基因組DNA的分離和southern雜交

1、基因組DNA的分離和Southern雜交付憶，梁辰，劉增輝，李松林摘要：真核生物DNA主要以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中，因此制備DNA必須先粉碎組織，裂解細(xì)胞膜和核膜，使核蛋白釋放，在除去蛋白質(zhì)、脂類、糖類和RNA等物質(zhì)，得到純化的DNA。Southern雜交可用來(lái)檢測(cè)經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列。關(guān)鍵詞：基因組DNA，Southern雜交，瓊脂糖凝膠電泳Abstract：Eukaryote DNA mainly exit in nucleus as nucleoprotein, before preparing DNA ,we should comminute t

2、he tissue, split the cell membrane and the nuclear membrane, then nucleoprotein will be released. When we remove the protein, lipoid, carbohydrate and RNA, we get pure DNA. Southern hybridization often used to detect whether the DNA fragment which was cut by restriction enzyme and probe have the sam

3、e sequence.Keywords:Eukaryote DNA, Southern hybridization , agarose gel electrophoresis實(shí)驗(yàn)原理在低溫下制備鼠肝DNA，為了使DNA酶失活，避免降解基因組DNA。通常情況下在有液氮條件下進(jìn)行，產(chǎn)量和質(zhì)量都比在無(wú)液氮條件下高。但本實(shí)驗(yàn)在冰水中制備鼠肝，也較好的保持了DNA不被降解。Southern雜交是由Southern等人于1977年發(fā)明的一種檢測(cè)DNA分子的一種方法。通過Southern印跡轉(zhuǎn)移將瓊脂糖凝膠上的DNA分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后進(jìn)行分子雜交，在濾膜上找到與核酸探針有同源序列的DNA分子。實(shí)

4、驗(yàn)材料：0.2g鼠肝，瓊脂糖，生理鹽水，無(wú)水乙醇，無(wú)菌水，酚/氯仿/異戊醇，氯仿/異戊醇，3mol/L NaAc，TE緩沖液，漿液（Buffer A）500mL，溴酚藍(lán)染料，終止液 500mL，測(cè)活液 30mL，5x電泳緩沖液（pH 8.3）600mL，印跡緩沖液（pH 8.3）2000mL，R-250染色液 500mL，10xPBS 500mL，Gold View，10X loading-buffer，Hind III，探針，酶解液，檢測(cè)緩沖液，變性溶液，抗體溶液，封閉液，洗滌液，預(yù)雜交液，雜交液，SSC，SDS。實(shí)驗(yàn)方法：一、小鼠基因組DNA的分離本實(shí)驗(yàn)在無(wú)液氮的條件下，制備鼠肝DNA，與

5、有液氮條件下相比，產(chǎn)量和質(zhì)量都有所下降。整個(gè)操作過程中，應(yīng)盡量避免DNA酶的污染，特別注意動(dòng)作溫和，減少對(duì)DNA的機(jī)械損傷。1取0.2g鼠肝，用冰冷的生理鹽水洗3次，然后置于2.0mL勻漿液中，用玻璃勻漿器勻漿至無(wú)明顯組織塊存在(冰浴操作，切勿將細(xì)胞破碎，可鏡檢觀察。2將組織細(xì)胞移至2.0mL離心管中，5000 r/min離心2分鐘，(盡可能在低溫下操作，棄上清，若沉淀中血細(xì)胞較多，可再加入5倍于細(xì)胞體積的勻漿液洗一次。3沉淀加0.8mL無(wú)菌水迅速吹散，分成兩份，每份加0.4mL酶解液，翻轉(zhuǎn)混勻(動(dòng)作一定要輕 55水浴處理1218小時(shí)。4向上述酶解后的無(wú)細(xì)胞懸液中加入RNase 至終濃度200

