染并篩選后的細(xì)胞進(jìn)行傳代，并繼續(xù)施加puromycin進(jìn)行維持性篩選培養(yǎng)。連續(xù)篩選并傳3代后，凍存保重穩(wěn)定細(xì)胞株。挑取單克?。簩⒏腥静⒑Y選后的細(xì)胞挑選至少5個(gè)克隆進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，并繼續(xù)施加puromycin進(jìn)行維持性篩選培養(yǎng)。擴(kuò)增完畢后western blot或者QPCR檢測目的蛋白的表達(dá)。挑取表達(dá)適中的穩(wěn)定細(xì)胞株，連續(xù)篩選并傳3代后，凍存保重穩(wěn)定細(xì)胞株。5 .感染懸浮細(xì)胞上面介紹的是針對(duì)貼壁細(xì)胞的感染方法，若是懸浮或半懸浮細(xì)胞，則需要通過平

16、角離心轉(zhuǎn)染法，即將適量的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿后，封好口，放入平角離心機(jī)后，低速（500g-1000g/min ）離心1h,然后放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)即可。若由于實(shí)驗(yàn)條件有限，沒有平角離心機(jī)，可用離心管代替，將細(xì)胞吹打吸入離心管中， 進(jìn)行低速離心，去掉大部分上清， 然后加入適量的病毒液，室溫放置15min （不能超過半小時(shí)），然后將細(xì)胞和病毒液同時(shí)吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中繼續(xù)病毒感染過夜后換液即可。6 .對(duì)于極難感染的細(xì)胞24 小對(duì)于極難感染白細(xì)胞，如 DC （樹突狀細(xì)胞）等，可采用多次感染的方法，即感染 時(shí)后，更換新鮮病毒進(jìn)行二次感染，可顯著提升感染效率。附1:漢恒生物慢病毒質(zhì)粒圖譜過表達(dá)1.單標(biāo)記2.

17、雙標(biāo)記IRES載體慢病毒過表達(dá)載體，ZSGreen/puro標(biāo)記-，之NilEg而ZsGreen-T2A-PuroRFP-T2A-PuroLuc-T2A-PuroZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc干擾1.單標(biāo)記2.雙標(biāo)記IRES系列載體慢病毒shRNA干擾載體，ZSGreen/puro標(biāo)記ZsGreen-T2A-PuroRFP-T2A-PuroLuc-T2A-PuroZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc特殊用途用于融合蛋白構(gòu)建慢病毒載體啟動(dòng)子替換A辭曄&- “斑皿M現(xiàn)I 向E抑網(wǎng) SdaZiDZE) 立電由加；句Tet-on system慢病毒載體：單

18、病毒系統(tǒng)，無須另外表達(dá)rtTA,出毒率低，只做建系用,無法提供病毒Tet-on過表達(dá)系統(tǒng)，目的基因 插入MCS區(qū)，只在DOX存在下 才表達(dá)，puro可持續(xù)表達(dá)，用 于篩選Tet-on干擾系統(tǒng)，應(yīng)用 mir30的sh-mir 結(jié)構(gòu)，與 tuboRFP融合表達(dá)，力口 DOX 時(shí)RFP和sh-mir結(jié)構(gòu)啟動(dòng)表達(dá)，因此 會(huì)看到加Dox后24小時(shí)有熒光出現(xiàn)； puro為持續(xù)表達(dá)，用于篩選 注意：sh-mir合成非常貴附 2：慢病毒滴度測定方法簡介:1、細(xì)胞準(zhǔn)備將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1x105ml,加入96孔板，100ul/孔，為每個(gè)病毒準(zhǔn)備6 個(gè)孔。放入37，5%CO2 培養(yǎng)箱中培

