中藥治療對大鼠坐骨神經(jīng)損傷后mRNANGF表達的影響

1、    中藥治療對大鼠坐骨神經(jīng)損傷后mRNANGF表達的影響            作者：時間：2007-11-22 12:05:00                          &#

2、160;     作者：尹宗生，顧玉東，朱騰芳【摘要】  目的  研究中藥黨參、丹參、黃芪、生地和復(fù)方神肌再生沖劑對大鼠坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生的影響。方法  將大鼠分為黨參組、丹參組、黃芪組、生地組、復(fù)方?jīng)_劑組和對照組，每組大鼠18只。麻醉下暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，在坐骨結(jié)節(jié)遠(yuǎn)側(cè)0.8cm 處造成坐骨神經(jīng)擠壓傷，根據(jù)分組，術(shù)后給予不同的中藥喂養(yǎng)大鼠。術(shù)后不同時間，取緊鄰擠壓傷部位遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)干，應(yīng)用原位雜交的方法和圖像分析處理系統(tǒng)定量測定神經(jīng)組織中神經(jīng)生長因子mRNA（mRNANGF）的表達。結(jié)果  丹參組和黃芪組大鼠坐骨神

3、經(jīng)擠壓傷后第2周起，坐骨神經(jīng)組織中mRNANGF表達明顯增加，至傷后第4周達到高峰。黨參治療坐骨神經(jīng)擠壓傷，治療后8周，mRNANGF表達較對照組明顯增加，差異有顯著性。在復(fù)方?jīng)_劑組，大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后8周內(nèi)，神經(jīng)組織中mRNANGF表達始終處于高水平。各組大鼠坐骨神經(jīng)mRNANGF表達與對照組之間的差異具有顯著性（P0.05）。復(fù)方?jīng)_劑組大鼠坐骨神經(jīng)mRNANGF表達與丹參和黃芪組之間的差異也具有顯著性。結(jié)論  中藥黨參、丹參和黃芪可以促進擠壓傷后大鼠坐骨神經(jīng)mRNANGF表達；這種作用在組成復(fù)方?jīng)_劑后，表現(xiàn)得更為明顯。      

4、;  【關(guān)鍵詞】  中藥；坐骨神經(jīng)損傷；神經(jīng)生長因子mRNA        【Abstract】  Objective  To decide which of Chinese herbs including Dangshen，Danshen，Huangqi and Shengdi has effect on improving the regeneration of peripheral nerve after nerve lesion and to study the mechani

5、sm of Chinese herb.Methods  108 SD rats(male，220250g)were divided into six groups：Dangshen group，Danshen group，Huangqi group，Shengdi group，mixed group and control group.The rats were anaesthetized and the right sciatic nerves were crushed at the site 0.8cm distal to sciatic notch.After surgery

6、the rats were fed with different Chinese herb according to different group.At various time after operation the rat were killed and the sciatic nerve stump just distal to the crush site were removed to evaluate the level of mRNANGF.mRNANGF was expressed by means of in situ hybridization and the level

7、 was determined by imaging analysis.Results  In Danshen and Huangqi groups the levels of mRNANGF in sciatic nerve markedly increased at the second week after surgery.As compared with control group，the levels of mRNANGF in these two groups were greatly higher and the difference are statistically

8、 significant(P0.05).In mixed group the mRNANGF are all in high level compared with control group.At the eighth week after crushed the expression of mRNANGF in Dangshen group was higher than that of control group.Conclusion  Chinese herbs including Danshen，Huangqi，Dangshen and mixed herbs can in

9、crease the expression of mRNANGF of rat sciatic nerve and improve the regeneration of sciatic nerve after nerve crushed.        【Key words】  Chinese herb；sciatic nerve injury；nerve growth factor mRNA        復(fù)方神肌再生沖劑對神經(jīng)再生的促進作用已經(jīng)被實驗研究初步證

10、實1，2。為了研究中藥復(fù)方神肌再生沖劑及其組成成分對神經(jīng)再生的影響，我們曾應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測中藥治療后損傷的大鼠坐骨神經(jīng)組織NGF蛋白表達3。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛躍發(fā)展，運用先進的實驗手段，檢測神經(jīng)生長因子mRNA（mRNANGF）在神經(jīng)組織中的表達來判斷神經(jīng)再生，其敏感度比檢測NGF的方法要高得多。我們應(yīng)用原位分子雜交的方法，研究復(fù)方神肌再生沖劑治療大鼠坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)生長因子（NGF）mRNA（mRNANGF）的變化，確定中藥復(fù)方神肌再生沖劑中對神經(jīng)再生有促進作用的單味中藥。        1  材料與方法&

