多聚賴氨酸的合成及其微結(jié)構(gòu)對(duì)pH的響應(yīng)_吳生蓉

1、網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2013-04-10 15:42網(wǎng)絡(luò)出版地址:DOI: 10.6023/CJOC201301066研究論文Chin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-1Chin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-#ARTICLEChinese Journal of Organic Chemistry多聚賴氨酸的合成及其微結(jié)構(gòu)對(duì)pH的響應(yīng)吳生蓉，耿欣，陳才，蔡亦康，韓國(guó)志松（南京I業(yè)大學(xué)理學(xué)院南京，210009）摘要 以L-賴氨酸為起始原料，通過(guò)四步反應(yīng)合成了多聚賴氮酸(Polylysm

2、e, PLL),采用紅外、核磁對(duì)苴結(jié) 構(gòu)進(jìn)行了農(nóng)征，并對(duì)關(guān)健介成環(huán)卩進(jìn)行了優(yōu)化.在此卑礎(chǔ)上，通過(guò)掃描電儻和關(guān)二色光譜研究了多聚賴氨酸分子在 不同pH條件下的聚集行為.并對(duì)機(jī)制進(jìn)行了闡述.研究結(jié)果表明，多聚賴妊酸結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境酸堿度冇不同的響應(yīng)，不 同的pH條件下會(huì)9致不同的分子組裝和形貌，心酸性條件下PLL呈現(xiàn)一種特宦的線圈形態(tài)：堿性條件下呈現(xiàn)有序 的松針狀.關(guān)鍵詞 夢(mèng)聚輟氨酸；NCA;合成；pH;響應(yīng)Synthesis of Poly-L-lysine and Its Structural Response toEnvironmental pHWu, Shcngrong Geng, Xin Ch

3、en, Cai Cat Yikang Han, Guozlii*(College of Science Nanjing Unn ersity of Technology. Nanjing 210009)Abstract Using L-lysine as raw material, Polylysme (PLL) was synthesized through four steps. The structures of intermediums and the final product were confirmed by IR and -NMR. Furthermore, some key

4、synthetic steps were optimized in the process. On the basis, response ability to environmental pH of PLL structures was investigated by SEM and Circular dichroism spectra. Experimental results indicated that Polypeptide stnichire of PLL have good response ability to pH of eavironinent. Under differe

5、nt pH conditions, distinct morphology was fbnned. Under acidic conditions, PLL presented a specific coil conformation, whereas orderly pine needle was observed under alkaline conditions.Keywords PLL; NCA; Synthesis： pH; Response E-mail: hannjut 1Januaiy 25,2013; March 15,2013; Apnl 9,2013.Project su

6、pported by Cluna Postdoctoral Foundation (Nos 20100481084 ) 中國(guó)博士JR基金(201001810S4)資助.© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-#DOI: 10.6023/CJOC201301066研究論文ARTICLE0HNH： HC12.Na2S1 CuSO4.Z-ClZ-groupol.HCl(g)2HBr(g)Chinese Journal of Organic

7、 Chemistry炙聚賴氨酸(PLL)作為一種親水性的生物町降解人分子，對(duì)生物無(wú)毒副作用，只令良好的生物相容性.氏可以通過(guò)生物內(nèi)的水解或者稍解反應(yīng)降解為小分子麺基酸，被生物體所吸收也可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入 細(xì)胞因此，廣泛W用醫(yī)學(xué)丁程領(lǐng)域如藥物控釋、組織丁程、基因治療等方面，PLL側(cè)鏈的NH功能甚團(tuán)在 被修飾材料衣面形成陽(yáng)離子層，易與細(xì)胞膜或組織切片上的陰離子靜電吸附，產(chǎn)生較強(qiáng)的粘介力，C被廣泛用 J：商品化細(xì)胞培養(yǎng)版的表而處理，以促進(jìn)細(xì)胞在材料衣面的黏附和生長(zhǎng)，貝冇廣闊的科硏與應(yīng)用前景卩卻多聚賴 氨酸中的多肽結(jié)構(gòu)對(duì)多聚賴氨酸長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)排列形態(tài)也令著帀:要的影響，使得多聚賴氨酸在分子組裝與界面

