枯草芽孢桿菌冷凍干燥保護劑的初步研究

1、枯草芽孢桿菌冷凍干燥保護劑的初步研究摘 要：為提高枯草芽孢桿菌菌粉凍干存活率，對其凍干保護劑進行篩選和優(yōu)化。采用單因素篩選試驗和正交試驗，通過分析菌粉凍干存活率，篩選優(yōu)化出最佳復合保護劑的組成。最終確定枯草芽孢桿菌最佳凍干保護劑的配方為：脫脂乳粉10%、L-抗壞血酸鈉3%、海藻糖2%，菌種凍干存活率高達(90.01±1.31)%。本研究對枯草芽孢桿菌菌種的保藏、應用、活菌產品質量的穩(wěn)定以及新產品的開發(fā)均有一定的理論指導意義。關鍵詞：枯草芽孢桿菌；凍干保護劑；正交設計；凍干菌粉Preliminary Research on the cryoprotectant of Bacillus

2、subtilis PowderAbstract：Study on the technology of selection and optimization of Bacillus subtilis freeze-dried powder, in order to improve the survival rates of Bacillus subtilis. The single factor and orthogonal test were taken, through analysis of the survival bacteria, and then optimized

3、60;the best form of composite protective agent. The final determination of the effective lyophilized formulation protection agent: 10% skim milk powder, 3% L-sodium ascorbate, 2% trehalose, the results showed the survival rates was up to (90.01 ± 1.31)%. The protection agent

4、 of Bacillus subtilis was optimized that provided a certain theoretical significance for preservation and application of Bacillus subtilis, stable quality of products and the development of new productsKeywords: Bacillus subtilis cryoprotectant orthogonal design freeze-dried powder0 引言枯草芽孢桿菌(Ba

5、cillus subtilis)是一種嗜溫性好氧產芽孢的革蘭式陽性桿菌。該菌其生理特征豐富多樣，分布廣泛，易分離培養(yǎng)，對環(huán)境無污染，對人畜無毒害，且能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性1。該菌所產的芽孢對高溫和某些化學物質具有較強的抗逆性，為劑型加工及其在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖奠定了理論基礎。 枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) 具有多種功能，是一種可應用于多個領域的優(yōu)良菌種，例如可作為微生物農藥、微生物飼料添加劑、生物有機肥接種劑、凈水劑等2-3。近年來，隨著微生態(tài)學研究地不斷深入，枯草芽孢桿菌作為一種有益菌得到了廣泛的研究和開發(fā)。然而，由于長期保存較困難，且變異機率較

6、大，故枯草芽孢桿菌的保藏成了研究的熱門課題。利用真空冷凍干燥保存菌種是多種菌種保藏方法中較為理想的一種，然而真空冷凍干燥過程中由于環(huán)境、溫度和壓力的急劇變化，導致部分菌體細胞某些酶鈍化、失活、細胞受到損傷甚至死亡4-5。因此，真空冷凍干燥過程中應選擇合適的保護劑來降低靶標菌在凍干過程中的死亡率。不同的保護劑對不同菌種的保護效果也不盡相同，一般來講，單一保護劑的保護效果不及復配保護劑6。只有選擇合適有效的復配保護劑，使其盡可能保護靶標菌的生物活性和生理生化特征，從而減輕冷凍和真空過程中對靶標菌的損傷7。本研究以前期從某商品化的枯草芽孢桿菌菌粉中分離純化的一株枯草芽孢桿菌為研究對象，采用單因素試驗

7、及正交試驗對抗凍保護劑的組成及濃度進行了優(yōu)化，以期最大限度地發(fā)揮保護劑的保護功能，減少菌體在真空冷凍干燥過程中的死亡率，為枯草芽孢桿菌高效凍干粉的研制提供依據。1材料與方法1.1 材料1.1.1 供試菌種 枯草芽孢桿菌（肥料級），由三門峽龍飛生物工程有限公司、河南省農業(yè)微生物工程技術研究中心提供。1.1.2 培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏10g，蛋白胨8g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，水1000mL，高壓蒸汽滅菌30min。 計數培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂。1.1.3 保護劑溶液的配制 固體按照質量與體積比、液體按照體積與體積比配制所需濃度的保護劑溶液。1.2 主要試劑和儀器1.2.1 主要試劑 脫

