發(fā)酵法生產α熊果苷及其分離純化

1、北京化工大學碩士學位論文發(fā)酵法生產-熊果苷及其分離純化姓名：劉春巧申請學位級別：碩士專業(yè)：發(fā)酵工程指導教師：張鵬20100606北京化工大學碩：論文發(fā)酵法生產一熊果苷及其分離純化摘要一熊果苷，一種高效、安全、配伍性強的天然美白活性物質。它比同分異構體一熊果苷的美白效果更好、更安全。本論文探討利用嗜麥芽黃單胞菌一（）生物合成一熊果苷，并對產物分離純化進行了研究。利用嗜麥芽黃單胞菌一催化合成【一熊果苷的方法具有原料簡單，反應條件容易控制，反應周期短，產物純度高等優(yōu)點，具有重要的工業(yè)化意義。本論文系統(tǒng)地闡述了黃單胞菌的誘變篩選過程、發(fā)酵條件的優(yōu)化及產物的分離純化。通過對黃單胞菌的誘變篩選，最終獲得了

2、一株酶活高、專一性強、遺傳性狀穩(wěn)定的菌株；通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定了培養(yǎng)基的最佳配方為：蔗糖，蛋白胨，牛肉膏；培養(yǎng)的最佳條件：發(fā)酵培養(yǎng)基于三角瓶中，在。、搖床培養(yǎng)，加入反應物對苯二酚與蔗糖進行反應小時；發(fā)酵液以大孔吸附樹脂進行分離純化，通過對多種樹脂的選擇，最終選擇了一種吸附力強、柱效高、壽命長的樹脂一，分離純化的最佳條件為：樹脂吸附力為樹脂，上柱液濃度為，上柱流速為，洗脫液濃度為酒精溶液，洗脫流速為，洗脫液體積為；洗脫液進行濃縮結晶，最終獲得的產物純度高達以上，整個工藝過程收率為以上。關鍵詞：【一熊果苷，黃單胞菌，發(fā)酵，大孔吸附樹脂，分離純化北京化工大學碩十論文量僅一，；【一；，曲：，：，；

3、，北京化大學碩上論文，一，：，；，：【，砌，北京化工大學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經注明引用的內容外，本論文不含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結果由本人承擔。作者簽名：關于論文使用授權的說明學位論文作者完全了解北京化工大學有關保留和使用學位論文的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學位期間論文工作的知識產權單位屬北京化工大學。學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許學位論文被查閱和借閱；學?？梢怨?/p>

4、學位論文的全部或部分內容，可以允許采用影印、縮印或其它復制手段保存、匯編學位論文。保密論文注釋：本學位論文屬于保密范圍，在土年解密后適用本授權書。非保密論文注釋：本學位論文不屬于保密范圍，適用本授權書。作者簽名：導師簽名：日期：巡臣二！二日期：圣芝！竺：！魚：里北京化大學碩十論文第一章緒論熊果苷（）屬氫醌苷化合物，化學名為一羥基苯基一一吡喃葡萄糖苷，是源于綠色植物的天然活性皮膚脫色組分，存在于熊果、越橘等植物中，是一種新興的無刺激、無過敏、配伍性強的天然美白活性物質。熊果苷是國際上正在極力推廣的高功效醫(yī)藥、化妝品添加劑，國際公認的高效祛斑美白劑，是美白化妝品理想的添加成份，國內外需求巨大，市場

5、前景廣闊。熊果苷具有顯著的抑制酪氨酸酶活性，減少酪氨酸酶在皮膚中的沉積，對皮膚有漂白、防色變和祛斑的功效。而且熊果苷與安甲環(huán)酸的衍生物及七葉醇等配伍具有極佳的美白作用，抗壞血酸一熊果苷磷酸酯等具有更理想的理化性質，這為開發(fā)更好的護膚品提供了思路。熊果苷有兩種同分異構體，它們分別是一熊果苷（）和一熊果苷（），結構式如下：西呔迫。一例蠕熊果苷的概況熊果苷的美白機理為了比較了一熊果苷與其同分異構體一熊果苷的美白效果的差異，等觀察了它們對來自磨菇及小鼠黑素瘤酪氨酸酶活性的影響。結果表明，一熊果苷抑制來自蘑菇及小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，一熊果苷反抑制小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，但一熊果苷強度為一熊果苷的倍。而且等

6、通過比較一熊果苷和一熊果苷在人體黑素瘤細胞的實驗，發(fā)現(xiàn)一熊果苷美白效果是一熊果苷的倍以上。研究還發(fā)一熊果苷的美白機理是直接抑制酪氨酸酶活性，從而達到減少黑色素的生成；而不是通過抑制細胞生長或酪氨酸酶基因表達的方式來達到減少黑色素的生成的目的，在這個實驗中還發(fā)現(xiàn)，濃度為的一熊果苷未見抑制細胞的生長，而熊北京化工人學碩：論文果苷在同樣的濃度則出現(xiàn)有效地抑制，這進一步說明一熊果苷不是通過殺死黑素細胞來實現(xiàn)人體皮膚的美白效果的，而是通過影響酪氨酸酶來抑制黑素的生成來達到美白效果的。此外，在一熊果苷與人體黑素瘤細胞培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)對苯二酚的存在。這不但說明了一熊果苷在使用過程中是穩(wěn)定的，而且進一步說明一

