基因表達(dá)譜分析技術(shù)

1、基因表達(dá)譜分析技術(shù)1 微陣列技術(shù)（ microarray ） 這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的可用于大規(guī)?？焖贆z測(cè)基因差別表達(dá)、基因組表達(dá)譜、 DNA 序列 多態(tài)性、致病基因或疾病相關(guān)基因的一項(xiàng)新的基因功能研究技術(shù)。其原理基本是利用光導(dǎo)化 學(xué)合成、照相平板印刷以及固相表面化學(xué)合成等技術(shù) , 在固相表面合成成千上萬(wàn)個(gè)寡核苷酸“探針”（cDNA ESTs或基因特異的寡核苷酸），并與放射性同位素或熒光物標(biāo)記的來(lái)自不同 細(xì)胞、組織或整個(gè)器官的 DNA或 mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈 cDNA進(jìn)行雜交，然后用特殊的檢 測(cè)系統(tǒng)對(duì)每個(gè)雜交點(diǎn)進(jìn)行定量分析。其優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)對(duì)大量基因，甚至整個(gè)基因組的基因 表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析。

2、包括 cDNA芯片（cDNA microarray ）和 DNA芯片（DNA chips）。cDNA芯片使用的載體可以是 尼龍膜，也可以是玻片。當(dāng)使用尼龍膜時(shí)，目前的技術(shù)水平 可以將20000份材料點(diǎn)在一張12cmx 18cm的膜上。尼龍膜上所點(diǎn)的一般是編好順序的變性了 的雙鏈cDNA片段。要得到基因表達(dá)情況的數(shù)據(jù)，只需要將未知的樣品與其雜交即可。雜交的結(jié)果表示這一樣品中基因的表達(dá)模式，而比較兩份不同樣品的雜交結(jié)果就可以得到在不同樣 品中表達(dá)模式存在差異的基因。雜交使用的探針一般為mRNA勺反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，標(biāo)記探針使用32PdATP。 如果使用玻片為載體，點(diǎn)陣的密度要高于尼龍膜。 雜交時(shí)使用兩種不

3、同顏色的熒光標(biāo)記不同的兩份樣品，然后將兩份樣品混合起來(lái)與一張芯片雜交。洗去未雜交的探針以后， 能夠結(jié)合標(biāo)記cDNA的點(diǎn)受到激發(fā)后會(huì)發(fā)出熒光。 通過(guò)掃描裝置可以檢測(cè)各個(gè)點(diǎn)發(fā)出熒光的強(qiáng) 度。對(duì)每一個(gè)點(diǎn)而言， 所發(fā)出的兩種不同熒光的強(qiáng)度的比值， 就代表它在不同樣品中的豐度。 一般來(lái)講，顯示出來(lái)的圖像中，黃色的點(diǎn)表示在不同的樣品中豐度的差異不大，紅色和綠色 的點(diǎn)代表在不同樣品中其豐度各不相同。使用尼龍膜為載體制作 cDNA芯片進(jìn)行研究的費(fèi)用要比玻片低，因?yàn)槟猃埬た梢灾貜?fù)雜交。檢測(cè)兩種不同的組織或相同組織在不同條件下基因表 達(dá)的差異，只需要使用少量的尼龍膜。但是利用玻片制作的 cDNA芯片靈敏度更高，而

4、且可以使用 2 種探針同時(shí)與芯片雜交，從而降低了因?yàn)殡s交操作帶來(lái)的差異；缺點(diǎn)是無(wú)法重復(fù)使用 還必須使用更為復(fù)雜的儀器。Guo等（2004）將包含104個(gè)重組子的cDNA文庫(kù)點(diǎn)在芯片上，用于檢測(cè)擬南芥葉片衰老 時(shí)的基因表達(dá)模式，得到大約6200差異表達(dá)的ESTs對(duì)應(yīng)2491個(gè)非重復(fù)基因。其中有 134個(gè)基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，182個(gè)基因預(yù)測(cè)參與信號(hào)傳導(dǎo)，如MAPK級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)路徑。Li等（2006）設(shè)計(jì)高密度的寡核苷酸 tiling microarray 方法，檢測(cè)秈稻全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。芯片上 包含 13,078,888 個(gè) 36-mer 寡核苷酸探針，基于秈稻全基因組 shot-gun 測(cè)序的序列

