模塊二光合色素的提取、分離、

1、L/O/G/O2022-1-11 光合色素的提取、理化性質(zhì)光合色素的提取、理化性質(zhì) 分離、吸收光譜及含量的測定分離、吸收光譜及含量的測定模塊二模塊二 模模 塊塊 實實 驗驗2022-1-11實實 驗驗 背背 景景2022-1-11Caution!I 光合色素的提取與理化性質(zhì)光合色素的提取與理化性質(zhì)2022-1-11I 光合色素的提取與理化性質(zhì)光合色素的提取與理化性質(zhì)2022-1-11 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?掌握光合色素的提取方法以及了解有關(guān)的理化性質(zhì)。掌握光合色素的提取方法以及了解有關(guān)的理化性質(zhì)。 實驗原理實驗原理 光合色素能溶于具有一定極性的有機溶劑，如丙酮、乙醇等。光合色素能溶于具有一定極性的

2、有機溶劑，如丙酮、乙醇等。 提取液中無任何電子受體，因此可以觀察熒光現(xiàn)象。提取液中無任何電子受體，因此可以觀察熒光現(xiàn)象。 離體葉綠素在有氧氣和光照條件下，發(fā)生光氧化作用，結(jié)構(gòu)離體葉綠素在有氧氣和光照條件下，發(fā)生光氧化作用，結(jié)構(gòu)遭到破壞，形成加氧葉綠素等產(chǎn)物。遭到破壞，形成加氧葉綠素等產(chǎn)物。 葉綠素是一種雙羧酸酯，可以發(fā)生皂化反應(yīng)。葉綠素是一種雙羧酸酯，可以發(fā)生皂化反應(yīng)。 葉綠素分子中葉綠素分子中Mg2+與仆啉環(huán)結(jié)合不穩(wěn)定，可以被與仆啉環(huán)結(jié)合不穩(wěn)定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等離子所取代。等離子所取代。I 光合色素的提取與理化性質(zhì)光合色素的提取與理化性質(zhì)2022-1-11 實驗儀器及藥品實驗

3、儀器及藥品 材料：小桐子葉片材料：小桐子葉片 方法及步驟方法及步驟 光合色素的提取光合色素的提?。簩⒅参锶~片洗凈并用濾紙洗干，：將植物葉片洗凈并用濾紙洗干，取取1/2片葉片，放入研缽中并加入少許片葉片，放入研缽中并加入少許CaCO3和石和石英砂及英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。I 光合色素的提取與理化性質(zhì)光合色素的提取與理化性質(zhì)2022-1-11 觀察觀察熒光現(xiàn)象熒光現(xiàn)象：與光線：與光線垂直的方向觀察色素顏垂直的方向觀察色素顏色。色。 光破壞作用光破壞作用：1

4、ml色素色素提取液于室內(nèi)，提取液于室內(nèi)，1ml于于太陽光下，太陽光下，30min后觀后觀察顏色變化。察顏色變化。I 光合色素的提取與理化性質(zhì)光合色素的提取與理化性質(zhì)2022-1-11皂化反應(yīng)皂化反應(yīng)：取一支試管，加入色素提取液：取一支試管，加入色素提取液2.5ml，再加入，再加入30%KOH甲醇溶液甲醇溶液1ml，搖，搖勻，再加入苯勻，再加入苯2.5ml，輕輕搖動，沿試管，輕輕搖動，沿試管壁慢慢加入自來水壁慢慢加入自來水1ml，輕輕搖動后觀察，輕輕搖動后觀察，注意觀察整個過程顏色的變化。注意觀察整個過程顏色的變化。取代反應(yīng)：取代反應(yīng)：取一支試管，加入取一支試管，加入3ml色素，色素，逐滴加入逐

5、滴加入50%醋酸直至溶液變?yōu)辄S褐色。醋酸直至溶液變?yōu)辄S褐色。倒出一半，加入少許醋酸銅粉末，酒精燈倒出一半，加入少許醋酸銅粉末，酒精燈上加熱，與另一半比較顏色的差異。上加熱，與另一半比較顏色的差異。I 光合色素的提取與理化性質(zhì)光合色素的提取與理化性質(zhì)2022-1-11 吸收光譜的變化：吸收光譜的變化：皂化和取代反應(yīng)后的色素進行吸收光譜皂化和取代反應(yīng)后的色素進行吸收光譜分析（見分析（見II）。）。 結(jié)果與討論結(jié)果與討論 1、認真記錄觀察到的結(jié)果（、認真記錄觀察到的結(jié)果（顏色變化？分幾層？為什顏色變化？分幾層？為什么？么？），并加以討論。），并加以討論。 思考題思考題 1、為什么在皂化反應(yīng)中只能用、