7、熊果苷的美白作用是其本身的作用而不是其通過分解對苯二酚來實現(xiàn)。而一熊果苷在使用過程中會抑制黑素細胞的生長，長期使用會導致黑素細胞衰退，黑素細胞是人體防御紫外線傷害的一道屏障，所以如果長期使用一熊果苷會使人體降低人體自身對紫外線的防御。因此使用一熊果苷作為化妝品添加劑比一熊果苷更安全，且對人體沒有任何副作用。國內外已經有多家大型化妝品公司使用一熊果苷代替一熊果苷作為美白劑添加劑晴。關于它們具體數(shù)據(jù)如表：表一熊果苷與一熊果苷的比較熊果苷穩(wěn)定性的比較通過水溶性實驗發(fā)現(xiàn)，一熊果苷的水溶性明顯好于一熊果苷，在同等濃度下，一熊果苷只要輕微攪拌就很快溶解，而一熊果苷一般要攪拌很長時間依然有少量的不能溶解。而

8、且在相同濃度相同時間條件下，一熊果苷的水溶液比一熊果苷的水溶液更容易被氧化。所以一熊果苷的穩(wěn)定性比一熊果苷高。熊果苷的制備方法熊果苷（）是從多種屬植物中可分離得到的天然活性物質，其化學名為一羥苯基一吡喃葡萄糖苷（簡稱一熊果苷）。一熊果苷其去色素作用機制已有報道，是酪氨酸酶抑制劑，主要阻斷多巴及多巴醌的合成，從而遏制黑色素的生長，因而具有皮膚增白作用。世紀年代由日本資生堂化妝品株式會社作北京化人學碩士論文為化妝品美白劑首先推出，它是繼一半胱氨酸和曲酸等美白劑后又一個美白劑。不僅對皮膚的雀斑、老人斑、黃褐斑有消褪作用，而且對皮膚的滋潤、皮膚灼傷后的愈合和粉刺等也頗有療效。目前發(fā)達國家美白護膚市場幾

9、乎已被熊果苷壟斷。一熊果苷和一熊果苷的來源完全不同。一熊果苷可以通過植物提取、植物細胞培養(yǎng)和人工合成三種方法來制備。而一熊果苷一般只能通過不同的微生物的酶進行糖轉移反應，讓一分子的葡萄糖和一分子的氫醌結合形成單一的一熊果苷睜。日本學者等采用蔗糖磷酸化酶，在緩沖液中加入氫醌與蔗糖。反應可得一熊果苷。另有采用脂肪嗜熱桿菌在硼酸緩沖液中制備。等利用枯草桿菌振蕩培養(yǎng)，在有氧培養(yǎng)后純化得培養(yǎng)液，在醋酸緩沖液（）加入氫醌、蔗糖和培養(yǎng)液反應制備一熊果苷。年等優(yōu)化了一熊果苷催化的酶類型和反應條件，比較了環(huán)狀糊精葡聚糖轉移酶（）和葡萄糖苷合成酶（）對于氫醌的糖基轉化率發(fā)現(xiàn)優(yōu)于，在最佳反應條件中加入糊精有利于提高

10、苷的合成，同時防止生成物的分解，后達到最高產率。氫醌的苷化率達到（與氫醌的摩爾比）。特別是年等采用單胞桿菌屬凍干細胞，在一緩沖液中使氫醌在反應，發(fā)生一端基異構體糖基化生成一熊果苷。雖然一分子氫醌中有兩個酚羥基，但只有一個羥基被糖基化，同時沒有其他副產物如麥芽三糖等的生成，氫醌的糖基化轉化率達到（與氫醌的摩爾比），具體反應方程式如下：舊口伽工癢臻一豁上科一熊果苷的發(fā)展現(xiàn)狀國內現(xiàn)狀：國內目前所能生產的熊果苷基本上都是一熊果苷，而且主要是通過化學法合成；對于一熊果苷的生產尚未見報道，已有的文獻主要是關于一熊果菅應用方面的研究；這主要是因為以下兩方面原因：一方面是用普通的化學合成手段無法生產一熊果苷，

11、另外一方面是發(fā)酵法生產一熊果苷的難度較大，初期投入較多，風險較大，這導致從事這方面的研究機構很少。北京化火學碩：論文國外現(xiàn)狀：年代中期美國哈佛大學和日本馳名化妝品公司在他們的醫(yī)學研究中從熊果植物中發(fā)現(xiàn)了含有能夠抑制黑色素的活性成份。為了將此發(fā)現(xiàn)造福于人類，研究人員歷時載，潛心研究，終于從植物中提取出了一種無刺激、無過敏、配伍性強的天然美白活性物質一熊果苷。此產品一經問世，既受到化妝品科技領先的日本、美國的格外重視，并被廣泛應用引。該產品已被收入美國化妝品組份匯編和中華人民共和國藥典（年第版）年代初，日本資生掌等公司在世界上率先開發(fā)出含熊果苷的生物美白化妝品。美國一些醫(yī)院用熊果苷臨床治療黑色素沉