5、合成， 大 約 81.9%（35,970）的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄事件。 Hu 等（2006）用含有 60,000 寡核苷酸探針（代表 水稻全部預(yù)測(cè)表達(dá)基因）的芯片檢測(cè)抗旱轉(zhuǎn)基因植株（過(guò)量表達(dá)SNAC1水稻）中基因的表達(dá)情況，揭示大量的逆境相關(guān)基因都是上升表達(dá)的。2 基因表達(dá)系列分析（ Serial analysis of gene expression,SAGE）基因表達(dá)系列分析（SAGE是一種轉(zhuǎn)錄物水平上研究細(xì)胞或組織基因表達(dá)模式的快速、 有效的技術(shù)，也是一種高通量的功能基因組研究方法，它可以同時(shí)將不同基因的表達(dá)情況進(jìn) 行量化研究（Velculescuet al., 1995）。SAGE的基本原理是

6、：每一條 mRNA序列都可以用它包含的9bp的小片段（TAG代替，因此考查這些TAGs出現(xiàn)的頻率就能知道每一種mRNA的豐度。首先利用生物素標(biāo)記的oligo （dT）引物將mRN反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA然后利用NlaHI酶切雙鏈cDNA NlaIII酶的識(shí)別位點(diǎn)只有 4bp,因此cDNA都被切成幾十 bp的小片段。帶有 生物素標(biāo)記的小片段 cDNA被分離出來(lái)，平均分成 2份。這2份cDNA分別跟2個(gè)接頭連接， 2個(gè)接頭中均有一個(gè) FokI酶切位點(diǎn)。FokI是一種II S型核酸內(nèi)切酶，其識(shí)別位點(diǎn)不對(duì)稱(chēng)， 切割位點(diǎn)位于識(shí)別位點(diǎn)下游9bp且不依賴(lài)于特異的 DNA序列。FokI酶切分成2份的cDNA之 后

7、，帶有部分接頭序列的 TAGS就被釋放下來(lái)。這時(shí)將 2份cDNA昆合起來(lái)，進(jìn)行連接反應(yīng)。根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增連接反應(yīng)的產(chǎn)物，然后通過(guò)NlaHI酶切PCR產(chǎn)物得到連接在一起的兩個(gè)TAG即ditag 。將ditags串連起來(lái)，克隆到質(zhì)粒載體中。一般每個(gè)克隆包含50個(gè)左右的ditags。這些克隆經(jīng)過(guò) PCR擴(kuò)增然后測(cè)序。因?yàn)槊恳粋€(gè)ditag之間都是以NlaHI識(shí)別位點(diǎn)間隔的，所以很容易對(duì)每個(gè)的 ditag進(jìn)行區(qū)分和計(jì)數(shù)。而每一個(gè)TAG在 SAGE庫(kù)中出現(xiàn)的 頻率就代表了該基因的表達(dá)水平。利用SAGE可以在短期內(nèi)得到豐富的表達(dá)信息，與直接測(cè)定cDNA克隆序列方法相比，減少了大量的重復(fù)測(cè)序，從而大大

8、節(jié)省了研究時(shí)間和費(fèi)用。這種方 法對(duì)正常、癌基因旁、癌組織中基因的差異表達(dá)研究方面還有獨(dú)到的優(yōu)點(diǎn)，有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤 特異基因。首次運(yùn)用SAGE技術(shù)是分析1000個(gè)胰腺基因的表達(dá)情況(Velculescu et al., 1995), 結(jié)果都顯示它是一種有效的功能基因組研究方法。最早用SAGE技術(shù)進(jìn)行研究的高等植物是水稻(Matsumura et al., 1999)。運(yùn)用SAGE技術(shù)檢測(cè)了水稻中來(lái)源于6000個(gè)基因10000個(gè)TAGs SAGE分析顯示絕大部分高表達(dá)基因都是看家基因，這些基因的mRNA在總RNA中的比例超過(guò)1%。在無(wú)氧處理和對(duì)照的幼苗中分析了2000個(gè)左右的TAGs結(jié)果顯示多數(shù)基因

9、的表達(dá)沒(méi)有變化。有趣的是，發(fā)酵途徑相關(guān)的基因同樣沒(méi)被檢測(cè)到。根據(jù)TAG序列設(shè)計(jì)引物，成功擴(kuò)增出了延伸因子EF-1a 0.2kb的cDNA片段。這一事實(shí)說(shuō)明利用9bp的TAG序列和4bp的Nlalll識(shí)別位點(diǎn)序列，可以設(shè)計(jì)引物用于長(zhǎng)片段cDNA的獲得。3 cDNA-AFLPcDNA-AFLP是從基因組 AFLP方法(Vos et al., 1995)發(fā)展來(lái)的 RNA旨紋技術(shù)。經(jīng) 典的 cDNA-AFLP按照標(biāo)準(zhǔn)的AFLP方法進(jìn)行操作，只不過(guò)模板變成了 cDNA這一方法包含3個(gè)步驟： a.將cDNA酶切并連上載體；b.利用包含選擇性堿基的引物進(jìn)行擴(kuò)增；c.電泳及成像。一般選擇兩種限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行c