11、#160;       1.1  動物選擇及分組  SD大鼠，健康，雄性，體重230250g，SPF級。由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物部提供。實驗組90只大鼠分為5個處理組，分別為黨參組、丹參組、黃芪組、生地組和復(fù)方?jīng)_劑組。每處理組18只大鼠再按術(shù)后取材時間分為術(shù)后2周、4周和8周3個時間組，每時間組6只。對照組30只大鼠分為5個時間組，分別為術(shù)后2天、1周、2周、4周和8周，每時間組6只大鼠。        1.2  動物模型制作  1%硫噴妥鈉腹腔

12、注射麻醉。局部脫毛，消毒。取右側(cè)為手術(shù)側(cè)。沿右側(cè)臀大肌纖維方向做右臀及大腿上部皮膚切口，分開臀肌顯露坐骨神經(jīng)。于坐骨結(jié)節(jié)遠(yuǎn)側(cè)0.8cm，坐骨神經(jīng)分出支配大腿肌肉的分支之近側(cè)，用帶卡扣的無齒顯微持針器夾住坐骨神經(jīng)，合攏卡扣30s，造成神經(jīng)擠壓傷（crush）4。在損傷部位用11-0的無損傷縫線固定于神經(jīng)外膜作為標(biāo)記，傷口內(nèi)置適量青霉素粉劑，關(guān)閉切口。        術(shù)后將大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3只。常規(guī)供給大鼠專用飼料和飲用水，室內(nèi)20恒溫。根據(jù)實驗分組，每日給予相應(yīng)的中藥湯劑2ml灌胃。對照組大鼠術(shù)后給等量生理鹽水灌胃。按分組要求，術(shù)后取

13、緊鄰擠壓傷部位遠(yuǎn)側(cè)坐骨神經(jīng)干0.6cm，迅速置入4%多聚甲醛溶液固定。另取正常大鼠6只，取其右側(cè)坐骨神經(jīng)相應(yīng)部位神經(jīng)干，作為正常神經(jīng)標(biāo)本，用以檢測正常神經(jīng)mRNANGF。標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24h后，脫水，石蠟包埋。常規(guī)石蠟切片，厚度為4m。載玻片需要經(jīng)過高溫滅活RNA酶，APES鍍膜。切片置4冰箱保存。        1.3  原位分子雜交實驗方法5及步驟  NGF型原位雜交檢測試劑盒（NGF ISH Detection Kit)由武漢博士德生物工程有限公司提供。核苷酸探針序列如下：  

14、      5GCTGTGATCAGAGTGTAGAACAACATGGAC3        5CCACACGCTGACACTGTCACACACCGAGAA3        5TATCCGGATAAACCGCCAGGCAGCCTGCTT3        參照試劑盒的基本步驟，根據(jù)反復(fù)預(yù)實驗進行修改。每次實驗均設(shè)立陰性對照片（在陰性對照片的組織上不加探針雜交液而代之以0.05M P

15、BS緩沖液）。（1）脫蠟至水。（2）3%H2O2（目的：滅活內(nèi)源性過氧化物酶；用0.02%DEPC水配制）37，10min。（3）暴露核苷酸片段（消化）：胃蛋白酶2滴+3%檸檬酸1ml，混勻，預(yù)熱；將新鮮稀釋的胃蛋白酶滴加在切片的組織上；37，30min；0.5M PBS液洗5min×3次。（4）雜交：將切片上每塊組織加上約10l的寡核苷酸探針雜交液；用適當(dāng)大小的Parafilm(臘膜）覆蓋組織；37，過夜（15h左右）；陰性對照片加0.5M PBS液10l。（5）雜交后洗滌：2×SSC洗5min×3次。（6）穩(wěn)定雜交探針：將雜交探針穩(wěn)定液A和雜交探針穩(wěn)定液B按1

16、19的比例混合；將探針穩(wěn)定液A、B混合后加在切片的組織上；37，4h。（7）穩(wěn)定后洗滌：2×SSC洗5min×3次。（8）滴加封閉液：將封閉液加在組織上，37，20min；甩去多余的封閉液。（9）兔抗地高辛：37，1h；0.5M PBS液洗2min×3次。（10）生物素化羊抗兔IgG：將濃縮的生物素化羊抗兔IgG用0.5M PBS稀釋1倍；37，25min；0.5M PBS液洗2min×3次。（11）SABC-POD：將稀釋的SABC滴加在組織上，37，25min；0.5M PBS液洗2min×4次。（12）DAB顯色：顯色時間：20min，充