12、著嚴重的病人，祛斑效果好，有效率達以上，而且沒有毒害性、刺激性、致敏性。此后，世界上使用熊果苷美白劑的化妝品公司日益增多，特別是近幾年來，有關添加熊果苷的護膚配方不斷出現(xiàn)。國外臨床試驗證明，熊果苷對紫外線照射有安全性和穩(wěn)定性，不但能卓有成效的抑制黑色素，而且還具有良好的配伍性，能協(xié)助其他護膚成份更好的完成美白、保濕、柔軟、祛皺、消炎等作用。因此，發(fā)達國家的美白護膚品市場已被熊果苷所壟斷。美國化妝品香精工業(yè)協(xié)會（）認為熊果苷是二十一世紀獨領風騷非它莫屬的皮膚脫色組份。綠色使者亦極力推薦“使用這種洋溢著綠色植物氣息的化妝品。年末，日本江崎糖業(yè)公司與一家企業(yè)合作，成功開發(fā)出有皮膚增白效果的物質“阿爾

13、法一熊果苷（一熊果苷）”，其抑制黑色素的效果比現(xiàn)有的同類物質高大約十倍。該公司日前發(fā)表的新產品信息說，“阿爾法一熊果苷利用了由微生物的酶進行的糖轉移反應，讓一個葡萄糖與氫醌進行“阿爾法結合，其葡萄糖的結合方式與現(xiàn)有的一熊果苷不同。該公司使用人的正常細胞進行實驗的結果表明，“阿爾法一熊果苷（一熊果苷）抑制黑色素生成的效果比現(xiàn)有的熊果苷（一熊果苷）高十倍刪。熊果苷的應用化妝品國內外絕大多數(shù)學者均報道熊果苷具有美白活性，其美白機理為熊果苷對酪氨酸酶產生競爭性及可逆性抑制，從而阻斷多巴及多巴醌的合成，進而抑制黑色素的生成，達到美白效果。但熊果苷不影響酪酪氨酸酶的表達和合成。熊果苷細胞毒性很低，其不形響

14、人黑色素瘤細胞生長的最高濃度為。在此北京化大學碩上論文濃度下，后黑色素合成受到抑制，且抑制作用呈劑量依賴性。因此熊果苷對皮膚能高效美白祛斑，逐漸淡化、祛除皮膚的崔斑、黃褐斑、黑色素沉著、粉刺和老年斑。一熊果苷作為最新的美容增白劑，世界知名品牌剛剛開始使用。年推出了含有一熊果苷的新活性皮膚增白劑，日本資生堂也推出了含有一熊果苷成分的系列化妝品附湖。經研究發(fā)現(xiàn)一熊果苷對紫外線灼傷所形成的瘢痕具有明顯的效果，其化學性質也比熊果苷效果更為穩(wěn)定，能夠更方便的加入到各種美白亮膚化妝品中。之間最穩(wěn)定，推薦添加量為，之間，可用到所有的配方中【引。目前熊果苷的效果比較理想但價格相對較高。其他用途（）燒燙傷藥原料

15、：熊果葉具有抗炎、抑菌作用，統(tǒng)上用于治療尿路感染，其中熊果苷是其主要藥效。它是新型燒燙傷藥主要成分，特點是快速止痛，消炎力強，迅速消除紅腫，愈合快，不留疤痕。劑型：噴射或涂抹。（）腸道消炎用藥原料：殺菌、消炎效果好，無毒副作用。（）鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用：熊果苷灌胃可增加動物氣管分泌、延長氮水引咳潛伏期、咳嗽次數(shù)減少、氣管酚紅排泌顯增多。劑量能延長哮喘潛伏期；劑能極顯著地對抗豚鼠離體氣管條的收縮【】。在抗炎、祛痰、鎮(zhèn)咳三種作用中，熊果苷的鎮(zhèn)咳效果尤其好切。但到目前為止，其抗炎、止咳、祛痰的機理尚未見報道。（）用藥可增強人體免疫力：最新報導對艾滋病毒具有免疫功能。（）抗氧化作用：藍欽艄刀采用體外培

16、養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞觀察熊果苷對細胞的保護作用。結果表明熊果苷可以抵御所致細胞氧化應激損傷。大孔吸附樹脂它是一種具有大孔結構的有機高分子共聚體，是一類人工合成的有機高聚物吸附劑。因其具多孔性結構而具篩選性，又通過表面吸附，表面電性或形成氫鍵而具吸附性。一般為球形顆粒狀，粒度多為目大孔樹脂有非極性（一，一，一，一），弱極性（一，一，一），極性（一，）之分。大孔吸附樹脂理化性質穩(wěn)定，一般不溶于酸堿及有機溶媒，在水和有機溶劑中可以吸收溶劑而膨脹。北京化工人學碩七論文根據(jù)類似物吸附類似物的原則，一般非極性樹脂宜于從極性溶劑中吸附非極性有機物質，相反強極性樹脂宜于從非極性溶劑中吸附極性溶質，而中等極性吸附

