總大腸菌群的測(cè)定實(shí)驗(yàn)報(bào)告1

1、 陜 西 科 技 大 學(xué)環(huán)境工程微生物綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告課題名稱(chēng)：水樣微生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)定學(xué)院：資源與環(huán)境學(xué)院 班級(jí)： 姓名： 2011年總大腸菌群的測(cè)定實(shí)驗(yàn)報(bào)告摘要:本實(shí)驗(yàn)綜合應(yīng)用了微生物基本原理和基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以生活用水為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定其大腸菌群。在沒(méi)有老師的指導(dǎo)下，獨(dú)立完成培養(yǎng)基的制備及滅菌操作。對(duì)不同類(lèi)型的微生物進(jìn)行分離、純化、觀(guān)察、描述。我們檢測(cè)出來(lái)的細(xì)菌的MPN值為645，結(jié)果不純凈。關(guān)鍵詞 總大腸菌群 測(cè)定 發(fā)酵培養(yǎng) 平板標(biāo)記 細(xì)菌菌落總數(shù)前言在給水凈化工程中，水源水先經(jīng)過(guò)處理后才能供給用戶(hù)。飲用水要求清澈，無(wú)色，無(wú)臭，無(wú)病原菌。因此，自來(lái)水在出廠(chǎng)前要做水質(zhì)的物理化學(xué)分析和細(xì)菌衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)

2、。此試驗(yàn)結(jié)合給水凈化工程中的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，做總大腸菌群的檢驗(yàn)。為了解總大腸菌群的數(shù)量指標(biāo)在環(huán)境領(lǐng)域的重要性及大腸菌群的生化特性，特做此實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：使學(xué)生綜合應(yīng)用微生物學(xué)基本原理和基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，獨(dú)立完成培養(yǎng)基的配置與美軍操作及不同類(lèi)型微生物的分離、純化、觀(guān)察、描述，可初步進(jìn)行鑒定、分類(lèi)（此步不作要求）。可以為污水、垃圾等微生物處理進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、自來(lái)水，河、池、湖水、純凈水中微生物的檢測(cè)：【基本內(nèi)容】學(xué)習(xí)水樣的采取方法，采用平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)；采用多管發(fā)酵法（MPN）測(cè)定水中大腸菌群。說(shuō)明多管發(fā)酵法檢測(cè)水中大腸桿菌的原理和操作過(guò)程。記錄并報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果分

3、析與討論，經(jīng)檢查，水樣是否合乎飲用標(biāo)準(zhǔn)？【基本要求】掌握水中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定方法；掌握多管發(fā)酵法（MPN）測(cè)定水中大腸菌群的方法；了解大腸桿菌數(shù)量與水質(zhì)狀態(tài)的關(guān)系；了解大腸桿菌的數(shù)量在飲用水中的重要作用；掌握污水細(xì)菌總數(shù)測(cè)定方法。一所選的微生物類(lèi)群：總大腸菌群和細(xì)菌菌落總數(shù)二培養(yǎng)及名稱(chēng)和組成：1.乳糖蛋白胨培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g、膽鹽3g、乳糖5g、氯化鈉5g、質(zhì)量濃度16g/L溴甲酚紫乙醇溶液1mL、蒸餾水1000mL、PH為7.27.42. 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制3.伊紅-亞甲藍(lán)培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氫二鉀2g、瓊脂2030g、蒸餾水1

4、000mL、質(zhì)量濃度20g/L的伊紅水溶液20mL、質(zhì)量濃度5g/L亞甲藍(lán)水溶液13mL4.肉湯蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏3g、蛋白胨10g、蒸餾水1000mL、氯化鈉5g，PH：7.07.2三環(huán)境樣品名稱(chēng)：科大湖水環(huán)境樣品來(lái)源：科大湖早晨九點(diǎn)在湖邊處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿(mǎn)后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕?，共取湖?00ML。四培養(yǎng)基配置和滅菌步驟（一）配培養(yǎng)基1.乳糖蛋白胨培養(yǎng)基（供多管發(fā)酵法的復(fù)發(fā)酵用）（1）配方：蛋白胨10g，牛肉膏5g，乳糖5g，氯化鈉5g，質(zhì)量濃度16g/L溴甲酚紫乙醇溶液1mL，蒸

5、餾水1000mL，pH為7.2-7.4。（2）制備：按配方分別稱(chēng)取蛋白胨，牛肉膏，乳糖及氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水，調(diào)整pH為7.2-7.4。加入質(zhì)量濃度16g/L的溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻后分裝于試管內(nèi)。塞好棉塞，包裝后滅菌，115（相對(duì)蒸汽壓力0.072MPa）滅菌20min，取出后置于陰冷處備用。-2.三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基（供多管發(fā)酵法的初發(fā)酵用）按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制，分裝于試管中每管5mL；分裝與大試管中，每管50mL，然后在每管內(nèi)倒放裝滿(mǎn)培養(yǎng)基的小倒管。塞好棉塞、包裝后滅菌，滅菌條件同上。3.伊紅-亞甲藍(lán)培養(yǎng)基（1）配方：蛋白胨10g，乳糖10g，磷