10、DNA的消化，這兩種酶一種的酶切位點(diǎn)為4個(gè)堿基，另一種為 6個(gè)堿基。在植物基因組的 AFLP操作中，需要添加 3個(gè)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。因?yàn)閏DNA的復(fù)雜性比基因組低，所以 cDNA-AFLP中每個(gè)引物只需要 2個(gè)選擇性堿基。聚丙烯酰胺凝膠電泳中， 最大的cDNA-AFLP產(chǎn)物為1000bp左右，最小將近 100bp。對(duì)馬鈴薯的已知cDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，cDNA-AFLP中常用的兩種酶只能同時(shí)切割大約45%的cDNA如果使用這種方法，幾乎一半的基因的表達(dá)情況是無(wú)法被揭示出來(lái)的，因此對(duì)cDNA-AFLP方法進(jìn)行了修改，在cDNA的酶切時(shí)僅僅采用單酶切，這就是單酶切的cDNA-AFLP技術(shù)(Habu e

11、t al.,1997)。1999年，Kawamoto等人進(jìn)一步發(fā)展了這項(xiàng)技術(shù)，他們稱(chēng)之為iAFLP技術(shù)。利用該技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本的基因表達(dá)差異。cDNA-AFLP技術(shù)在植物中的首次運(yùn)用，是Bache 口等(1996)對(duì)馬鈴薯基因表達(dá)差異的研究。該研究分離到兩個(gè)在馬鈴薯塊莖形成過(guò)程中差異表達(dá)的cDNA片段。這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄都是塊莖特異性的； 它們?cè)?15天的塊莖中高度表達(dá), 但在其它組織中表達(dá)量很低。 此后無(wú)論在 分離抗逆相關(guān)基因的研究也有成功的報(bào)道( Ivashuta et al.,1999)。4 差異展示 PCR( DifferentialDisplay Reverse Transcr

12、iption PCR, DDRT-PC)RDDRT-PCR1基于反轉(zhuǎn)錄和 PCR的功能基因組研究方法，最早由Liang和Pardee (1992)報(bào)道。這種方法能有效地檢測(cè)真核細(xì)胞中特定基因的表達(dá)模式,因而可以用于發(fā)現(xiàn)和克隆新 的基因。DDRT- PCR技術(shù)的基本原理是擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物得到分子量大小不同的cDNA片段。首先利用oligo (dT)引物反轉(zhuǎn)錄 mRNAI到cDNA然后利用相同的 oligo (dT)引物和另一隨 機(jī)引物進(jìn)行PCRF增。到目前為止該技術(shù)已經(jīng)得到了大量的改進(jìn)。為了提高特異性，可以增 加隨機(jī)引物的特異性。堿基數(shù)增加以后，有可能包含某一特異基因家族的保守序列，這使得 檢測(cè)某

13、一類(lèi)基因的表達(dá)情況成為現(xiàn)實(shí)。分離DDRT-PCR勺產(chǎn)物簡(jiǎn)單易行，可以通過(guò)變性或非變 性的聚丙烯酰胺凝膠電泳( Liang et al., 1995)、毛細(xì)管電泳( George et al., 1997)或 普通瓊脂糖電泳獲得。DDRT-PCR產(chǎn)物的標(biāo)記，可以使用33PdATP (Simon and Oppenheimer, 1996)、熒光( Jones et al., 1997)或銀染( Gottschlich et al., 1997)。因?yàn)檫@種方法非常簡(jiǎn)便，所以它得到了廣泛的應(yīng)用。自從該方法被發(fā)明以來(lái)，已有許多成功的報(bào)道，應(yīng)用范圍包括從微生物到人類(lèi)的各個(gè)物種。在植物中運(yùn)用DDRT-PC