17、樹脂，不但能從非水介質中吸附極性物質，也能從極性溶液中吸附非極性物質。大孔吸附樹脂作用原理（）樹脂的篩選要達到最佳的分離純化效果，必須正確有效的選用樹脂。樹脂的選擇應從樹脂極性、空隙率、孔徑等指標，并根據(jù)需分離物質的極性及吸附量等影響因素綜合考慮。（）吸附量的測定靜態(tài)吸附法：準確稱取經預處理的樹脂各適量，置適宜的具塞玻璃器皿中，緊密加入一定濃度的欲分離純化的物質的水溶液適量，置恒溫振蕩器上振蕩，震動速度一定，定時測定溶液中剩余濃度，直至吸附達到平衡。計算吸附量。（）動態(tài)吸附法：將等量已預處理的樹脂各適量，裝入樹脂吸附柱中，待分離物質水溶液以一定的流速通過樹脂床，測定流出液的濃度，直至達到吸附平

18、衡計算各樹脂的比上柱量（），然后用去離子水清洗樹脂床中未被吸附的量，計算樹脂的比吸附量（）。（上一殘）（上一殘一水洗）靜態(tài)法較動態(tài)法簡單，可控性強，但動態(tài)法更能真實反映實際操作的情況。（）解析率的測定由于樹脂極性不同，吸附作用力強弱不同，解吸難易也不同，若吸附過強，解析太難，解析率過低，產品回收率低，損失太大，即使吸附量再大，也無實際意義。靜態(tài)法：取充分吸附的各種樹脂，分別精密加入解吸劑，解吸平衡后，濾過，測定濾液中吸附成分的濃度，根據(jù)吸附量計算解吸率。動態(tài)法：將解吸劑以一定的速度通過樹脂床，同時配合適當?shù)臋z測方法以確定解析終點，然后測定解吸液中藥物的濃度。（）吸附條件的確定上樣液的濃度，值，

19、上樣液吸附的速度，溫度都會影響大孔樹脂的吸附能力，現(xiàn)分別介紹：吸附液的濃度吸附液的濃度對大孔樹脂的分離純化影響很大。對于一定量樹脂，濃度太低，盡管吸附效率高，但是不能完全發(fā)揮樹脂的作用，浪費樹脂且生產效率低：濃度太北京化大學碩：論文大，樹脂的吸附容量增加，但同時泄漏較多，造成浪費所以在生產過程中，為了提高生產效率且不造成浪費，單柱吸附時，上柱液含生藥量以在泄漏點附近為宜：若多柱串聯(lián)吸附上柱液含生藥量以接近飽和點為宜。泄漏點的測定方法：將藥液按少量多次的原則，在確定的吸附條件下以一定的流速分次通過樹脂床，每次收集流出液，按法分析藥物組分，若在某一時段收集的流出液中在分析方法誤差所允許的條件下，測

20、得該藥物組分，則從開始到此時所上樣的藥液體積總和就是樹脂在該吸附條件下對這一藥物組分的泄漏點。吸附液的值在大孔樹脂的吸附過程中，吸附液的直接影響了溶液的極性，對整個吸附過程中具有重大影響。根據(jù)化合物結構的特點調整原液的值，可以達到較好的吸附效果。樹脂對某種物質的吸附，特別是對生物堿和黃酮類物質的吸附，很大程度上受它的解離程度的影響。對非極性吸附樹脂來講，酸性物質在酸性條件下，以分子形式存在，易被樹脂吸附，而在堿性環(huán)境下，以離子形式存在，物質不易被吸附。因此，原液會影響樹脂吸附性能。藥液上樣吸附的速度上柱液上樣吸附的速度對樹脂的吸附能力也有一定的影響，隨著上樣液流速的加大，從柱中泄漏出的液體也在

21、不斷加大，樹脂吸附量在減小。流速過快時，樹脂與被吸附物質分子間來不及充分接觸，致使分子不能充分擴散到樹脂內表面，就隨著上樣液一起泄露出去，所以造成了隨著流速的增加，吸附量下降，泄漏量增大的現(xiàn)象。在實際生產操作中，從盡量縮短吸附時間和增大吸附量的角度出發(fā)，應根據(jù)不同的吸附柱選擇最佳的流速，一般上樣時控制流速在卜為宜。吸附溫度吸附溫度對樹脂的吸附有一定的影響，當吸附時間相同時，溫度越高，吸附率越高，說明吸附越快，在實際生產中適當升高溫度可縮短吸附達飽和的時間，提高效率。（）解吸條件的確定洗脫劑的確定通常所選的解吸劑應對溶質有較大的溶解度，這樣可以得到高濃度的洗脫液。通過選用的不同洗脫溶劑，以一定的