8、修飾 領(lǐng)域也受到關(guān)注【同I前關(guān)多聚賴氨酸介成以及其結(jié)構(gòu)功能特性的相關(guān)報(bào)道較少，ifuHM些關(guān)鍵點(diǎn)的討論不 是很清晰棊以上問(wèn)題，本文以L賴氨酸為原料，通過(guò)氨基保護(hù)，環(huán)合，開(kāi)徒聚合、脫保護(hù)四步反應(yīng)介成了多 聚賴氨酸，并對(duì)其屮某些關(guān)鍵步驟進(jìn)彳J：了優(yōu)化研究在此妹礎(chǔ)上，通過(guò)打描電鏡、関二色光譜研究了務(wù)聚賴氨 酸在不同pH條件卜的微觀形態(tài)，并対?rùn)C(jī)制進(jìn)行了闡述對(duì)J： PLL應(yīng)用功能界面修飾JI仃較好的指導(dǎo)意義.1結(jié)果與討論1.1合成條件的優(yōu)化賴氨酸!I仃兩個(gè)氨堆，在合成幺聚賴氨酸的過(guò)程中，要對(duì)其中一個(gè)不需要反W的氨堆進(jìn)行保護(hù)，避免副反應(yīng)的發(fā)生E.然后經(jīng)環(huán)化、聚合、脫保護(hù)得到目標(biāo)產(chǎn)品.合成路線如圖1所示.C

9、hin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-#DOI: 10.6023/CJOC201301066研究論文Chin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-#DOI: 10.6023/CJOC201301066研究論文圖1多聚賴氨酸的合成路線圖Figure 1 Synthesis route of PLL1.1.1氨基的保護(hù)Chin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-#Chinese Journal of Organic Chemist

10、ryARTICLE在多聚賴氨酸的合成過(guò)程屮，常用的氨壟保護(hù)策略是將氨基酸屮的氨卑及U-馥基與銅鹽形成氨基酸銅絡(luò) 介物，在側(cè)鏈上引入保護(hù)基之后，再脫除銅離了，得到側(cè)鏈保護(hù)的氨壟酸x°:.傳統(tǒng)方法中，選擇的銅鹽圧堿式離酸 銅，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，堿式碳酸銅4冰中溶解度較小，導(dǎo)致氨基酸與銅鹽絡(luò)合收率較低文中采用硫酸銅，不僅收率 簡(jiǎn)，而11反咸Z后無(wú)須過(guò)濾，可直接進(jìn)行后續(xù)氨卑Z-保護(hù)反應(yīng)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作.在脫除銅離了環(huán)節(jié)，本文研究了 四種試劑，分別足EDTA、HS、硫代硫酸鈉、硫化鈉.試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EDTA去除銅離子受pH影響很大：叫 收率較低, 只有45%.H2S氣體操作起來(lái)比較麻煩Na2S2O3脫

11、除效率也偏低.文中選擇Na2S脫銅離子，收率較高，達(dá)到70%, 而II易于分離.1.1.2 N節(jié)氧按基丄賴氨酸N拔酸軒（Z丄-Lys NCA）的合成在本步反應(yīng)中，采用三光氣替代光氣，安全高效.三光氣在一定溫度下可定星分解產(chǎn)生三分子光氣，三光 氣對(duì)水分比較敏感，本文選擇溫度在5060C之間，采用氮?dú)獗Ｗo(hù).實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)該反應(yīng)的收率冇較大的影響， 隨著溫度從50 C升高到60 C,收率從97%降到73%,如圖2所示.可能是升高溫度使其分解加速，部分光氣來(lái)不及 反應(yīng)而逸出.70605058525456Temperature (°C)http:/sioc-3© 2012 Chin

12、ese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLEhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE圖2 NCA產(chǎn)率與溫度的關(guān)系Figure 2The relationship between the NCA yield and temperature1.1.3 Z-L-Lys NCA 的聚合該聚介反應(yīng)圧開(kāi)環(huán)聚介，機(jī)理上屬于陰

13、離子聚介權(quán)，如圖3所示.Chin. J. Ora. Chem. 2012. 32XXXX XXXXhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE0圖3 NCA聚介機(jī)理Flgure3 NCA polymerization mecliamsm本文以三乙胺為引發(fā)劑，氮?dú)獗Ｗo(hù)下引發(fā)NCA進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚介.并研究了引發(fā)劑的量對(duì)聚介物分子量的影響.分子就的測(cè)定采用粘度法先測(cè)定1%PLL試樣的増比黏度nsp,并根據(jù)卜式計(jì)算聚合度DP(degree