6、酸氫二鉀2g，瓊脂20-30g，蒸餾水1000mL，質(zhì)量濃度20g/L的伊紅水溶液20mL，質(zhì)量濃度5g/L亞甲藍(lán)水溶液13mL（2）制備：先將瓊脂加入900mL蒸餾水中加熱溶解，然后加入伊紅水溶液，亞甲藍(lán)水溶液和蛋白胨，混勻使之溶解，加蒸餾水補(bǔ)足至1000mL，調(diào)整pH為7.2-7.4，趁熱用絨布過(guò)濾，再加乳糖，混勻后定量分裝于錐形瓶?jī)?nèi)，包裝后滅菌。滅菌條件：0.072MPa（115，15-20min）（二）滅菌的步驟1.包裝（1）移液管的包裝：將移液管的尖端，放在4-5cm寬的長(zhǎng)紙條的一端，移液管與紙條約成30夾角，折疊包裝紙包住移液管尖端，用左手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，紙條螺旋式

7、地包在移液管外面，余下的紙折疊打結(jié)。多支包裝，待滅菌。（2）培養(yǎng)皿的包裝：培養(yǎng)皿由一底一蓋組成一套，用牛皮紙將10套培養(yǎng)皿（皿底朝里，皿蓋朝外，5套、5套相對(duì)而放）包好。（3）棉塞的制作：按試管口或錐形瓶口大小估計(jì)用棉量，將棉花鋪成中間厚、周?chē)饾u變薄的近正方形，折一個(gè)角后（成五角形）卷成卷，一手握粗端，將細(xì)端塞入試管或錐形瓶的口內(nèi)，棉塞不宜過(guò)緊或過(guò)松用手提棉塞，以管、瓶不掉下為宜。棉塞四周應(yīng)緊貼管壁或瓶壁不能有褶皺，以防空氣微生物沿棉塞皺折侵入。棉塞的直徑和長(zhǎng)度視試管和錐形瓶的大小而定，一般約3/5塞入管內(nèi)。必須做到松緊合適，緊貼管壁，拔出時(shí)不松散、不變形。2.滅菌（1）向滅菌器內(nèi)加入清潔的

8、軟水（蒸餾水更好）：水位應(yīng)不超過(guò)水位線(xiàn)標(biāo)志，以免水進(jìn)入滅菌桶內(nèi)，浸濕被滅菌物品。（2）堆放物品并注意留有空隙：將需要滅菌的物品包好后，順序放在滅菌鍋內(nèi)的篩板上。（3）蓋上蓋子：對(duì)稱(chēng)地緊固螺栓，注意不宜旋得太緊，以免損壞橡膠密封墊圈。（4）打開(kāi)電源預(yù)置滅菌溫度：通過(guò)壓力-溫度控制器旋鈕預(yù)置，溫度預(yù)置范圍在109-126，順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)旋鈕，滅菌溫度預(yù)置值減?。环粗?，預(yù)置值增大?？筛鶕?jù)需要確定預(yù)置滅菌溫度。（5）設(shè)置滅菌時(shí)間：按照不同的需要，將計(jì)時(shí)器旋鈕按順時(shí)針?lè)较蛐了璧臅r(shí)間刻度上，當(dāng)達(dá)到預(yù)置的滅菌溫度時(shí)，計(jì)時(shí)指示燈亮，計(jì)時(shí)器自動(dòng)計(jì)時(shí)。（6）加熱，排放冷空氣。（7）滅菌。（8）結(jié)束（關(guān)電源）：

9、此時(shí)切忌立即放氣，一定要待指針接近“零”位時(shí)，再打開(kāi)放氣閥，取出物品，排掉鍋內(nèi)剩余水。五系列稀釋?zhuān)瑑A倒平板操作步驟，平板標(biāo)記（一）系列稀釋在總大腸菌群的檢驗(yàn)中，對(duì)生活飲用水進(jìn)行測(cè)定，往2支各裝有50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大發(fā)酵管中，以無(wú)菌操作各加入100mL水樣，在10支各裝有5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)的發(fā)酵管中，以無(wú)菌操作各加入10mL水樣，混勻后置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀(guān)察其產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況，不需要進(jìn)行稀釋。（二）傾倒平板操作步驟在培養(yǎng)24h后，將事先已滅菌的伊紅亞甲藍(lán)培養(yǎng)基融化后，傾倒于事先已滅菌的3個(gè)培養(yǎng)皿中，制成平板。待冷卻至5060，將經(jīng)培養(yǎng)24h后產(chǎn)酸（培養(yǎng)基呈黃色）、