22、流速通過樹脂床進行解吸，分段收集解吸液，測定濃度，繪制解析曲線，一般解吸曲線越尖銳，不拖尾，解吸率越高。解吸劑的確定根據(jù)實際情況，用稀酸或稀堿溶液調節(jié)解吸液的值，以一定的流速進行解吸，比較不同值的解吸效果，確定解吸液的。北京化大學碩一論文解吸速度的確定一般流速越慢，解吸率越高，解吸效果好。但解吸速率的選擇，還應結合生產周期，綜合考慮生產效率和產品純度，權衡利弊。一般洗脫時控制流速在較為合適。解吸溫度的確定在不同的溫度下，比較解吸效果一般溫度升高，有利于解吸，但溫度過高，有可能使一些吸附性過強的雜質成分解吸而混入成品中，影響產品的純度同時溫度的選擇也應考慮節(jié)能和減少設備腐蝕等因素。大孔吸附樹脂操

23、作步驟（）樹脂的預處理預處理的目的：為了保證制劑最后用藥安全樹脂中含有殘留的未聚合單體，致孔劑，分散劑和防腐劑對人體有害。預處理的方法：乙醇浸泡一用乙醇洗至流出液與水按：混合不渾濁為止一用水洗至無醇味，備用。（）上樣將樣品溶于少量水中。以定的流速加到柱的上端進行吸附。上樣液以澄清為好，上樣前要配合一定的處理工作，如上樣液的預先沉淀，濾過處理，調節(jié)，使部分雜質在處理過程中除去，以免堵塞樹脂床或在洗脫中混入成品上樣方法主要有濕法和干法兩種。（）洗脫先用水清洗以除去樹脂表面或內部還殘留的許多非極性或水溶性大的強極性雜（多糖或無機鹽），然后用所選洗脫劑在一定的溫度下以一定的流速進行洗脫（）再生再生的目

24、的：除去洗脫后殘留的強吸附性雜質，以免影響下一次使用過程中對于分離成分的吸附再生的方法：乙醇洗脫至流出液無色透明為止，再用水洗至中性，備用。論文選題的目的和意義一熊果苷在世紀年代由日本資生堂化妝品株式會社作為化妝品美白劑首先推出，它是繼半胱氨酸和曲酸等美白劑后又一個美白劑。不僅對皮膚的雀斑、老人斑、黃褐斑有消褪作用，而且對皮膚的滋潤、皮膚灼傷后的愈合和北京化工人學碩士論文粉刺等也頗有療效。一熊果苷作為最新的美容增白劑，世界知名品牌剛剛開始使用。年推出了含有熊果苷的新活性皮膚增白劑，日本資生堂也推出了含有熊果苷成分的系列化妝品。經研究發(fā)現(xiàn)一熊果苷對紫外線灼傷所形成的瘢痕具有明顯的效果，其化學性質

25、也比一熊果苷效果更為穩(wěn)定，能夠更方便的加入到各種美白亮膚化妝品中。：間最穩(wěn)定。推薦添加量為之間，可用于所有的配方中。目前發(fā)達國家美白護膚市場幾乎已被熊果苷壟斷。自年通過日本厚生省的認可熊果苷就受了美國和日本大型化壯品廠的密切關注，有人認為對美容品來說世紀將是熊果苷的世紀。熊果苷合成是當前研究工作的一個熱點，其合成有種途徑：有機合成法、生物轉化法和酶合成法。其中有機合成和生物轉化法主要用于熊果苷的合成，而酶法合成對于一熊果苷獨具優(yōu)勢。對于一熊果苷，化學合成尚未能提供高效立體專一性的合成方法，因為一般合成一糖苷的方法對于合成一熊果苷來說都顯得過于繁瑣。故一熊果苷一般只能通過不同的微生物的酶進行糖轉

26、移反應，讓一分子的葡萄糖和一分子的氫醌結合形成單一的一熊果苷。生物法生產符合環(huán)保要求，對于合成一熊果苷獨具優(yōu)勢，因此吸引了許多研究者的興趣，相信今后會有更多新的成果應用于實際。但國內這方面的研究進行得很少，值得引起我們的注意。本課題采用微生物菌體為催化劑，催化蔗糖和對苯二酚合成熊果苷，替代以價格昂貴的糖苷酶為催化劑、產物往往是難于分離的一熊果苷和熊果苷混合物的傳統(tǒng)工藝，再配合其它工藝條件可制造出純度高達以上的產品。本工藝具有成本低、產品純度高、生產操作安全等優(yōu)點。因此發(fā)酵法生產一熊果苷具有重要的現(xiàn)實意義。綜上所述，隨著人們對于僅熊果苷的研究的不斷深入，一熊果苷作為最好的安全高效美白劑必將在國際

27、化妝品中占有極其重要的地位，有著廣闊的應用前景。然而，無論是一熊果苷還是熊果苷還未引起我國化妝品界和化工業(yè)的足夠關注，開發(fā)和利用剛處在起步階段，因此對于生產一熊果苷的深入研究有助于我們緊跟世界化妝品行業(yè)的最新潮流，參與全球化商貿競爭。本論文研究內容采用微生物菌體為催化劑，催化蔗糖和對苯二酚合成一熊果苷，替代以價格昂貴的一糖苷酶為催化劑，產物往往是難于分離的一熊果苷和一熊果苷混合物的傳統(tǒng)工藝。對此，從三個方面來達到以上目的：北京化人學碩一：論文一是采用一糖苷鍵專一性強的菌株，在菌種篩選過程中，通過對菌種誘變、復篩，最后得到一株對一糖苷鍵專一性強的菌株，利用此菌株作為催化劑，催化合成的都是一熊果苷