14、R法得到了大量的cDNA克隆，從擬南芥中得到了一些控制生物鐘的基因(Kreps et al., 2000)，從大麥野生型品種和無(wú)根毛的突變體中克隆了一個(gè)控制根毛形成的基因HvEXPB(1 Bratanich andBlanchetot, 2006)。該技術(shù)在生物對(duì)逆境條件適應(yīng)的研究中同樣得到了廣泛的應(yīng)用，為了弄清楚在多系統(tǒng)衰竭綜合癥中豬圓環(huán)病毒n型侵入時(shí)發(fā)生的細(xì)胞學(xué)事件，利用DDRT-PC鑒定了一些淋巴細(xì)胞內(nèi)受此病誘導(dǎo)而的靶分子，其中兩個(gè)差異調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本顯示與人的基因有一定同 源性，分別是 RNA剪接因子和透明質(zhì)酸介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)受體(Kwasniewskiand Szarejko, 2006)。5

15、抑制消減雜交( Suppression Subtractive Hybridization,SSH)SSH方法是一種簡(jiǎn)便而高效地尋找差異表達(dá)基因的新方法。該方法是以抑制PCR為基礎(chǔ)的cDNA消減雜交方法。所謂抑制PCR是利用非目標(biāo)序列片段兩端的長(zhǎng)反向重復(fù)序列在退火 時(shí)產(chǎn)生“鍋柄”結(jié)構(gòu)，無(wú)法與引物配對(duì)，從而選擇性地抑制非目標(biāo)序列的擴(kuò)增。 SSH 方法既 利用了消減雜交技術(shù)的消減富集，又利用抑制PCR進(jìn)行了高效的復(fù)性動(dòng)力學(xué)富集。其全部流程包括4個(gè)主要步驟：a.分別反轉(zhuǎn)錄tester和driver的mRNA!到雙鏈cDNA然后利用RsaI 酶切cDNA并將酶切的tester cDNA加上接頭。b.用

16、大大過(guò)量的 driver與tester進(jìn)行兩輪 雜交，對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行抑制PCRF增。c.將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化后挑取文庫(kù)。d.對(duì)SSH文庫(kù)進(jìn)行篩選。抑制差減雜交法不僅能分離高豐度差異表達(dá)基因， 而且能有效富集低豐度差異表達(dá)基因。 1996年Diatchenko等人構(gòu)建了第一個(gè) SSH文庫(kù)，并通過(guò)與人類(lèi) Y染色體的Cosmid文庫(kù)雜交 證實(shí)了該方法的有效性。運(yùn)用該技術(shù)僅通過(guò)一輪反應(yīng)既可使特異表達(dá)的基因富集1000 倍以上。過(guò)去幾十年來(lái)，抑制差減雜交法廣泛運(yùn)用于動(dòng)植物、微生物研究。在植物中主要用于組 織器官、發(fā)育階段和逆境差異表達(dá)基因的篩選( Gepstein et al., 2003;

17、 Chu et al., 2004; Zeng et al., 2006)。 Gepstein 等(2003)利用該方法從擬南芥中得到了約800 個(gè)自然衰老相關(guān)的cDNA片段，Chu等(2004)使用該技術(shù)鑒定了702個(gè)與xa13介導(dǎo)的抗病反應(yīng)相關(guān)的ESTs到目前為止，SSH方法得到了很多改進(jìn)和完善。為了進(jìn)一步消除SSH中的背景，Rebrikov 等( 2000)提出了基于 MOS(Mirror orientation selection )的抑制消減雜交，有效的提 高了篩選效率。Ze ng等(2006)將SSH和cDNAMicroarray 技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用，從棉花中篩選到 了 242個(gè)體細(xì)胞胚胎形成相關(guān)的cDNA片段，進(jìn)一步證實(shí)了該方法的實(shí)用性。以上幾種都是高通量篩選特異表達(dá)基因的方法，但是同時(shí)給我們帶來(lái)大量重復(fù)或無(wú)意的 數(shù)據(jù)。帶來(lái)這一問(wèn)題的一個(gè)原因是因?yàn)橐环NmRNA能產(chǎn)生不止一個(gè)信號(hào)。我們構(gòu)建的cDNA文庫(kù)和制作的cDNA芯片，都不可避免地會(huì)包含重復(fù)克隆。而如果我們使用單酶切cDNA-AFLP那么每一條mRNA都最終會(huì)形成不止一條條帶(Habu et al., 1997)。當(dāng)然隨著技術(shù)地改進(jìn)， cDNA-AFLP中的冗余信息有可能被徹底除去(Matz et al.,1999)。但是DDRT-PCF的特點(diǎn)卻決定了它一定會(huì)有重復(fù)數(shù)據(jù)。因?yàn)槊恳粭lmRNAi常都會(huì)跟不止一對(duì)