19、養(yǎng)。2、加病毒第二天，在EP 管中做 3 倍梯度稀釋，連續(xù)6 個(gè)稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準(zhǔn)備 6 個(gè) 管， 每管加入90ul 培養(yǎng)液， 往第一個(gè)管中加入10ul 病毒原液，混勻后， 吸取 10ul 加入第二個(gè)管混勻。以此類推，做十個(gè)稀釋度(103*10-3)。3、追加培養(yǎng)液第三天，吸去帶有病毒的培養(yǎng)液，在每個(gè)孔中再加入100ul 完全培養(yǎng)液，以利于細(xì)胞的生長。4、觀察結(jié)果并計(jì)算滴度第五天，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。滴度( PFU/ml) =細(xì)胞數(shù)*熒光百分比*MOI* 病毒稀釋倍數(shù)*103附3:漢恒生物目的細(xì)胞慢病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）與體積對(duì)應(yīng)表規(guī)格大約數(shù)目MOI 值加入病毒數(shù)獸 里慢病也

20、MOI摸索時(shí)加入的體積梯度/ul96well2-5X10420-5 0;12; 2048well1-2X10520-5 0X10720-100U120; 60; 10024well2-3X10520-5 0;120; 20012well5X 10520-5 0X107100-250U1100; 300; 5006well1-2X10620-5 0X108200; 600; 100035mmdish1-2X10620-5 0X108200; 600; 100060mmdish2-4X10620-5 0X108400; 1200; 2000100mmdish6-10X 10620-5 0X1081

21、200; 3600; 6000150mmdish1-2X10720-5 0X1092-10ml2000; 6000; 10000慢病毒滴度以108/ml為準(zhǔn)，其他滴度需相應(yīng)換算；大約細(xì)胞數(shù)目是根據(jù)80%100%ffl胞密度估算而出，具體細(xì)胞數(shù)請(qǐng)種細(xì)胞時(shí)進(jìn)行 細(xì)胞計(jì)數(shù)。1) 24板長滿了細(xì)胞大約有3X105個(gè)細(xì)胞。如果一天后要長到70% (X 105),建議一X105個(gè)細(xì)胞。因?yàn)榧?xì)胞剛放進(jìn)去的前幾個(gè)小時(shí)需要粘在生長表面及適應(yīng)新的生長條件，不 會(huì)達(dá)到24小時(shí)翻一倍的速度。其他規(guī)格培養(yǎng)可參照此確定相應(yīng)culture細(xì)胞量。2) MOI值：MOI是multiplicity of infection的縮

22、寫，中文譯為感染復(fù)數(shù) ，實(shí)際的含義即為每 個(gè)細(xì)胞被多少個(gè)有活力病毒所感染。各種細(xì)胞的最適MOI值有差別，請(qǐng)客戶正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最適MOI。附4:慢病毒MOI感染參數(shù)注：不同實(shí)驗(yàn)室由于細(xì)胞的來源、代數(shù)和細(xì)胞狀態(tài)等因素的影響，MOI值也略有差異,以下數(shù)據(jù)是在細(xì)胞感染效率在85-100%細(xì)胞狀態(tài)良好的情況下獲得的，僅供參考。細(xì)胞系名稱細(xì)胞描述MOI值范圍能否添加polybreneK562人白血病細(xì)胞20 40可Jurkat人白血病細(xì)胞株50 80/、可kasumi人白血病細(xì)胞株10 30/、可NB4人白血病細(xì)胞株50 80/、可U937人單核細(xì)胞20 40可THP-1人單核細(xì)胞株50 80

23、可GBC-SD人膽囊癌細(xì)胞株30 50/、可H929人多發(fā)性骨髓瘤 癥細(xì)胞系100150/、可H1299人非小細(xì)胞性肺 癌細(xì)胞13可95D人肺巨細(xì)胞癌24可A549人肺腺癌20 40可SPC-A-1人肺腺癌細(xì)胞100150可7402人肝癌細(xì)胞10 15可Hep 3B人肝癌細(xì)胞10 30可Hep G2人肝癌細(xì)胞10 30可SMMC-7721人肝癌細(xì)胞10 30可Huh-7人肝癌細(xì)胞系10 30可Hela人宮頸癌細(xì)胞株10 30可HOS人骨肉瘤細(xì)胞系20 40可Hep-2人喉癌細(xì)胞株10 30可HL-60人急性髓系白血 病細(xì)胞株>100可HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞10 30可PKO人結(jié)腸癌細(xì)胞2