17、分水洗。（13）根據(jù)情況，選用蘇木素復(fù)染（一般不復(fù)染），10s，充分水洗。（14）37烤干，中性樹膠封片。（15）觀察結(jié)果：陽性信號呈棕黃色；陰性對照片上無棕黃色陽性信號出現(xiàn)。在復(fù)染的組織片上，可以顯示神經(jīng)纖維的基本結(jié)構(gòu)。棕黃色的陽性信號位于神經(jīng)纖維的周邊，相當(dāng)于神經(jīng)纖維的髓鞘部位。        1.4  圖像分析  應(yīng)用Axioplan2圖像處理系統(tǒng)（Carl Zeiss公司，德國）對原位雜交    的切片進行分析。每個實驗動物取切片6張，每組6個動物共取切片36張，將各

18、指標(biāo)的36個數(shù)據(jù)求出均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，代表某一組動物某一指標(biāo)。在放大400倍高倍視野下，進行分析、記錄并計算以下指標(biāo)：（1）神經(jīng)纖維的總面積（m2）。（2）陽性信號面積（m2）。（3）陽性信號面積/神經(jīng)纖維總面積（%，簡稱“陽性信號面積百分比”）。（4）陽性信號的平均判斷度。（5）平均灰度指數(shù)（average of grey index)：陽性信號面積百分比與平均灰度的乘積。用公式表示為：        平均灰度指數(shù)=陽性信號面積百分比（%）×平均灰度        平

19、均灰度指數(shù)從陽性信號面積占總面積的多少（%）和陽性信號的密度兩個方面全面反映了陽性信號的強弱程度。應(yīng)用平均灰度指數(shù)判斷陽性信號的強弱，比單獨應(yīng)用陽性信號百分比或陽性信號平均灰度（密度）進行信號強弱的判斷要準(zhǔn)確得多。        2  結(jié)果        2.1  形態(tài)學(xué)觀察  應(yīng)用原位分子雜交，DAB顯色，mRNANGF陽性信號在切片上呈散在的、棕黃色斑點狀。在復(fù)染的切片上，神經(jīng)的其他結(jié)構(gòu)可以顯示，陽性信號位于神經(jīng)纖維鞘的部位；軸索和雪旺細(xì)胞核

20、的部位則沒有陽性信號。陽性信號的強弱與mRNANGF表達的量有關(guān)。        2.2  正常坐骨神經(jīng)mRNANGF表達及損傷后表達的改變  （1）正常坐骨神經(jīng)的mRNANGF表達：取6只正常大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)相應(yīng)部位神經(jīng)干，檢測神經(jīng)組織mRNANGF含量。圖像分析結(jié)果：正常坐骨神經(jīng)的mRNANGF表達量極低，平均灰度指數(shù)為141.27±35.43。（2）損傷后坐骨神經(jīng)mRNANGF表達的變化：坐骨神經(jīng)擠壓傷后，神經(jīng)組織mRNANGF的表達明顯增高，見表1。表1  損傷后坐骨神經(jīng)mRNANGF表

21、達  （x±s） 0 " align=baseline border=0>    損傷后2天，坐骨神經(jīng)mRNANGF的表達迅速增加，并持續(xù)上升，至傷后7天達到一個小的高峰；7天2周間，mRNANGF的表達出現(xiàn)了一個輕度回落趨勢，但2周后又繼續(xù)升高，于第4周達到最高峰，以后逐漸下降。        2.3  不同中藥的應(yīng)用對損傷后坐骨神經(jīng)mRNANGF表達的影響          中

22、藥治療后2周坐骨神經(jīng)mRNANGF表達  見表2。表2  中藥治療后2周坐骨神經(jīng)mRNANGF表達  （x±s） 0 " align=baseline border=0>注：與對照組比較，差異有顯著性，*t=4.51，P0.001；*t=4.09，P0.001；t=2.69，PP0.05）。          中藥治療后4周坐骨神經(jīng)mRNANGF表達  第2周第4周，復(fù)方?jīng)_劑組坐骨神經(jīng)mRNANGF的表達繼續(xù)增加，至第4周達到最高峰；平均灰度指數(shù)為5

23、2 69.41±438.61，與對照之間的差異具有顯著性（t=2.78，P=0.02）。其他各組與對照組之間的差異均無顯著性。見表3。表3  中藥治療后4周坐骨神經(jīng)mRNANGF表達  （x±s） 0 " align=baseline border=0>注：與對照組比較差異具有顯著性，*t=2.78 P=0.02          中藥治療后第8周坐骨神經(jīng)mRNANGF表達  中藥治療后第2周第4周，丹參組和黃芪組坐骨神經(jīng)mRNANGF表達持續(xù)在一個