6、ug/ml，37水浴1小時(shí)。5加入等體積酚/氯仿/異戊醇抽提一次，(慢慢旋轉(zhuǎn)混勻，傾斜使兩相接觸面增大。4，12000r/min離心5分鐘。6用擴(kuò)口吸頭移出含DNA的水相(注意切勿吸出界面中蛋白沉淀；有時(shí)如果DNA含量過高，水相在下層實(shí)驗(yàn)時(shí)注意觀察，加等體積氯仿/異戊醇，4，12000 r/min離心5分鐘(若界面或水相中蛋白含量多，可重復(fù)5，6操作。7用擴(kuò)口吸頭小心吸出含DNA的水相，加1/10體積的NaAc，小心混勻(要充分，再向管中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，小心混勻(要充分。 8待基因組DNA脫水成絲，即為染色體絲，用槍頭小心吸出液體, 染色體絲用75冷乙醇洗滌一次，12000 r/min

7、離心5分鐘，室溫干燥(不要太干，否則DNA不易溶解，加入200uL TE緩沖液，存放于4，溶解過夜，即可得到哺乳動(dòng)物基因組DNA。二、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA1將有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好 (一定封嚴(yán)，不能留縫隙。2將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于水平位置，并放好樣品梳子。3將稱取0.2g瓊脂糖放入三角瓶中，加入25mL 1TAE，用封口膜封住三角瓶的上口，在微波爐中將瓊脂糖溶化。4待冷到60左右的瓊脂糖凝膠液時(shí)，加入1L Gold View核酸染料，輕輕混勻，將混勻的膠液緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面 (注意不要形成氣泡。5待膠液凝固后

8、，取下橡皮膏，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放入電泳槽內(nèi)。6加入電泳緩沖液（1TAE）至電泳槽中使緩沖液剛好沒過膠平面，輕輕取出梳子。7加樣：DNA樣品中按照10：1的比例添加10凝膠加樣緩沖液(loading-buffer，混合均勻,用移液槍將DNA樣品加入樣品孔中。(記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量。8電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源，恒壓80V (注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng)。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑移動(dòng)到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。三、基因組DNA的酶切1在滅菌的0.5mL管中，按下表準(zhǔn)備酶切反應(yīng)體系核酸10 x buffer KH2OHind III基因

9、組DNA 50uL10uL32uL8uL2. 37oC保溫兩小時(shí)。3. 加入110體積的3mol/L NaAc pH5.2和2倍體積的無(wú)水乙醇。4. 室溫沉淀20分鐘5. 12，000r/min 離心10分鐘。6. 室溫干燥。7. 加入10uLTE溶解。四、酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳1將50TAE稀釋50倍，即為1TAE21%瓊脂糖凝膠25mL(1TAE,含1uL GoldViewTM3加樣： DNA Marker 8uL（DL15000或DL2000plS） 質(zhì)粒10uL 1uL 10loading buffer酶切產(chǎn)物（鼠肝）10ul 1uL 10loading buffer基因組DNA （

10、鼠肝）6ul 0.6uL 10loading buffer4電泳：恒壓80V電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)染料移出凝膠前沿10min后，停止電泳。5凝膠成像儀觀察和記錄電泳結(jié)果。五、Southern 轉(zhuǎn)膜：（注：以下操作要戴上一次性手套）1用刀片切掉未用過的凝膠區(qū)域，并將凝膠切掉一個(gè)角（對(duì)點(diǎn)樣順序做個(gè)標(biāo)記），然后轉(zhuǎn)至玻璃平皿中。2在室溫下將凝膠浸泡在變性溶液中15分鐘（目的是使DNA雙鏈變性成單鏈），并輕輕搖動(dòng)。更換變性液繼續(xù)浸泡凝膠20分鐘，并輕輕搖動(dòng)使DNA充分變性。3將帶正電荷的尼龍膜裁成比凝膠大一毫米大小，并在相應(yīng)位置上剪掉一個(gè)角，再切六張與尼龍膜一樣大小的濾紙，然后用重蒸水浸濕，再放入堿性轉(zhuǎn)移緩沖液