10、產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的發(fā)酵管取出，無(wú)菌操作，用接種環(huán)挑取一環(huán)發(fā)酵液與伊紅亞甲藍(lán)培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線(xiàn)，共3個(gè)，進(jìn)行標(biāo)記后，倒置于37恒溫箱中培養(yǎng)1824h，觀(guān)察菌落特征。（三）平板標(biāo)記在細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定中，使用的環(huán)境樣品仍為生活飲用水，準(zhǔn)備4個(gè)已滅菌的培養(yǎng)皿，用無(wú)菌移液管吸取1mL充分混勻的水樣注入其中3個(gè)培養(yǎng)皿中，傾注入約10mL已融化并冷卻至50左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于這4個(gè)培養(yǎng)皿中，平放于桌上迅速搖勻，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻，冷凝后成平板，其中未傾注水樣的為空白對(duì)照，進(jìn)行標(biāo)記后，將以上平板置于37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，計(jì)菌落數(shù)。六培養(yǎng)條件記載：溫度：16 天氣：陰天七菌落特征記載：（菌落形

11、態(tài)是用顯微鏡觀(guān)察的）在普通瓊脂培養(yǎng)基上面都是一樣的,圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起。典型的大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的特征為：深紫黑色、光滑、濕潤(rùn)、帶有金屬光澤的圓形菌落。八劃線(xiàn)分離、純化操作步驟記載、微生物形態(tài)觀(guān)察記載、純菌株確認(rèn)水樣：科大湖水菌種記錄：菌種一：淡黃色，圓形層狀，邊緣不整齊，菌落大稀釋濃度 菌落個(gè)數(shù) 23個(gè) 52個(gè) 67個(gè)菌種二：乳白色，圓形，邊緣光滑，菌落中等稀釋濃度 菌落個(gè)數(shù) 13個(gè) 97個(gè) 無(wú)法計(jì)數(shù)菌種三：白色，菱形，邊緣光滑，菌落小稀釋濃度 菌落個(gè)數(shù) 15個(gè) 43個(gè) 93個(gè)（一）平板劃線(xiàn)法.加熱融化培養(yǎng)基待用。劃線(xiàn)：將接種環(huán)在火焰上燃燒，滅菌后，在自來(lái)水樣中

12、浸濕，冷卻810s。用接種環(huán)將菌液均勻的涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。（涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行）培養(yǎng)：接種完畢后，蓋上培養(yǎng)基蓋，將培養(yǎng)皿放置整齊，統(tǒng)一進(jìn)行培養(yǎng)。觀(guān)察：觀(guān)察生長(zhǎng)出來(lái)的菌落的形態(tài)，并從分離的平板上單個(gè)菌落挑取少量菌苔，涂在載玻片上，在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的個(gè)體形態(tài)。（二）澆注平板法（1）融化培養(yǎng)基，待用。（2）制作培養(yǎng)基并編號(hào)。（3）將自來(lái)水樣加入培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)基中加10mL，使菌液充分混勻。（4）倒平板：將已融化并冷卻至50左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指無(wú)名指和小指托住皿底，拇指和食指將皿蓋掀開(kāi)，倒入培養(yǎng)基

13、后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時(shí)針和反時(shí)針來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2428h，然后觀(guān)察結(jié)果。（三）微生物形態(tài)觀(guān)察記載革蘭氏陰性短桿菌，周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢。（四）純菌株確認(rèn)：得到了純菌株。九結(jié)果與分析多管發(fā)酵法（一）科大湖水的測(cè)定（1）初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)： 結(jié)果：2支發(fā)酵管兩支試管內(nèi)都有產(chǎn)氣現(xiàn)象，而且培養(yǎng)基顏色都由原來(lái)的紅色變?yōu)辄S色，說(shuō)明其產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，為陽(yáng)性反應(yīng)，有大腸桿菌群存在。10支發(fā)酵管，其中有6支試管有產(chǎn)氣現(xiàn)象，另外4支試管中培養(yǎng)基的顏色都又原來(lái)的紅色變成了黃色，初步確定水樣中有大腸菌群的存在。（2）確定性實(shí)驗(yàn)：結(jié)果：在普通瓊脂培養(yǎng)基上面都