14、 of polymerization)*1Log DP= 0.791og n sp+2. 46結(jié)果如表1所示表1引發(fā)劑用量對(duì)PLL分子量的彩響Table 1 Influence of amount of uutiator on PLL molecular weightnspDPMq1:10.46681582306825:10.839425136646100:10.844525236844150:11 923148370585實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示引發(fā)劑用戢金一定范用內(nèi)對(duì)PLL分子就的影響較大當(dāng)單體與引發(fā)劑的比例從50:1増加到100 E 粘均分子雖:從36844增加到705 P(NCA)

15、的脫保護(hù)P(NCA)脫保護(hù)妹團(tuán)通常自pdC催化卜的還原、HBr HAC, Na/液氮.議渓酸/三氟乙酸等體系本文用了4http:/sioc-http:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE兩種方法脫Z保護(hù)皋團(tuán)，一種是采用HBr/HAc體系；另一種是迪入HBr(g).HCl(g),從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，第種方法 得到的產(chǎn)物7. 5ppm處芳環(huán)質(zhì)子邯消失，說(shuō)明節(jié)氧碳難已脫除干斤，而第一種方法得到的產(chǎn)物7. 5ppm處冇微謝的出 峰,說(shuō)明第種

16、方法效果較好.(見(jiàn)support information)1.2多聚賴氨酸微觀結(jié)構(gòu)對(duì)pH的響應(yīng)由于PLL的多肽特性，外界環(huán)境pH的變化會(huì)對(duì)其會(huì)發(fā)工-個(gè)質(zhì)了-化的過(guò)程.在酸性條ft F,側(cè)鏈氨基獲 得H形成帶止電荷的-NHJ,具備較強(qiáng)的親電性，堿性條件卜，氨皋是典熨的親核試劑.因此，/I： PLL大分子的組裝 過(guò)程中，酸堿性的改變必然對(duì)分了的聚集行為產(chǎn)生影響.本文采用打描電鏡研究了不同pH條件下PLL的圉觀形貌, 圖4是不同pH條件下，PLL溶液在棊片匕自然揮發(fā)干后的掃描電鏡圖.http:/sioc-5© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC

17、. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLEhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE圖4 不同pH條件FPLL的打描電鏡圖(a) PH<7 (b) PH=7 (c) PH>7Figure 4 SEN1 unages of PLL witli different pH (a) PH<7 (b) PH=7 (c) PH>7從圖中明顯看出，不同酸堿性條件

18、下，PLL的形貌截然不同.在酸性條件下，其形貌呈現(xiàn)種特怎的線圈構(gòu)彖(coilconfoniiation),隨著pH的増加，逐漸向淸晰的松針狀轉(zhuǎn)變.在酸性條件下，側(cè)鏈氨基較強(qiáng)lE電性，使得其分 了長(zhǎng)鏈的聚集趨向一種無(wú)圧的排列，以減輕內(nèi)部的排斥力.宏規(guī)上喪現(xiàn)為一種線圈構(gòu)彖.隨著pH的升高.側(cè)鏈氨壟逐 漸向弱的親孩試劑轉(zhuǎn)變，PLL主鏈依靠鏈內(nèi)包鍵盤(pán)繞成穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)，圖5足此過(guò)程的示意圖.(I)(II)http:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic Chemistry

19、ARTICLEPH<7PH>7圖5 PLL結(jié)構(gòu)隨pH轉(zhuǎn)化示意圖Figure 5 Sketch map of PLL structure transfoniiation with different pHChin. J. Org. Chem. 2012. 32xxxxxxxxhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE為了進(jìn)一步驗(yàn)ilE PLL微觀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化與pH Z間確泄的關(guān)聯(lián)，本文忡先測(cè)試了不同pH條件卜PLL水溶

20、液的闘二 色光譜，如圖6所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同pH條件下，PLL溶液的岡二色光譜基本一致這說(shuō)明不同的pH條件， 不會(huì)彩響PLL分子的立體構(gòu)形.- - - -2,-6 (6®pe0。http:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLEhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic Chemis