11、中浸泡約30min。4制作夾心餅式的結(jié)構(gòu)（由下至上:三張潮濕的濾紙膜凝膠三張潮濕的濾紙（膠與膜的切角對(duì)齊,千萬(wàn)不要有氣泡）兩層長(zhǎng)濾紙三層濕濾紙凝膠n+ 尼龍膜三層濕濾紙十層干濾紙10cm吸水紙5 在玻璃板上先放上約 10cm 高的吸水紙，并在其上放上 10 層同樣大小的干濾紙。將夾心餅結(jié)構(gòu)放到其上。在其上放兩層浸濕轉(zhuǎn)移緩沖液的濾紙（濾紙的兩端浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中）。蓋上蓋子，讓凝膠上的 DNA 下行轉(zhuǎn)移 16 小時(shí)或過夜。 蓋子紫外下檢測(cè)凝膠上的核酸是否轉(zhuǎn)移到膜上6 將尼龍膜與凝膠剝離，將膜浸在中和緩沖液中，室溫 15 分鐘，并輕輕搖動(dòng) 。 更換中和緩沖液繼續(xù)室溫浸泡 15 分鐘，并輕輕搖動(dòng) 。

12、六、探針標(biāo)記（PCR法）：1在0.2mL PCR管中按下表加入下列試劑：10buffer 2LdNTP標(biāo)記混合物（含DIG11dUTP） 2L模板（T-載體-643bp） 1L10umol/L引物（sence） 1L10umol/L引物（antisence） 1L無(wú)菌水 12uLTaq酶 1L（1.5U）2. 按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94預(yù)變性5min， 94變性30s， 55，復(fù)性30s， 72延伸30s ，30個(gè)循環(huán)，最后 72繼續(xù)延伸10 min。3終止：將完成標(biāo)記后的反應(yīng)物煮沸5min，立即放入冰浴中,冷藏（20）或直接用于雜交。七、Southern 雜交：1預(yù)雜交：將膜放入雜交管中

13、，加入預(yù)雜交液，在65雜交爐中預(yù)雜交5-6h（4保存一周）。（將雜交膜上的非特異性DNA結(jié)合位點(diǎn)封閉，減少與探針的非特異性吸附降低雜交結(jié)果的本底）。2探針變性： 完成標(biāo)記后，將探針100加熱5min變性，迅速將探針放入冰水浴中冷卻。3雜交：將含膜的雜交管從4轉(zhuǎn)入雜交爐中，待雜交液變清后取出，打開蓋子，將預(yù)雜交液倒出。加入含有探針的新鮮雜交液。將雜交管放在62雜交爐雜交16小時(shí)或過夜。4洗膜：（洗膜目的是將濾膜上未與DNA雜交的及非特異性雜交的探針分子從濾膜上洗去）一洗：2SSC 0.1%SDS 15min2，室溫慢搖。 二洗：1SSC 0.1%SDS 15min2，室溫慢搖。三洗：0.5SSC

14、 0.1%SDS 15min2，6568慢搖。四洗：0.1SSC， 15min，室溫慢搖。八、檢測(cè)：1將膜放入洗滌液中，在1525振搖5min。2將膜放入封閉液中，保溫40min。3將膜放入抗體溶液(用封閉液1：5000稀釋DIGAbAP中，保溫30min。4用洗滌液洗滌膜兩次，每次20min。5將膜放入檢測(cè)緩沖液中，平衡25min。6將膜放入2mL新鮮準(zhǔn)備的有色底物溶液(2mL檢測(cè)緩沖液 40uL NBT/BCIP中，避光使可見的有色斑點(diǎn)產(chǎn)生（千萬(wàn)不能振動(dòng)）。7終止反應(yīng)：待顏色達(dá)到所需的程度時(shí)，用無(wú)菌水或TE浸泡5min即可終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1. 基因組經(jīng)Hind III酶切后電泳結(jié)果圖1

15、：酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖結(jié)果：從左至右上樣順序是：DNA marker、含AKP重組質(zhì)粒、酶切鼠基因組1、大腸桿菌K12基因組1、大腸桿菌K12基因組2、酶切鼠基因組2、酶切大腸桿菌K12基因組1、酶切大腸桿菌K12基因組2、鼠基因組、酶切大腸桿菌K12基因組3。可見，DNA marker條帶比較清楚，重組質(zhì)粒未發(fā)現(xiàn)條帶，大腸桿菌K12基因組兩個(gè)樣本只有一個(gè)隱約可見；其余結(jié)果尚可，酶切鼠基因組2號(hào)有兩條帶，但是彌散比較嚴(yán)重。2. Southern雜交結(jié)果圖2：Southern雜交結(jié)果圖結(jié)果：僅有含酶切鼠基因組2一支條帶顯示，顏色很淺，淡紫色。這支條帶包含了兩個(gè)片段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論：1.