6、為什么在皂化反應(yīng)中只能用20%KOH甲醇溶液，而不甲醇溶液，而不能用能用20%KOH水溶液？水溶液？I 光合色素的提取與理化性質(zhì)光合色素的提取與理化性質(zhì)2022-1-11 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?掌握光合色素的分離方法以及了解有關(guān)的吸收光譜。掌握光合色素的分離方法以及了解有關(guān)的吸收光譜。 實驗原理實驗原理 光合色素能溶于具有一定極性的有機溶劑，如丙酮、乙醇光合色素能溶于具有一定極性的有機溶劑，如丙酮、乙醇等。等。 不同光合色素的不同光合色素的分子量、分子結(jié)構(gòu)、極性、溶解度分子量、分子結(jié)構(gòu)、極性、溶解度、支持、支持物對它們的物對它們的吸附力吸附力等不同，因而分配系數(shù)不同，故彼此可等不同，因而分配系數(shù)不

7、同，故彼此可以分開。以分開。 葉綠素的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)對光有很強的吸收，主要是葉綠素的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)對光有很強的吸收，主要是紅光和藍紅光和藍紫光紫光。II 光合色素的分離與吸收光譜光合色素的分離與吸收光譜2022-1-11 實驗儀器及藥品實驗儀器及藥品 材料：菠菜葉片材料：菠菜葉片 方法及步驟方法及步驟 光合色素的提取光合色素的提取：將植物葉片洗凈并用濾紙洗干，：將植物葉片洗凈并用濾紙洗干，取取1/3片葉片，放入研缽中并加入片葉片，放入研缽中并加入少許少許CaCO3和石和石英砂及英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。研

8、磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。II 光合色素的分離與吸收光譜光合色素的分離與吸收光譜2022-1-11 光合色素分離：光合色素分離： 剪取適當長度和寬度的濾紙條剪取適當長度和寬度的濾紙條 用上行紙層析法分離色素用上行紙層析法分離色素 啟動啟動劑：石油醚：丙酮：苯劑：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。啟動劑啟動劑II 光合色素的分離與吸收光譜光合色素的分離與吸收光譜距離距離2022-1-11 吸收光譜的測定：吸收光譜的測定： 光合色素的吸收光譜光合色素的吸收光譜：取色素溶液：取色素溶液1 mL，加入丙，加入丙酮酮3 mL，搖勻后在分光光度計上，搖勻后在分光光度計上400到到700 nm

9、處處每隔每隔10 nm進行掃描。進行掃描。 各色素的吸收光譜各色素的吸收光譜：上述層析出的：上述層析出的34種色素，種色素，分別剪下后溶于分別剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法掃描。丙酮中，按上述方法掃描。II 光合色素的分離與吸收光譜光合色素的分離與吸收光譜2022-1-11 結(jié)果與討論結(jié)果與討論 1、畫出你的層析結(jié)果，并加以分析。、畫出你的層析結(jié)果，并加以分析。 2、總光合色素和各光合色素的吸收光譜有何不同，為什、總光合色素和各光合色素的吸收光譜有何不同，為什么？么？ 思考題思考題 1、光合色素的吸收光譜對我們理解光合作用有何意義？、光合色素的吸收光譜對我們理解光合作用有何意義？2、試論

10、述高等植物光合色素的種類和生理功能、試論述高等植物光合色素的種類和生理功能II 光合色素的分離與吸收光譜光合色素的分離與吸收光譜2022-1-11III 光合色素含量的測定光合色素含量的測定2022-1-11K652 = 34.5III 光合色素含量的測定光合色素含量的測定2022-1-11 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?掌握用分光光度計測定葉綠素含量的方法。掌握用分光光度計測定葉綠素含量的方法。 實驗原理實驗原理 混合液中的兩個或多各組分，只要它們的光譜吸收峰不互相混合液中的兩個或多各組分，只要它們的光譜吸收峰不互相重疊，仍然可以根據(jù)重疊，仍然可以根據(jù)Lambert-Beer定律（定律（A = k L

11、C）求出各）求出各組分含量。組分含量。Lambert定律：定律：A = k L；Beer定律定律A = k C。葉。葉綠素綠素a、b在在80%丙酮溶液中的丙酮溶液中的Amax分別為分別為663nm、645nm，由此得出：見推導(dǎo)過程由此得出：見推導(dǎo)過程 Ca = 12.7 A663 2.69 A645；Cb = 22.9 A645 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A645 實驗儀器及藥品實驗儀器及藥品 實驗材料：植物葉片實驗材料：植物葉片III 光合色素含量的測定光合色素含量的測定2022-1-11 A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1 A645 =