21、tryARTICLE2008250300350400Wavelength( nm)圖6不同pH條件下，PLL溶液的圜二色光譜Figlire 6 CD curve of PLL solution with different pH然后本文將不同pH條件下的PLL溶液冷凍干燥，再次觀測(cè)其微觀形貌如圖7所示.圖7不同pH條件下PLL溶液凍干后的掃描電鏡圖(a) PH<7 (b) PH=7 (c) PH>7Figure 7 SEM ullages of PLL ria &eezedrying witli different pH conditionshttp:/sioc-#

22、9; 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLEhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE從圖中明顯看出,在酸性條件下,PLL溶液中分子的聚集結(jié)構(gòu)顯得無(wú)序.隨著pH的增加，在緘性條件下,PLL 分子的聚集行為變得較為仃丿仇綜I:所述，PLL分子的聚集行為對(duì)環(huán)境酸堿度仃著良好的響應(yīng).6http:

23、/sioc-http:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE2結(jié)論本文以L賴氨酸為原料，研究了多聚賴基酸的介成，并對(duì)介成環(huán)節(jié)進(jìn)行了詳細(xì)的分析與優(yōu)化.任此基礎(chǔ)上，本 文暇點(diǎn)研究了務(wù)聚賴氨酸的分子聚集組裝行為與環(huán)境pH值之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同的pH會(huì)導(dǎo)致多聚賴氨酸分子不同 的分子組裝彳J為，工現(xiàn)不同的微觀形貌，并對(duì)機(jī)理進(jìn)行了闡述對(duì)于多聚賴氨酸在界面科學(xué)應(yīng)用方面具彳一定的指 導(dǎo)意義.3實(shí)驗(yàn)部分3.1儀器與試劑儀器：數(shù)字顯示熔點(diǎn)測(cè)定儀，X-

24、4型(上海粘密儀表公司)：核磁共振儀，Bniker av-500型，TMS為內(nèi)標(biāo)，以CDC13 或DMSOd為溶劑;紅外光譜儀,Nicolet FIR-360 (美國(guó)Thermo Nicolet公司):圓二色光譜儀,佳司科J-810 ( H 本分光株式會(huì)社)：掃描電鏡,Zeiss Ultra Plus (徳國(guó)卡爾蔡司公司)；旋轉(zhuǎn)粘度訃,NDJ-5S (上海倫捷機(jī)電儀表 有限公司)：循環(huán)水式多用貞空泵，SHZ-III (南京科爾儀器設(shè)備冇限公司)；冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)reeZone 6升復(fù)栓制 冷型(美國(guó)Labconco公司).試劑：L-賴氨酸鹽酸鹽，氯甲酸節(jié)酯(阿拉丁，AR):三光氣(安耐吉化學(xué),A

25、R):硫酸銅，硫化鈉(無(wú)錫亞盛化 E,AR):氫澳酸,硫酸(上海凌峰,AR),其它試劑均為市售分析純.3.2實(shí)驗(yàn)方法3. 2. 1氧按基-L-賴氨酸的合成(e -Z-lys)稱取20g L-賴氨酸(134mmol),適量劇水加熱使之稱解,然后加入16.5g硫酸銅(66mmol).回流2K 然后冰浴條件下，分批加入25g (147niniol)氯甲酸節(jié)酣，任此過(guò)程中，通過(guò)加入碳酸卷鈉保證溶液的PH在89之 間，攪拌過(guò)夜.過(guò)濾.沉淀用履蝕水、乙醇洗滌干燥丿E得到4 1?g (49mmo1)藍(lán)色的N'-茱氧按鬼-匸-賴氨酸銅 鹽絡(luò)介物(I ).收率96%.將中間體(【)加熱分散于蒸懈水中，分

26、批加入NaS,至溶液藍(lán)色消失為止.過(guò)濾除去黑色 的硫化銅沉淀，將濾液的pH值調(diào)至3-5之間，有大屋白色沉淀析出，將沉淀過(guò)濾，乙醇重結(jié)晶，貞空干燥得到25.6g (90inmol)N -Z-lys ( H )產(chǎn)率 65.43%.m.p.： 250-255°C;】H NMR (DMSO,500 MHz)： 6: 7.19-7.37 (nrCSH), 5.0(s;PhCH2,2H), 3.74(t; a -CH) 3.29 (m; e -CH2), 1.72(m;-CH2), 1.30-1.39(m; Y -CH：和 6 -CH:) IR (KBr) v: 3345 cm1 (s; NH/