28、，而不生成一熊果苷；二是通過優(yōu)化發(fā)酵條件，提高一熊果苷產量，優(yōu)化工藝步驟，實現(xiàn)低成本、大規(guī)模生產的目的；三是利用大孔吸附樹脂對產物進行分離純化，首次利用分離效率高、易工業(yè)化放大的大孔吸附樹脂分離純化方法，最終獲得高純度的產品。北京化工人學碩士論文第二章黃單胞菌的誘變篩選一熊果苷（）屬氫醌苷化合物，化學名為一羥基苯基一一吡喃葡萄糖苷，具有顯著的抑制酪氨酸酶活性，減少酪氨酸酶在皮膚中的沉積，對皮膚有美白、防色變和祛斑的功效，是種新型的無刺激、無過敏、配伍性強的天然美白活性物質。在比較一熊果苷與一熊果苷在人體黑色素細胞的實驗中，等瞳研究發(fā)現(xiàn)一熊果苷的美白效果是一熊果苷的倍以上，而且一熊果苷的美白機理

29、是直接抑制酪氨酸酶活性，不抑制人體細胞：然而相同濃度的一熊果苷卻對人體細胞出現(xiàn)了抑制，對使用者有一定的副作用。所以一熊果苷是一種更高效、更安全的美白劑。目前國內對于一熊果苷生產的文獻報道較少。隨著一熊果苷作為美白劑被越來越多人接受，對它的研究也越來越多，作者通過生物法制備一熊果苷，并對工藝條件進行了討論。本章通過誘變篩選，獲得了一株酶活高、專一性強的菌株，利用該菌株催化合成一熊果苷，產物只有單一結構的一熊果苷，轉化率可達到以上，具有重大工業(yè)化意義。材料與方法菌種嗜麥芽黃單胞菌（），由本實驗室保藏。培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：蔗糖，蛋白胨，無水，：，瓊脂，水定容到，×滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖，蛋白

30、胨，無水。，：，：，。，維生素，維生素，煙酸，對氨基苯甲酸納，水定容到，×滅菌。北京化工大學碩論文材料和儀器設備材料：一熊果苷標準品和一熊果苷標準品為公司提供；其他為分析純試劑或商業(yè)用物品。儀器設備：全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；高效液相色譜，日本島津；旋轉蒸發(fā)器從，上海亞榮生化儀器廠；低速大容量離心機型，上海安亭科學儀器廠；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。黃單胞菌的誘變從菌種斜面挑一環(huán)菌種，加入到無菌生理鹽水試管中配成菌懸液，稀釋濃度到一，然后加入不同量的化學誘變劑（硫酸二乙酯），在旋渦混合器上振蕩，取菌懸液涂平板，把平板放在紫外燈（距離）照射不

31、同時間。把復合誘變后平板放在恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。以不經過復合誘變平板作為空白對照，其培養(yǎng)后菌落數(shù)計為，經過復合誘變平板培養(yǎng)后菌落數(shù)計為。計算致死率。致死率（）。然后把復合誘變后菌株分別接種搖瓶發(fā)酵。黃單胞菌的初篩把黃單胞菌涂布平板，挑單菌落依次進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵后加入對苯二酚和蔗糖反應，最后產物走硅膠薄層層析板（），以標準品作對比，把斑點值與顏色跟標準品一樣的菌落挑出保藏。黃單胞菌的復篩把經過初篩的菌株進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵后加入對苯二酚和蔗糖反應，最后產物用高效液相（）檢測，計算對苯二酚的轉化率。北京化大學碩：論文黃單胞菌的培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基于三角瓶中，×和滅菌。將菌種斜面挑一環(huán)接種到三角

32、瓶中，在。、搖床培養(yǎng)。一熊果苷的生物合成在培養(yǎng)好的黃單胞菌發(fā)酵液中加入對苯二酚和蔗糖，、搖床反應。反應方程式：對苯二酚的轉化率：轉化率（）其中為加入到發(fā)酵液中對苯二酚的摩爾量，為反應后發(fā)酵液中一熊果苷的摩爾量。一熊果苷的檢測胡薄層層析法（法）：把反應后的發(fā)酵液用點樣毛細管分別取少量樣品依次點在板上，以正丁醇、異丙醇、水的體積比：為流動相，對甲氧基苯甲醛、乙醇、濃硫酸的體積比：為顯斑劑，在烘箱中烤即可顯色。高效液相法（法）：取發(fā)酵液，加入甲醇，離心。上清液用高效液相色譜檢測。色譜柱：柱，×，；柱溫：；流動相：巾（。）：巾（。）：；流速：；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：；進樣量：。菌濃的