8、脂乳粉為食品級，市場購買；牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、營養(yǎng)瓊脂粉、海藻糖、甘油、吐溫80、蔗糖、L-抗壞血酸鈉等，以上試劑均為分析純試劑。1.2.2 主要儀器 超低溫冰箱、真空冷凍干燥機、恒溫培養(yǎng)箱、溫控搖床、離心機、安瓿熔封機、高頻電火花等。1.3 方法1.3.1 工藝流程加入保護劑 凍干前活菌計數菌種活化 擴大培養(yǎng) 離心收集菌體 菌體懸浮液的制備 預凍真空冷凍干燥 凍干粉 真空熔封 真空度檢測 活菌計數 1.3.2 凍干保護劑單因素試驗 取兩環(huán)活化的枯草芽孢桿菌，接種于200mLl牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37、180r/min培養(yǎng)24h。將上述發(fā)酵液6000rpm離心10min，收集

9、菌體，用適量無菌生理鹽水懸浮，4保存?zhèn)溆?。參照有關文獻8-11及實驗室前期的研究工作，選取脫脂乳粉、海藻糖、甘油、吐溫80、蔗糖、L-抗壞血酸鈉6種材料作為單因素試驗的篩選對象。供試保護劑的種類及濃度見表1。將保護劑母液配制成所需濃度的兩倍，脫脂乳粉115滅菌15min，其它5種保護劑溶液121滅菌20min，備用。然后將6種保護劑分別與菌懸液等體積混合，制成濃菌液，每支安瓿管分裝2.0mL。預凍前先放入4冰箱中平衡40min，使菌體與保護劑充分混勻。然后置于-20冰箱中冷凍預冷2h，隨后轉入-50冰箱中冷凍過夜。將冷凍后的樣品安瓿管插于真空冷凍干燥機的橡膠閥下接口進行凍干，至菌粉的含水量降至

10、3%-5%即可收獲成品，真空封口并進行真空度檢驗，合格樣品放入-50冰箱，保存?zhèn)溆谩１? 供試保護劑的種類及濃度Table1 The kinds and concentration of protective agents保護劑保護劑濃度（%）空白加等體積的無菌水海藻糖246810脫脂乳68101214甘油12345吐溫8012345蔗糖246810L-抗壞血酸123451.3.3 正交試驗優(yōu)化抗凍保護劑 由于當正交試驗做方差分析時，必須估計隨機誤差，故正交表的表頭中必須余留空白列，以確定隨機誤差引起的離差平方和。根據單因素試驗結果，本研究建立4 因素3水平（包括一列空白列）的L9（34）正交

11、試驗，確定3種在單因素試驗中有較好保護效果的保護劑的復配效果。正交試驗影響因素水平選擇見表2。表2正交試驗因素水平表Table 2 Factor level of orthogonal test水平因素脫脂乳 A(%)海藻糖 B(%)L-抗壞血酸鈉C(%)空白 D(%)1102121242314631.3.4活菌計數及凍干存活率的計算凍干前后均采用通用檢測方法NY/T 1461-2007進行活菌計數，菌體凍干存活率的計算公式如下：存活率 = 凍干后樣品用生理鹽水恢復至原體積測得的活菌數凍干前測得的活菌數×100%2結果與分析2.1 單因素試驗結果本研究將脫脂乳粉、海藻糖、甘油、吐溫8

12、0、蔗糖、L-抗壞血酸鈉6種不同濃度的保護劑分別進行單因素試驗，各因素均以不加保護劑的處理為對照組。通過分析各處理組樣品凍干存活率，來判斷其對菌體的保護作用，結果見圖1。如圖1所示，其中10%的脫脂乳粉對枯草芽孢桿菌的保護效果最好，菌種凍干存活率高達（84.45±1.29）%；而所對應的不加保護劑的對照組，菌種凍干存活率僅為（7.85±1.00）%。這可能是由于脫脂乳中的乳清蛋白在菌體表面形成蛋白膜對細胞加以保護，同時固定酶類，防止因細胞壁蛋白質損壞而引起的胞內物質泄漏，并為凍干的樣品提供了一種輕而多空的疏松結構，大大增強了菌粉的復水性，提高了菌粉的凍干存活率12-13。其

13、它保護劑中，L-抗壞血酸鈉和海藻糖的保護效果較好，這是因為L-抗壞血酸鈉是一種水溶性極強的抗氧化劑，能使枯草芽孢桿菌在凍干過程中免遭氧氣的影響，保持細胞活性并提高穩(wěn)定性14-15。另外，海藻糖具有多個羥基可以與菌體細胞表面自由基聯結起來，避免菌體暴露在介質中，還可與蛋白質形成氫鍵以取代水，從而保證蛋白質的穩(wěn)定性16。目前關于海藻糖保護機制主要有兩種假說：一種稱為“水替代”假說；另一種稱為“玻璃態(tài)”假說17-18。然而，這兩種假說均還不能完全解釋現有的試驗現象。因此，海藻糖保護生物活性物質的機理，仍需深入研究。圖1 不同保護劑對枯草芽孢桿菌凍干存活率的影響Fig.1 The effect of