27、OH)和1691cn/(s：節(jié)氧按堆上的C=O )3. 2.2 N £賴氨酸竣酸用' LysNCA的介成稱取4g(14mmol)II,加入40mlTHF, 55*C水浴下，氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢滴加2g (7mmol)三光氣的THF溶液， Z后繼續(xù)反應(yīng)2h,溶液逐漸變得澄淸透明.Z后繼續(xù)通-段時(shí)間氮?dú)?，以排出多余的光?TLC監(jiān)控反應(yīng)終點(diǎn).然后 適當(dāng)濃縮,加入正己烷使產(chǎn)物析出,過(guò)濾,干燥，得到3.8g(12mmol) Lys(Z)-NCA (III),產(chǎn)率89.7%, nip.： 98-101 *C,】H NMR (CDClj, 500 MHz)： 6: 7.257.36(m:C6H

28、5)629 (s;NH),5.08-5.14(s;PhCH;),4.83(bs;NH), 4.28(t; « -CH),Chin. J. Org. Chem. 2012. 32、xxxx -xxxxhttp:/sioc-7© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE3.17-3.26 (m; £ -CH2), 1.84-1.99(m; P -CH:), 1.26-1.58 (m; Y -CH2 和 6 -CH" IR (K

29、Br) v:3342cm1(s;NH),1856/1837/1813cni1(s;NCA 上的 C=O),1774cm l(s; NCA 上的 N-C=O) , 1689cm 】(s;節(jié)氧琰基上的 C=O)3. 2.3 Lys( Z)-NCA 的聚合將2g (6. 5mmol)NCA溶于1 OOmlDNlF, N2的保護(hù)下，加入引發(fā)劑三乙胺(單體/引發(fā)劑 =1/100),室溫下攪 ft 72h.之汗將溶液倒入大鼠蒸溜水中，靜置，沉淀析出，過(guò)濾，干燥，得到P(NCA) 0 075g(2.04nniol),產(chǎn)率37.53%. 】H NMR (DMS0.500 MHz)： 6: 7.96(s;-NH

30、-Z), 7.27(m:C6H5CH:, 5H). 5.0(s;-CO-CH-NH-),3 58(s; a -CH),2 96(m;-CH:), 1.03-1.38 (m.-(CH2)3 -CH：-NH-Z) IR (KBr)v: 3287cm'1(s;NH).1690cm'1(s;卡氧按基上的 C=0), 1652 cm l(w; I NH2), 1543 cm4(w. IINH2)3. 2.4聚賴氨酸的制備取lg(27nmol)P(NCA)溶于二惡烷和氯仿的混介溶劑中，通入無(wú)水氯化氫，一段時(shí)間后，通入無(wú)水漢化抵，溶液 產(chǎn)生沉淀氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢?h,將反應(yīng)好的溶液倒入冰乙

31、魅中萃取，水柑用鹽酸調(diào)PH到3左右，然后用透 析袋純化24h(vs001MHCl),后進(jìn)行冷凍干燥，得到0.4201g(l 1.46mnol) 色的聚-L 賴氨酸，收率52.51%H NMR (DMS0.500 MHz)： 6: 3.33 (t: a -CH). 2.49-2.77(t. e -CH2), 1.61 (m; P -CH2 fH o-CH2). 1.38(m： Y -CH:) IR (KBr) v: 3278cm4 (s;NH),1653cn/(w; I NH2),1532 cm l(w; IINH：)3. 2.5多聚賴毎酸pH響應(yīng)分析將適最的多聚賴氨酸溶于蒸懈水中，分置三個(gè)棕色

32、瓶中.用鹽酸將其pH值分別調(diào)成酸性，中性、緘杵，首先分 別測(cè)試其関二色光譜.然后用移液槍分別取3mL滴在干凈的玻片衣曲，待其門(mén)然風(fēng)干后，采用掃描電鏡觀測(cè)莫形貌. 最肩將剩下的溶液冷凍干燥，再次采用掃描電鏡觀測(cè)其形貌.致謝：木論文的部分實(shí)驗(yàn)測(cè)試匸作得到J'南京東納牛物科技有限公司的支持，©此表示感謝.輔助材料(Supporting Information)實(shí)驗(yàn)部分介成中間體的核磁、紅外-這些材料可以免費(fèi)從本刊網(wǎng)站 (http:/sioc-Refere nces1 Kito YHiramot S; Miirao M;Hono Y;Miyazaki T:Kodama T:Hakab

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