16、 基因組的分離基因組分離對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的要求比對(duì)質(zhì)粒的高。首先要避免內(nèi)源和外源的DNA酶的降解。在實(shí)驗(yàn)中使用液氮（實(shí)際未用）、冰上操作、戴手套、使用潔凈小指管和槍頭都是為盡量減少污染，提高產(chǎn)率。此外實(shí)驗(yàn)應(yīng)加快操作速度，減少操作時(shí)間?；蚪MDNA是很大的分子，很容易受機(jī)械剪切斷成小片段，這在電泳時(shí)就會(huì)出現(xiàn)彌散的條帶或拖尾現(xiàn)象（如圖1第6條帶）。實(shí)驗(yàn)中要求使用擴(kuò)口槍頭，避免在吸入放出液體時(shí)損傷DNA。同時(shí)，操作動(dòng)作應(yīng)放緩慢。2. 酶切產(chǎn)物電泳2.1. 電泳結(jié)果顯示從電泳結(jié)果來(lái)看，由于實(shí)驗(yàn)的目的是提取基因組DNA，而且酶切的結(jié)果的條帶都比較明亮，所以實(shí)驗(yàn)比較成功。除了DNA marker外，可以看到別的

17、條帶在最亮的片段兩端，都有模糊的彌散條帶(圖 1。2.2. 結(jié)果分析重組質(zhì)粒沒有條帶出現(xiàn)，而作為對(duì)照的鼠和大腸桿菌的基因組較為彌散甚至沒有。這說明用于對(duì)照的DNA量不足?？赡茉颍阂环矫嬷饕且?yàn)榇蠖郉NA用于酶切，用于對(duì)照的量較少；另一方面，剩余的DNA因?yàn)楦鞣N損傷或者降解而成為大小不一的分子，也能形成彌散的條帶。限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，共有、3類，我們采用的是Hind。理論上來(lái)說，只要看條帶是不是有多條就可以判斷DNA是否被限制性內(nèi)切酶切開，所以在基因組中應(yīng)該存在多個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)，應(yīng)該切出多個(gè)片段，也就是說，在電泳結(jié)果上，應(yīng)

18、該看到多個(gè)條帶。然而結(jié)果中，除了酶切鼠基因組2較為成功的能看出有兩條條帶外，大多只看見一個(gè)條帶，推測(cè)其原因有二：一是DNA制品的污染，如蛋白質(zhì)、酚、氯仿等均可影響限制性內(nèi)切酶的活性，導(dǎo)致酶切效果不佳；二是酶切片段有的太短，在電泳時(shí)間內(nèi)已經(jīng)跑出凝膠，有的太長(zhǎng)，跑的距離太短難以分辨。而呈彌散狀的條帶，如酶切大腸桿菌K12基因組3，則說明小的DNA片斷的形成不是酶切形成的，影響限制性內(nèi)切酶的因素很多，DNA制品的污染(如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、等均能抑制酶切活性。另外，機(jī)械損傷可能是造成彌散條帶的主要原因。AKP重組質(zhì)粒是實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，它同DNA marker一樣是作對(duì)照用的。但是我們的結(jié)果并沒有觀察到這個(gè)對(duì)照的條帶。可能是因?yàn)楸４娌划?dāng)，已經(jīng)降解。3. Southern雜交Southern雜交是用具有一定同源性的兩條單鏈DNA在一定條件下退火形成雙鏈（常用的是待測(cè)核苷酸序列及標(biāo)記的探針），該過程是高度特異性的。其原理是具有一定同源性的兩條核苷酸單鏈DNA(或DNA與RNA在一定條件下可按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈。 雜交的雙方是待測(cè)核苷酸序列及標(biāo)記的探針， 次雜交過程是高度特異性的。 因此只要雜交成功就會(huì)在尼龍膜上出現(xiàn)雜交帶，代表待測(cè)的核苷酸與探針有互補(bǔ)序列。3.1. Southern雜交結(jié)果我們使用的探針是AKP序列探針，用D