12、 Cb.kb2 + Ca.ka2 分光光度計測出，故求二元一次方程組可得到此公式。分光光度計測出，故求二元一次方程組可得到此公式。 k比吸收系數(shù)。即溶劑和波長不變的情況下，當物質(zhì)的比吸收系數(shù)。即溶劑和波長不變的情況下，當物質(zhì)的濃度濃度(C)為為1g/L(0.1%)，比色皿的直徑，比色皿的直徑(光徑，光徑，L)為為1cm時所時所測出的吸光度即為比吸收系數(shù)。故其單位為：測出的吸光度即為比吸收系數(shù)。故其單位為： 摩爾吸收系數(shù)。摩爾吸收系數(shù)。即溶劑和波長不變的情況下，當物質(zhì)即溶劑和波長不變的情況下，當物質(zhì)的濃度的濃度(C)為為1mol/L，比色皿的直徑，比色皿的直徑(光徑，光徑，L)為為1cm時所測時

13、所測出的吸光度即為摩爾吸收系數(shù)。故其單位為：出的吸光度即為摩爾吸收系數(shù)。故其單位為：cmgL.由于由于k是一個常數(shù)，而是一個常數(shù)，而A可以通過可以通過cmmolL.III 光合色素含量的測定光合色素含量的測定2022-1-11方法及步驟方法及步驟方法一：快速測定法方法一：快速測定法 由于葉綠素由于葉綠素a、b在在652nm處有共同吸收，處有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可直接。可直接用便攜式葉綠素測定儀測定植物葉片的葉綠素含量，最后濃度單位為用便攜式葉綠素測定儀測定植物葉片的葉綠素含量，最后濃度單位為mg/dm2方法二方法二: 分光光度計法分光光度計法色素提?。簩⑸鲜鲋参?/p>

14、葉片洗凈并用濾紙吸干，準確稱取已知色素提?。簩⑸鲜鲋参锶~片洗凈并用濾紙吸干，準確稱取已知的葉的葉圓片圓片0.05g左右，加入少許左右，加入少許CaCO3和石英砂及和石英砂及80%丙酮丙酮2ml，充分研磨，充分研磨，轉(zhuǎn)入離心管中（離心機使用），再用轉(zhuǎn)入離心管中（離心機使用），再用5ml 80%丙酮洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管丙酮洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管中，平衡，中，平衡，5000rpm離心離心10min, 記錄上清液體積，取記錄上清液體積，取1ml稀釋到稀釋到4ml。測定：以測定：以1cm比色皿分別測定比色皿分別測定A663、A645。使。使A控制在控制在0.1 0.8之間。之間。III 光合色素含量的測定光合

15、色素含量的測定2022-1-11結(jié)果與討論結(jié)果與討論 1、根據(jù)原理中計算出三類色素的濃度（、根據(jù)原理中計算出三類色素的濃度（mg / L）。）。2、根據(jù)公式、根據(jù)公式 分別計算出各種分別計算出各種植物葉片色素含量。植物葉片色素含量。思考題思考題 1、一般正常的植物葉片，、一般正常的植物葉片，Chla / Chlb = 3 / 1，你所測定的結(jié)果符合此比，你所測定的結(jié)果符合此比例嗎？為什么？例嗎？為什么？ 2、兩種測定方法含量有何不同？為什么？、兩種測定方法含量有何不同？為什么？ 3、怎樣把方法一中的葉綠素含量、怎樣把方法一中的葉綠素含量mg/dm2轉(zhuǎn)換為方法二中的轉(zhuǎn)換為方法二中的mg / g

16、FW ？怎樣測定不同形態(tài)的植物葉片的葉面積？怎樣測定不同形態(tài)的植物葉片的葉面積？WVC Chl content = (mg.g-1FW)III 光合色素含量的測定光合色素含量的測定2022-1-11附附1.葉面積的計算葉面積的計算 選取單位面積重量是一個常數(shù)的打印紙如選取單位面積重量是一個常數(shù)的打印紙如A4或或16K。一。一般般A4打印紙為打印紙為70105GSM（g/m2）。）。 用鉛筆輕輕地沿著葉緣在用鉛筆輕輕地沿著葉緣在A4紙上劃線。紙上劃線。 用剪刀沿著葉緣剪下用剪刀沿著葉緣剪下A4紙。紙。 稱所剪下的稱所剪下的A4紙的重量紙的重量W (g)。 計算：計算：附附2.高速冷凍離心機的使用方法高速冷凍離心機的使用方法)2/()(mgGSMgW 葉葉面面積積III 光合色素含量的測定光合色素含量的測定2022-1-11溫度調(diào)節(jié)溫度調(diào)節(jié)1、插上電源插座、插上電源插座2、按、按T接通電源接通電源3、按功能鍵調(diào)節(jié)溫度上限、按功能鍵調(diào)節(jié)溫度上限4、按功能鍵調(diào)節(jié)溫度下限、按功能鍵調(diào)節(jié)溫度下限5、按功能鍵顯示目前溫度、按功能鍵顯示目前溫度III 光合色素含量的測定光合色素含量的測定