14、是一樣的,圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起。在伊紅-亞甲藍(lán)培養(yǎng)基平板上菌落特征為深紅色、不帶金屬光澤、表面光滑、濕潤(rùn)。無(wú)紫紅色和淡紅色菌落。（3）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：結(jié)果：復(fù)發(fā)酵后進(jìn)行革蘭氏染色后得到紅色的菌體。（4）水樣中總大腸菌群的測(cè)定結(jié)果：10ml原水+5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：5支試管有產(chǎn)氣現(xiàn)象1ml原水+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：5支試管有產(chǎn)氣現(xiàn)象1ml原水稀釋0.1倍+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：5支試管有產(chǎn)氣現(xiàn)象得出結(jié)論：根據(jù)以上結(jié)果查附錄六表4得知每100ml水樣中細(xì)菌的最大可能數(shù)大于2400個(gè)由國(guó)標(biāo)可知水源水1ML中細(xì)菌總數(shù)不能超過(guò)100，本次所取水樣與國(guó)標(biāo)

15、相差甚遠(yuǎn)，科大湖水污染嚴(yán)重，由于學(xué)校污水處理廠(chǎng)處理水質(zhì)不達(dá)標(biāo)，直接排入湖內(nèi)，加上湖水更新較慢導(dǎo)致細(xì)菌大量繁殖。（二）細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)菌種類(lèi)很多，有各自的生理特性，必須用適合它們生長(zhǎng)的培養(yǎng)基才能將它們培養(yǎng)出來(lái)。然而，在實(shí)際工作中不易做到，所以通常用一種適合大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)腐生型細(xì)菌，以它的菌落總數(shù)表明有機(jī)物污染程度。水中細(xì)菌總數(shù)與水體受有機(jī)污染的程度成正相關(guān)，因此細(xì)菌總數(shù)作為評(píng)價(jià)水體污染程度的一個(gè)重要指標(biāo)。細(xì)菌總數(shù)越大，說(shuō)明水體被污染的越嚴(yán)重。（二）水源水1.稀釋水樣 在無(wú)菌操作條件下，以10倍稀釋法稀釋水樣，視水體污染程度確定稀釋倍數(shù)，具體操作如實(shí)驗(yàn)七的三（一）。2.取

16、水樣至培養(yǎng)皿 用無(wú)菌移液管吸取3個(gè)適宜濃度的稀釋液1mL（或0.5mL）加入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再倒入培養(yǎng)基，冷凝后倒置37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.計(jì)菌落數(shù) 將培養(yǎng)24h的平板取出計(jì)菌數(shù)落。取在平板上有30300個(gè)菌落的稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)。五菌落技術(shù)及報(bào)告方法 進(jìn)行平皿菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可以肉眼觀(guān)察，也可用放大鏡和菌落計(jì)數(shù)器。記下同一濃度的3個(gè)平板的菌落總數(shù)，計(jì)算平均值，再乘以稀釋倍數(shù)即為1mL水樣中的細(xì)菌菌落總數(shù)。（一）平板菌落數(shù)的選擇記數(shù)時(shí)應(yīng)選擇菌落數(shù)在30300/皿之間的稀釋倍數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)：若其中一個(gè)平板上有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)該以無(wú)片菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)；若平板菌落約為平板

17、的一半，而另一半平板上菌落數(shù)分布很均勻，則可以按照半個(gè)平板上的菌落計(jì)數(shù)，然后再乘以2作為整個(gè)平板的菌落數(shù)。（二）稀釋度的選擇（1）試驗(yàn)中，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍（30300）時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。（2）當(dāng)有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均在30300之間時(shí)，則應(yīng)視兩者均落數(shù)之比值來(lái)決定，若比值小于2，應(yīng)該報(bào)告兩者之平均數(shù)；若大于2則報(bào)告其中較小的菌落數(shù)。（3）當(dāng)所有的稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300時(shí)，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。（4）當(dāng)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30時(shí)，則應(yīng)按稀釋度最低平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。（5）當(dāng)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在303

18、00之間時(shí)，則以最接近300或者30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。菌落計(jì)數(shù) 在每個(gè)濃度下的三個(gè)培養(yǎng)皿中選取菌落分布比較均勻的進(jìn)行數(shù)數(shù)結(jié)果如下：表1稀釋倍數(shù)0.0010.00010.00001菌落數(shù)個(gè)數(shù)51192無(wú)法計(jì)數(shù)菌落總數(shù)CFU/ml復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：無(wú)菌操作，用接種環(huán)挑取具有上述菌落特征、革蘭氏染色陰性的菌落于裝有10mL普通濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，每管可接種同一平板上的13個(gè)典型菌落的細(xì)菌。于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者證實(shí)有大腸桿菌存在，該發(fā)酵管被判為陽(yáng)性管。根據(jù)陽(yáng)性管數(shù)及實(shí)驗(yàn)所需的用水量，即可運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)原理計(jì)算出每升水樣中總大腸菌群的最大可能數(shù)目（MPN），可用下式計(jì)算：MPN=1