24、4可SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞株10 30可DLD-1人結(jié)直腸腫瘤細(xì) 胞株10 30可SK-OV-3人卵巢癌細(xì)胞株24可SHG-44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞10 30可U251人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤1八-3可U87人腦星型膠質(zhì)母 細(xì)胞瘤1八-3可293T人胚腎上皮細(xì)胞1八-3可HUVEC-2C人臍靜脈血管內(nèi) 皮細(xì)胞10 30可PC-3人前列腺癌細(xì)胞20-40可MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞10 30可MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株20-40/、可Tca8113人舌鱗狀細(xì)胞癌10 30可RPE人視網(wǎng)膜色素上 皮細(xì)胞10 30可AGS人胃癌細(xì)胞100-150可BGC-823人胃癌細(xì)胞100-150可SGC-7901人胃癌

25、細(xì)胞10 30可MKN-28人胃癌細(xì)胞株20 40可MKN-45人胃低分化腺癌 細(xì)胞株20 40可BxPc-3人胰腺癌細(xì)胞20 40可CFPAC-1人胰腺癌細(xì)胞50 80可Panc-1人胰腺癌細(xì)胞24可HEC-1-B人子宮內(nèi)膜癌細(xì) 胞株24可NIH-3T3小鼠成纖維細(xì)胞 系20 40可小鼠單核巨噬細(xì) 胞白血病細(xì)胞1030（感染后分 化）/、可CHO中國倉鼠卵巢細(xì) 胞20 40可HSC-T6大鼠肝星型細(xì)胞10 30/、可C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì) 胞>100可NRK大鼠腎細(xì)胞1030可附6:漢恒生物病毒包裝周期表腺病是慢病母逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方式直接加入直接加入直接加入換液時(shí)間感染后2h感染后24h感

26、染后24h是否需要篩選不需要，腺病毒感 染能力很強(qiáng)需要篩選獲得 穩(wěn)TE感染株，慢病母 的感染能力不強(qiáng)需要篩選獲得 穩(wěn)定感染株，逆轉(zhuǎn)錄 病毒的感染能力不 強(qiáng)觀察時(shí)間如帶有GFP等熒 光標(biāo)簽，24h后可觀察 到熒光，36h可達(dá)到表 達(dá)高峰，若不帶后熒光 標(biāo)簽，則需要鑒定帶有GFP等熒 光標(biāo)簽）24h后可以 觀察到表達(dá)，36h達(dá) 到高峰，若不帶后熒 光標(biāo)簽，則不可直接 觀察到，需要鑒定帶有GFP等熒 光標(biāo)簽）24h后可以 觀察到表達(dá)，36h達(dá) 到高峰，若不帶后熒 光標(biāo)簽，則不可直接 觀察到，需要鑒定是否需要助轉(zhuǎn)劑不需要有時(shí)需要，但是 根據(jù)具體情況操作， 因?yàn)橹D(zhuǎn)劑，如 polybrene ,對(duì)細(xì)胞的 傷害比較大，有的細(xì) 胞可能承受/、了有時(shí)需要，但是 根據(jù)具體情況操作， 因?yàn)橹D(zhuǎn)劑，如 polybrene ,對(duì)細(xì)胞的 傷害比較大，有的細(xì) 胞可能承受/、了腺病是慢病母過表達(dá)干擾過表達(dá)感染目的序 列獲得35天24天目的序 列獲得35天24天穿梭質(zhì) 粒構(gòu)建312天312天重組表 達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建812天812天質(zhì)粒重 組510天510天慢病毒 包裝510天510天腺病毒 包裝12 15天12 15天病毒濃 縮（可選）12天12天大量擴(kuò) 增12 15天12 15天滴度測 定35天35天純化（可 選）14 21天14 2