33、測定菌濃用在波長下分光光度計檢測的吸光度咖表示。數(shù)據(jù)處理和分析以下實驗所得數(shù)據(jù)均重復三次，然后取平均值。北京化工大學碩士論文結果與討論黃單胞菌的誘變以本實驗室保藏的嗜麥芽黃單胞菌作為出發(fā)菌株，分別實驗在菌懸液中于不同紫外照射時間對菌體進行誘變，以不照射紫外線的空白平板作為對照。具體結果參見下表。表黃單胞菌的紫外誘變￥根據(jù)微生物發(fā)生突變的概率可知，當菌體的致死率在以上時，菌體發(fā)生突變的概率最大。由上表結果可知，當紫外照射在秒以上時，菌體致死率可達以上，由此可得秒株、秒株、秒株，總共株作為初篩出發(fā)菌株。黃單胞菌的初篩把致死率在以上的平板進行挑單菌落，可得株菌株，依次接種搖瓶發(fā)酵，然后加入對苯二酚和

34、蔗糖反應，反應后發(fā)酵液用法分析，把斑點，及顏色與標準品一致的菌株挑出保藏。通過對株進行發(fā)酵反應，與出發(fā)菌株進行對比，結果比出發(fā)斑點大的菌株有株，跟出發(fā)菌株斑點相近的有株，比出發(fā)菌株低的有株。即有株菌株發(fā)生了正突變，把這株菌株保藏進入下一輪的復篩。具體結果參見圖一及表。北京化上學碩十論史圖部分誘變菌株發(fā)酵反應厲的薄層層析圖（注：最右側樣品為一熊果苷標準品）（：）表發(fā)生止突變的株菌株的圖編號苗落生長情況備注參比他垢塢”埔塢北京化工大學碩上論文注：“”表示發(fā)酵液的菌體密度和斑點大小程度，“”表示斑點明顯大于出發(fā)菌株斑點。黃單胞菌的復篩把經過初篩獲得的株菌株依次進行搖瓶發(fā)酵，加入對苯二酚和蔗糖反應，反

35、應后發(fā)酵液用法分析，最后得到株轉化率在以上的菌株，比出發(fā)菌株轉化率（）高以上，具體結果如表。由表可知菌株一轉化率最高，可達，比出發(fā)菌株轉化率（）提高了。北京化人學碩：論文菌株繼代穩(wěn)定性實驗把菌株一經過連續(xù)繼代代后，依次把各代進行發(fā)酵，繼代穩(wěn)定性結果如圖。由圖可知，第代菌種活力依然不變，一熊果苷轉化率依然高達。由此可見菌株的遺傳性狀是穩(wěn)定的。廠、長、蔣、÷婢繼代（代）圖繼代穩(wěn)定性北京化丁大學碩論文本章小結通過對本實驗室保藏的嗜麥芽黃單胞菌（）進行誘變篩選，最后獲得一株酶活比出發(fā)菌株提高了的菌株，經連續(xù)傳代穩(wěn)定性試驗證明，該菌株遺傳性狀穩(wěn)定，可以作為一熊果苷生產菌株。北京化工人學碩十論文

36、第三章發(fā)酵法生產一熊果苷本章研究黃單胞菌發(fā)酵法生成一熊果苷，通過對其發(fā)酵培養(yǎng)基（碳源、氮源、金屬離子及微量元素等）和發(fā)酵條件（溫度、搖床轉速、發(fā)酵時間糖等）的研究及分析進行了探討。材料與方法菌種嗜麥芽黃單胞菌（），由本實驗室保藏。培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：蔗糖，蛋白胨，無水。，：，：，瓊脂，水定容到，×滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖，蛋白胨，無水，維生素，維生素，煙酸，對氨基苯甲酸納，水定容到，×滅菌。材料和儀器設備材料：一熊果苷標準品和一熊果苷標準品為公司提供；其他為分析純試劑或商業(yè)用物品。儀器設備：全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；高效液相色譜，日本島津：旋轉蒸發(fā)器，上

37、海亞榮生化儀器廠；低速大容量離心機一型，上海安亭科學儀器廠；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。北京化大學碩、：論文黃單胞菌的培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基于三角瓶中，×和滅菌。將菌種斜面挑一環(huán)接種到三角瓶中，在、搖床培養(yǎng)。一熊果苷的生物合成在培養(yǎng)好的黃單胞菌發(fā)酵液中加入對苯二酚和蔗糖，、搖床反應。反應方程式：對苯二酚的轉化率：轉化率（）水其中為加入到發(fā)酵液中對苯二酚的摩爾量，為反應后發(fā)酵液中一熊果苷的摩爾量。一熊果苷的檢測（法）取發(fā)酵液，加入甲醇，離心。上清液用高效液相色譜檢測。色譜柱：柱，；柱溫：；流動相：咖（）：巾（。）：；流速：；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：；進樣量：。菌濃的測

38、定菌濃用在波長下分光光度計檢測的吸光度螄表示。數(shù)據(jù)處理和分析以下實驗所得數(shù)據(jù)均重復三次，然后取平均值。北京化大學碩：論文結果與討論碳源的選擇碳源是微生物發(fā)酵的一個重要因素，實驗分別采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、玉米漿作為碳源，接種菌株發(fā)酵，結果如圖。、蘭彗嘻擗葡萄糖麥芽糖蔗糖淀粉碳源圖不司碳源的比較，由圖可知，麥芽糖與蔗糖作為碳源菌體催化合成一熊果苷活性最大，對苯二酚轉化率高達，而葡萄糖及淀粉轉化率卻很低，這主要是因為菌體胞內聚合酶對以對苯二酚合成一熊果苷的葡萄糖基有基團選擇性。通過分析結果發(fā)現(xiàn)，只有含有葡萄糖基的寡糖才能作為所選菌種催化合成一熊果苷的葡萄糖基供體，原因可能是蔗糖（麥芽糖）通過細胞

