免疫組化技術常見問題及其解答集錦

1、免疫組化技術常見問題及其解答集錦1石蠟切片和冰凍切片的比較？（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一老師請教得出的結論。因為作石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。（2）冰凍切片的優(yōu)點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復這一步。缺點是細胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細胞結構，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當你買一抗時，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。（3）石蠟切片的優(yōu)點可以保持組織細胞的形態(tài)結

2、構，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。2、一抗的選擇要點和技巧是什么？（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合，就像導彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親

3、和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高， 但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。（2） 應用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫 沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。（3）種屬反應性的選擇（species reactivity ）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差 異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內(nèi)的抗原。（4 ）種屬來源，一般兔來源的多是多克??；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù) 此來源來選擇相應的二抗。（5）生產(chǎn)廠家的選擇。如 santa Cruz公司抗體一般1ml，

4、價格2100元左右；而 BIOAY公司 一抗一般100ul，價格1600元左右。這兩個廠家的同一種抗體它的實際效價穩(wěn)定是不同的， 我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做Western blotting效果還可以。3、在什么情況下使用 Triton-X100（1） Triton X-100化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學（10um厚切片） 和免疫細胞化學中一般用Triton X-100作為細胞通透劑，在膜上打孔。（2） 其作用原理：Trit on X-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體 及大分子結構的物質(zhì)進入胞漿和胞核內(nèi)，故在細胞免疫組化時尤

5、為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內(nèi)與相應抗原結合。（3）Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。4、封閉血清的選擇原則是什么？（1 ）膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結果的假陽性?。?）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉 反應的位點發(fā)生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結合，會造成背景。（3） 也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。5、抗體孵育條件的比較？（1 ）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從

6、冰箱拿出后 37度復溫45min。（2 ）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。6、一抗4度孵育后為什么要進行37度復溫？（1）一方面，防止切片從 4度直接放入PBS易脫片；（2） 另一方面，使抗原抗體結合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4度和37度時分子運動方式不同， 前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。（3） 其實，我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過夜拿出后，直接用 PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。事實勝于雄辯！7、DAB顯色時間如何把握？（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色

7、時間，到出現(xiàn)淺棕色本底時即可 沖洗；（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體 濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；（3）此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要 延長封閉時間；（4）DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃 度過低或孵育時間過短（最好一抗 4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。8免疫組化結果如何分析？（1）陽性著色細胞計數(shù)法。在 40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數(shù)陽 性著色細胞，每組36張不同動物組織切片，然后進行

8、組間比較即可。（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 image j進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)計分析即可。（3） 評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（03分為陰性著色、淡黃色、 淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（14分為025%、2650%、5175%、76100%），最 終可以分數(shù)相加，再進行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均 勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。9、在什么情況下進行組織抗原修復，抗原修復的條件是什么？(1 )由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及

9、醛基的封 閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復，使得細胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測 率。(2) 修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種(具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等)。(3) 微波修復，我們一般用 6min*4次，效果不錯。10、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么？(1) 一般3%過氧化氫滅活時間短點，可以 10min左右；而0。3%過氧化氫則可以適當延長 圭寸閉時間，一般1030min。(2) 用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵 育時間過長易引起脫片。(3 )現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4

10、度避光保存。11、如何才能充分脫蠟？(1) 蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起染色不均勻、陽性物時隱時現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟， 目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短；(2 )脫蠟的時間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高， 脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20分鐘或更長。(3) 當天切的切片，燒烤2小時后進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色

11、前，還必須對切片進行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。總之，操作時應根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是 要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。12、如何最大限度地降低組織非特異性染色？(1 )縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。(2) 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。(3) 內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高 (含血細胞多的組織)，需要 通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；(4) 非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當

12、增加濃度來加強封閉效果；(5) 縮短DAB孵育時間或降低 DAB濃度/過氧化氫濃度等；(6) 適當增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；(7 )防止標本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。13、蘇木素復染時間的把握?（1）蘇木素復染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。不過這個如果染色不理想可以補救的。即：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺 則再置于蘇木素中染色即可。（2 ）鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒 精中數(shù)秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。（3）如

13、果分化的顏色過淺，可以復置于蘇木素中染色。14、PBS的清洗方式選擇、次數(shù)和時間的選擇？（1 ）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內(nèi)洗，這樣就會造成交叉污染，影響最后的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗， 沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。（2 ）溫柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切片，取出切片，將 PBS從上輕輕地沖洗，讓 PBS自上而下流下來，不要拿起切片將 PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導致切片的脫落。（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗

14、去結合的物質(zhì)。沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實踐認為，用一小燒杯柔和地于切片 上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質(zhì)，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS,持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子 強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。（5）常用試劑的配制和使用。在免疫組織化學的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，D

15、AB的配制都離不開緩沖液?？梢娋彌_液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結果。15、脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片？（1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么 樣子了。后面補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者 手法不好等。（3）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。（4）沒烤好，時間短溫度不夠之類。（5 ）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢 慢吸水。（6） 修復的問題：抗

16、原修復的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修復液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。（7） 此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的， 不要沖。 基本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。16、背景染色較深的原因有哪些？（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化， 找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書進行染色。

17、（2 ）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報時 表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結果進行調(diào)整。（3） DAB變質(zhì)和顯色時間太長： DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制 好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下， 過氧化氫也會游離出氧原子與DAB 產(chǎn)生反應而降低 DAB的效力，未用完的 DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達到理想的染色程度時立即終止反應。 不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監(jiān)控，避免顯色時間過長。（4）組織變干：修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。（5） 切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前