14、different cryoprotectant on the survival rates of Bacillus subtilis由圖1可以看出，在一定濃度范圍內，隨著保護劑濃度的增加，菌粉凍干存活率也隨之增加；然而當達到一定臨界值時，若保護劑濃度繼續(xù)增加，菌粉凍干存活率反而呈現下降趨勢。故保護劑的濃度存在一個最佳濃度，過高或者過低均不能達到最佳效果。其中10%14%脫脂乳粉對菌種的保護效果最為顯著；此外1%3%的L-抗壞血酸鈉及2%6%的海藻糖對菌種的保護效果也較好；而選用甘油、吐溫80和蔗糖作為保護劑時，菌種的凍干存活率較低。因此，正交試驗時選用脫脂乳粉、L-抗壞血酸鈉和海藻糖來配制抗

15、凍效果顯著的復合保護劑。2.2 正交試驗優(yōu)化凍干保護劑的最佳復配比例根據正交試驗結果分析表明，單一保護劑的抗凍保護效果存在局限性，而復配保護劑體系中每種保護劑成分在冷凍干燥過程中都發(fā)揮各自的作用，同時相互間又具有協(xié)同作用19，其配比與存活率的關系見表3。其中由極差分析可知，影響菌種凍干存活率的主次因素由大到小依次為：A（脫脂乳粉）C（L-抗壞血酸鈉）B（海藻糖）；由此說明上述3種保護劑中，脫脂乳粉對菌種凍干存活率的影響最為顯著，其次是L-抗壞血酸鈉及海藻糖；故復配保護劑的最優(yōu)組合為：A1B1C3，即脫脂乳粉10%，L-抗壞血酸鈉3%，海藻糖2%。通過補充試驗計算出此時菌種凍干存活率高達（90.

16、01±1.31）%，高于各單因素的菌粉凍干存活率，優(yōu)化效果顯著。表3 正交試驗及結果分析表Table 3 Result analysis of orthogonal test因素因素ABCD存活率（%）1111180.552122275.243133387.214212369.435223177.896231271.237313261.478321352.939332146.32K1243.00211.45204.71204.76K2218.55206.06190.99207.94K3160.72204.76226.57209.57R27.42672.230011.86001.603

17、3因素主次ACB最優(yōu)方案A1B1C3 (90.01±1.31)%由方差分析結果可知，見表4，A因素的F值大于臨界值（F0.01（2,2）=99.0）即P值0.01，說明脫脂乳粉對菌粉凍干存活率影響極顯著；B因素的F值小于臨界值（F0.1（2,2）=9.0）即P值0.1，說明海藻糖對菌粉凍干存活率沒有顯著影響；C因素的F值大于臨界值（F0.05（2,2）=19.0）即P值0.05，說明L-抗壞血酸鈉對菌粉凍干存活率影響顯著。故A因素為主要因素，B因素和C因素為次要因素，與極差分析結果一致。表4 正交試驗方差分析表Table 4 The result of variance analys

18、is for orthogonal test方差來源離差平方和自由度均方F值p值顯著性A1190.232595.12298.340.01*B8.3924.192.100.1C214.672107.3453.810.05D （誤差項）3.9921.99總和1417.288F0.1（2,2）=9.0，F0.05（2,2）=19.0 F0.01（2,2）=99.03 結論本研究通過單因素試驗和正交試驗，確定了3種在單因素試驗中有較好保護效果的保護劑的復合配方，最終優(yōu)化得到的最佳復配比例為：10%的脫脂乳粉，、3%的L-抗壞血酸鈉、2%的海藻糖，此時菌種凍干存活率高達（90.01±1.31）

19、%。此外，本研究在此基礎上多次進行了該復合保護劑應用效果試驗，結果表明該復合保護劑對枯草芽孢桿菌的保護效果穩(wěn)定。這對枯草芽孢桿菌菌種的保藏、應用、活菌產品質量的穩(wěn)定性以及新產品的開發(fā)均有一定的理論指導意義，同時也為枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的工業(yè)化生產奠定了基礎。參考文獻 1 黃小琴，劉勇，周西全枯草芽孢桿菌Bs2004固體發(fā)酵與干燥工藝研究J現代農業(yè)科技，2011(1)：186190 2 李煥友，甄輯銘，田萍等.微生態(tài)制劑在斷奶仔豬飼料中應用效果研究J飼料工業(yè)，2001，22(3)：1012 3 劉波，劉文斌芽孢桿菌對水產養(yǎng)殖環(huán)境的凈化作用J漁業(yè)現代化，2004(2)：78 4 De Valde

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