39、膜上的、泵運輸進細胞內，在胞內糖基轉移酶作用下轉化為果糖和一葡萄糖（兩分子一葡萄糖），在轉化出葡萄糖分子的同時馬上與對苯二酚在聚合酶催化下以，一糖苷鍵合成一熊果苷；由于淀粉相對分子質量大，通過細胞膜上的、泵無法把它們運輸進細胞內，導致胞內聚合酶無法發(fā)揮作用，所以轉化率很低；對于葡萄糖，因其在水溶液中是以多種結構（如開鏈葡萄糖、葡萄糖和一葡萄糖等結構）存在，所以雖然葡萄糖分子很容易進入細胞內，但是只有少量的以一葡萄存在的葡萄糖分子占據(jù)了酶位點卻不能合成一熊果苷，導致最終轉化率很低。據(jù)文獻報道，等人利用黃單胞菌催化合成一熊果苷的反應只能用麥芽糖結構存在的分子才能與對苯二酚在聚合酶催化下合成一熊果苷

40、，而其他結構糖作為反應物，即只能用麥芽糖作為一熊果苷的葡萄糖基的供體。而本項目篩選北京化丁大學碩論文的菌種具有更廣闊的葡萄糖基供體，大大地降低了生產成本，為工業(yè)化生產奠定了基礎。蔗糖濃度的選擇由上小節(jié)可知，麥芽糖和蔗糖作為菌體發(fā)酵的碳源，對一熊果苷的轉化率影響不大，從經濟角度考慮我們選擇價格更低廉、來源更廣泛的蔗糖作為碳源。通過比較不同蔗糖濃度對發(fā)酵反應的影響，我們試驗了蔗糖濃度為、，結果如下圖，由圖可知，當蔗糖濃度達到時，一熊果苷的轉化率最高，為，繼續(xù)增加濃度對轉化率的影響不大，所以蔗糖的最佳濃度為。不耐蔗糖濃度對發(fā)酵反應的影響硬靜畿加馳們如加了濃度（）圖不同蔗糖濃度對發(fā)酵反應的影響氮源的選

41、擇氮源是微生物發(fā)酵的一個重要因素，實驗分別采用玉米漿、蛋白胨、酵母膏作為氮源，接種菌株發(fā)酵，結果如圖，由圖可知，蛋白胨作為氮源菌體催化合成一熊果苷活性最大，對苯二酚轉化率高達。北京化工大學碩上論文不同氮源對發(fā)酵反應的影晌，、譽、，憎卜暈蜒北京化工人學碩：論文發(fā)酵溫度的影響每一種微生物都有最適的生長溫度，根據(jù)文獻可知，黃單胞菌的最適生長的溫度為，所以分別實驗培養(yǎng)溫度，。一、琶彗、÷辯發(fā)酵溫度（）圖發(fā)酵溫度對一熊果苷轉化率的影響結果如圖所示。由圖可知，當培養(yǎng)溫度為時，一熊果苷的轉化率最高，達，繼續(xù)增加溫度轉化率逐漸下降，這是因為隨著溫度的增加，菌體生長受到抑制，不利于菌體的生長代謝，導致

42、轉化率下降，所以黃單胞菌的最適生長溫度為。發(fā)酵時間的選擇分別實驗了培養(yǎng)時間為、，一熊果苷轉化率的比較，實驗結果如圖，實驗結果圖表明，當菌體發(fā)酵，一熊果苷的轉化率高達。而在其他時間時轉化率都不是很理想，這主要是因為，在培小時前，菌體尚處于對數(shù)期階段，菌體生物量尚未達到最大值，所以轉化率沒達到最大值；而當菌體培養(yǎng)后轉化率反而逐漸下降，這主要是因為菌體在發(fā)酵后處于衰亡期，菌體出現(xiàn)了死亡自溶現(xiàn)象，導致一熊果苷轉化率下降。所以菌株一的最佳發(fā)酵時間是。北京化工人學碩十論文槳斟卻辯發(fā)酵時間（）圖發(fā)酵時間的選擇搖床轉速的影響菌體發(fā)酵轉速的大小直接關系到溶氧及代謝物的傳質速度。由于黃單胞菌是兼性好氧菌，所以溶氧濃度太低或太高生長代謝均受到阻礙。通過實驗不同轉速，結果如圖，由圖可知，搖床轉速為時，一熊果苷轉化率最高，達。廠、裝薅皋辯轉。速拶圖轉速對轉化率的影響北京化大學碩上論文值對菌體發(fā)酵的影響值為最有利于黃單胞桿菌的生長口，由于在菌體生長過程中會有氣體的放出，導